本发明涉及血浆中维生素的检测方法技术领域，具体是指一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中水溶性和脂溶性维生素的方法。
背景技术：
目前测定维生素的方法主要有生物法和化学法。生物法包括酶联免疫吸附(elisa)、放射免疫测定(ria)、免疫化学发光分析(icma)等，化学法包括气相色谱-质谱法(gc-ms、gc-ms/ms)和液相色谱-质谱法(lc-ms/ms)。
免疫方法曾被当做维生素的检测方法，但是多种脂溶性维生素以及多种水溶性维生素在结构上具有高度的相似性，因此，使用免疫测定法很难控制或排除生物基质中可能存在的结构相似物的干扰。其次，免疫检测方法是建立在抗体对抗原分子识别的基础上，而人体内脂溶性维生素以及水溶性维生素结构相似，免疫检测技术的特异性抗体的交叉反应的专一性差，易出现假阳性结果。第三，并不是所有的目标维生素都存在相应的抗血清以得到准确的免疫测定，最后，免疫检测一次只能分析一种被测物，因此测定脂溶性维生素谱或者水溶性维生素谱就需要多次测定。
近年来，质谱技术已发展成为分析内源性代谢物和药物的高通量定量方法，通过与气相色谱(gc)或高效液相色谱(hplc)联用，可以快速准确地分离多种化合物，并且能在一定程度上完成自动化分析。色谱-质谱联用检测技术是当前的发展趋势，也是目前最为可靠的维生素检测方法，同时可验证其他测定方法的准确性，并鉴定未知物质的结构等。气相色谱-质谱技术检测，要求被测组分具有挥发性、低沸点等，因此在检测前需要对样品进行衍生化，以提高脂溶性维生素和水溶性维生素的挥发性和热稳定性，该方法的缺点是样品处理过程繁琐，色谱分析时间较长。lc-ms/ms用于内源性脂溶性维生素以及水溶性维生素检测通常不需要繁琐的衍生化步骤，避免了衍生化步骤中副反应或反应不完全造成的损失，同时大大减少了样品和试剂的损耗、缩短了前处理的时间。与hplc相比，超高效液相色谱(uplc)，运用亚二微米的小粒径填料可以增加分离度、灵敏度，同时可以得到更短的分离时间。因此，超高效液相色谱串联质谱技术(uplc-ms/ms)在多种维生素同时检测中具有较强的优势。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服以上技术缺陷，提供一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中水溶性和脂溶性维生素的方法，有效去除大部分的干扰物质，可以同时检测和快速提取多种水溶性维生素以及脂溶性维生素。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中水溶性维生素的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品前处理：
200μl血浆或标准品 20μl内标溶液 600μl甲醇，涡旋混匀10s，13000g离心5min，取600μl上清氮气吹干，加100μl水复溶接匀，取10μl进样分析；
步骤二：分离检测：
根据水溶性维生素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，所述液相色谱条件包括：
所述的质谱检测条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描，并选择目标定量母子离子对；
质谱离子源参数包括：气体：脱溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，毛细管电压：1.5kv，采样锥孔电压：150v，碰撞能量(collisionenergy,ce)：15～60v，脱溶剂气流速：1000l/h，锥孔反吹气：150l/h，脱溶剂气温度：500℃；
步骤三：定性判断和定量分析：
根据目标水溶性维生素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标水溶性维生素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断水溶性维生素是否存在于血浆样品中；
应用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对样品进行定性分析：在相同实验条件下，样品中待测目标物的色谱保留时间与标准品溶液中相应物质的色谱保留时间一致；样品总离子流色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过规定范围，则可以判断样品中存在相应的目标化合物；
采用同位素内标定量法，以水溶性维生素与其内标物的峰面积比值计算样品中的水溶性维生素的含量。
优选的，步骤一中标准品和内标溶液都用10％饱和vc 10ug/ml亚硫酸氢钠配制备。
一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中脂溶性维生素的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品前处理：
200μl血浆或标准品加入10μl内标，涡旋振荡2min，加入400μl乙腈，涡旋振荡2min，加入200μl超纯水，涡旋振荡2min，10000g离心5min，取700μl上清上样；
primehlbμelution96孔板：200μl甲醇活化，200μl水平衡，上样后，200μl25％超纯水冲洗，200μl25％乙腈冲洗，重复两次50μl乙腈洗脱至96孔板，最后再加入20μl超纯水到96孔板，涡旋振荡1min，直接lc-ms/ms进样分析；
步骤二：分离检测：
根据脂溶性维生素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，所述液相色谱条件包括：
所述的质谱检测条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描，并选择目标定量母子离子对；
质谱离子源参数包括：气体：脱溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，毛细管电压：2kv，采样锥孔电压：150v，碰撞能量(collisionenergy,ce)：15～60v，脱溶剂气流速：1000l/h，锥孔反吹气：150l/h，脱溶剂气温度：500℃；
步骤三：定性判断和定量分析：
根据目标脂溶性维生素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标脂溶性维生素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断脂溶性维生素是否存在于血浆样品中；
