本发明属于食品安全
技术领域：
，涉及一种蜂蜜中甘露糖的超高效液相色谱检测方法。
背景技术：
：甘露糖是一种还原性单糖。天然蜂蜜中甘露糖含量是极低的(德国qsi认为天然蜂蜜中不存在甘露糖)，当蜂蜜中甘露糖含量检测超过500mg/kg时，就被认为是添加了非法添加物。非法添加物主要是果葡糖浆。果葡糖浆在生产过程中要经过阴阳离子交换柱脱盐或去杂，葡萄糖、果糖和甘露糖在碱性条件下可以通过烯醇式结构变化进行相互转化。一般果葡糖浆中甘露糖含量范围从几百到几千不等，而且糖浆生产过程要将果葡糖浆中的甘露糖去掉极具技术难度。目前国外一般采用nmr技术鉴定蜂蜜的真实性并同时给出甘露糖含量。测定糖含量一般采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法或示差检测器法，在国内尚未见蜂蜜中甘露糖含量的检测方法报告。因此，研究一种低检测限，稳定可靠的检测方法对于鉴别蜂蜜是否掺加了果葡糖浆很有意义。中国蜂蜜产量和出口量一直位居世界前列。近年，我国蜂蜜产量保持在30-40万吨左右，约20％～25％出口；蜂王浆产量约3500吨，出口量约为30％～40％；年产500吨蜂胶产品基本用于内销。2011年至2016年间蜂蜜产量年均增长率约为6.6％，远高于同期世界蜂蜜产量3％的年均增长率。作为天然的保健产品，市场前景广阔，在国际市场需求量旺盛，随着国内生活水品的提升以及庞大的市场，国内市场也具有这极大的潜力。此外蜂蜜适应不同年龄的人食用，尤其对老人儿童更有益处，长期食用对呼吸系统、胃肠道、糖尿病等具有明显的保健作用。当前国内蜂蜜产业相对国际标准而言仍处于蜂产品"粗加工"的发展阶段，对于技术成熟的蜂蜜企业这里存在巨大的商机，产区正是其中广阔的发展空间。目前，我国对食品质量安全越来越重视。国家对产品的假冒伪劣处罚力度也越来越大。蜂产品中的掺假问题也越来越被各方面所关注。如何识别蜂蜜掺假，也引起了越来越多消费者的兴趣。蜂蜜掺假的检测将会成为市场对蜂蜜质量监管的主要手段。新的蜂蜜国家食品安全标准也再次将蜂蜜的真实性要求进行了要求，这也为蜂蜜质量的市场监管提供了依据。现在蜂蜜真实性检测的方法很多，但是各有优缺点。作为目前主要被使用的果葡糖浆，因为其加工技术所限，其中的甘露糖含量是不容易被目前的技术所去除的，这决定了蜂蜜外源性甘露糖检测会在未来的市场监管中占有一席之地。目前检测方法有酶活检测法、同工酶检测法、差示扫描热量法、电子舌技术、显微镜检技术、质谱法、色谱法、光谱法等。酶活检测法以及同工酶检测法检测的是外源性淀粉酶，差示热量扫描法、电子舌技术、质谱法、色谱法和光谱法检测的是蜂蜜中是否掺有果葡糖浆或掺加果葡糖浆含量。在以上研究方法中，薄层色谱法检测高果糖淀粉糖浆以及稳定碳同位素比率法测定碳4植物糖，液相色谱-串联质谱测定糖浆特征物质已经被制定成国家标准用于蜂蜜真实性检测。蜂蜜中的甘露糖含量非常低，远低于500mg/kg。蜂蜜中甘露糖含量如果接近500mg/kg，则表明存在外源性甘露糖。甘露糖是单糖，其结构在碱性条件下可以和葡萄糖、果糖相互转化。由于果葡糖浆生产过程需要经过离子交换树脂的处理，不可避免地会产生甘露糖，而且果葡糖浆中的甘露糖不容易通过加工技术去除掉，因此，通过检测蜂蜜中的甘露糖含量可以准确地鉴别是否添加了果葡糖浆。技术实现要素：为解决上述技术问题，提供一种检测蜂蜜中甘露糖的超高效液相色谱分析方法，能够有效检测出蜂蜜中的甘露糖的含量，