应用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对样品进行定性分析：在相同实验条件下，样品中待测目标物的色谱保留时间与标准品溶液中相应物质的色谱保留时间一致；样品总离子流色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过规定范围，则可以判断样品中存在相应的目标化合物；
采用同位素内标定量法，以脂溶性维生素与其内标物的峰面积比值计算样品中的脂溶性维生素的含量。
优选的，步骤一中标准品和内标溶液都用10％饱和vc 10ug/ml亚硫酸氢钠配制备。
本发明与现有技术相比的优点在于：选择蛋白沉淀与固相萃取法结合，简单快捷的同时萃取富集出多种脂溶性维生素或者多种水溶性维生素，极大程度的排除了大分子蛋白质、小分子蛋白、多肽、以及一些小分子物质的干扰；此外，选择了合适的流动相组成、梯度洗脱条件及色谱柱，使目标激素类物质与血浆中其它物质得到有效的色谱分离。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明公开一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中水溶性维生素的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品前处理：
200μl血浆或标准品 20μl内标溶液 600μl甲醇，涡旋混匀10s，13000g离心5min，取600μl上清氮气吹干，加100μl水复溶接匀，取10μl进样分析；
步骤二：分离检测：
根据水溶性维生素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，所述液相色谱条件包括：
梯度洗脱条件如下：
所述的质谱检测条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描，并选择目标定量母子离子对；
目标定量母子离子对包括：
为了消除液质分析中的基质效应的影响，选择合适的制备方法是最有效的，本研究选择了蛋白沉淀与固相萃取法结合，简单快捷的同时萃取富集出8种水溶性维生素(维生素b1、维生素b2、维生素b3、维生素b5、维生素b6、维生素b7、维生素b9、四氢叶酸)，极大程度的排除了大分子蛋白质、小分子蛋白、多肽、以及一些小分子物质的干扰；此外，改善色谱分析条件也是最重要的排除基质效应的方法，本研究选择了合适的流动相组成、梯度洗脱条件及色谱柱，使目标激素类物质与血浆中其它物质得到有效的色谱分离。
为了得到、稳定、可靠的高灵敏度目标化合物信号，设置锥孔电压和碰撞能量的“ramp”范围，选择不同mrm离子对并针对高丰度离子对的锥孔电压和碰撞能量进行优化，从优化的谱图中可以得出离子最高信号强度所对应的的最佳质谱参数。其它质谱参数则根据仪器提供的参考值范围选择合适的值，以保证较强的信号强度。
质谱离子源参数包括：气体：脱溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，毛细管电压：1.5kv，采样锥孔电压：150v，碰撞能量(collisionenergy,ce)：15～60v，脱溶剂气流速：1000l/h，锥孔反吹气：150l/h，脱溶剂气温度：500℃；
步骤三：定性判断和定量分析：
根据目标水溶性维生素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标水溶性维生素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断水溶性维生素是否存在于血浆样品中；
应用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对样品进行定性分析：在相同实验条件下，样品中待测目标物的色谱保留时间与标准品溶液中相应物质的色谱保留时间一致；样品总离子流色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过规定范围，则可以判断样品中存在相应的目标化合物；
采用同位素内标定量法，以水溶性维生素与其内标物的峰面积比值计算样品中的水溶性维生素的含量。
步骤一中标准品和内标溶液都用10％饱和vc 10ug/ml亚硫酸氢钠配制备。
实施例2：
一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中脂溶性维生素的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品前处理：
200μl血浆或标准品加入10μl内标，涡旋振荡2min，加入400μl乙腈，涡旋振荡2min，加入200μl超纯水，涡旋振荡2min，10000g离心5min，取700μl上清上样；
primehlbμelution96孔板：200μl甲醇活化，200μl水平衡，上样后，200μl25％超纯水冲洗，200μl25％乙腈冲洗，重复两次50μl乙腈洗脱至96孔板，最后再加入20μl超纯水到96孔板，涡旋振荡1min，直接lc-ms/ms进样分析；
此步骤是对血浆样品的前处理，针对脂溶性维生素类化合物脂溶性的特点，采用固相萃取技术富集血浆中的目标脂溶性维生素。血浆中的脂溶性维生素存在形式有游离的，也有与蛋白结合的。本发明实施例的前处理步骤中，样品经过蛋白沉淀释放出脂溶性维生素并同时萃取脂溶性维生素，通过固相萃取，可以从血浆中进一步去除一些小分子化合物以及低分子蛋白和多肽，从而起到富集脂溶性维生素去除大量基质干扰物的目的。
步骤二：分离检测：
根据脂溶性维生素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，所述液相色谱条件包括：
梯度洗脱条件如下：
所述的质谱检测条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描，并选择目标定量母子离子对；
目标定量母子离子对包括：
为了消除液质分析中的基质效应的影响，选择合适的制备方法是最有效的，本研究选择了蛋白沉淀与固相萃取法结合，简单快捷的同时萃取富集出5种脂溶性维生素(维生素a、维生素d2、维生素d3、维生素e、维生素k1)，极大程度的排除了大分子蛋白质、小分子蛋白、多肽、以及一些小分子物质的干扰；此外，改善色谱分析条件也是最重要的排除基质效应的方法，本研究选择了合适的流动相组成、梯度洗脱条件及色谱柱，使目标激素类物质与血浆中其它物质得到有效的色谱分离。
为了得到、稳定、可靠的高灵敏度目标化合物信号，设置锥孔电压和碰撞能量的“ramp”范围，选择不同mrm离子对并针对高丰度离子对的锥孔电压和碰撞能量进行优化，从优化的谱图中可以得出离子最高信号强度所对应的的最佳质谱参数。其它质谱参数则根据仪器提供的参考值范围选择合适的值，以保证较强的信号强度。
质谱离子源参数包括：气体：脱溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，毛细管电压：2kv，采样锥孔电压：150v，碰撞能量(collisionenergy,ce)：15～60v，脱溶剂气流速：1000l/h，锥孔反吹气：150l/h，脱溶剂气温度：500℃；
步骤三：定性判断和定量分析：
根据目标脂溶性维生素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标脂溶性维生素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断脂溶性维生素是否存在于血浆样品中；
应用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对样品进行定性分析：在相同实验条件下，样品中待测目标物的色谱保留时间与标准品溶液中相应物质的色谱保留时间一致；样品总离子流色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过规定范围，则可以判断样品中存在相应的目标化合物；
采用同位素内标定量法，以脂溶性维生素与其内标物的峰面积比值计算样品中的脂溶性维生素的含量。
步骤一中标准品和内标溶液都用10％饱和vc 10ug/ml亚硫酸氢钠配制备。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
1.一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中水溶性维生素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：样品前处理：
200μl血浆或标准品 20μl内标溶液 600μl甲醇，涡旋混匀10s，13000g离心5min，取600μl上清氮气吹干，加100μl水复溶接匀，取10μl进样分析；
步骤二：分离检测：
根据水溶性维生素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，所述液相色谱条件包括：acquity
所述的质谱检测条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描，并选择目标定量母子离子对；
质谱离子源参数包括：气体：脱溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，毛细管电压：1.5kv，采样锥孔电压：150v，碰撞能量(collisionenergy,ce)：15～60v，脱溶剂气流速：1000l/h，锥孔反吹气：150l/h，脱溶剂气温度：500℃；
步骤三：定性判断和定量分析：
根据目标水溶性维生素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标水溶性维生素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断水溶性维生素是否存在于血浆样品中；
应用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对样品进行定性分析：在相同实验条件下，样品中待测目标物的色谱保留时间与标准品溶液中相应物质的色谱保留时间一致；样品总离子流色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过规定范围，则可以判断样品中存在相应的目标化合物；
采用同位素内标定量法，以水溶性维生素与其内标物的峰面积比值计算样品中的水溶性维生素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中水溶性维生素的方法，其特征在于：步骤一中标准品和内标溶液都用10％饱和vc 10ug/ml亚硫酸氢钠配制备。
3.一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中脂溶性维生素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：样品前处理：
200μl血浆或标准品加入10μl内标，涡旋振荡2min，加入400μl乙腈，涡旋振荡2min，加入200μl超纯水，涡旋振荡2min，10000g离心5min，取700μl上清上样；
primehlbμelution96孔板：200μl甲醇活化，200μl水平衡，上样后，200μl25％超纯水冲洗，200μl25％乙腈冲洗，重复两次50μl乙腈洗脱至96孔板，最后再加入20μl超纯水到96孔板，涡旋振荡1min，直接lc-ms/ms进样分析；
步骤二：分离检测：
根据脂溶性维生素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，所述液相色谱条件包括：
所述的质谱检测条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描，并选择目标定量母子离子对；
质谱离子源参数包括：气体：脱溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，毛细管电压：2kv，采样锥孔电压：150v，碰撞能量(collisionenergy,ce)：15～60v，脱溶剂气流速：1000l/h，锥孔反吹气：150l/h，脱溶剂气温度：500℃；
步骤三：定性判断和定量分析：
根据目标脂溶性维生素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标脂溶性维生素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断脂溶性维生素是否存在于血浆样品中；
应用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对样品进行定性分析：在相同实验条件下，样品中待测目标物的色谱保留时间与标准品溶液中相应物质的色谱保留时间一致；样品总离子流色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过规定范围，则可以判断样品中存在相应的目标化合物；
采用同位素内标定量法，以脂溶性维生素与其内标物的峰面积比值计算样品中的脂溶性维生素的含量。
4.根据权利要求3所述的一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中脂溶性维生素的方法，其特征在于：步骤一中标准品和内标溶液都用10％饱和vc 10ug/ml亚硫酸氢钠配制备。
技术总结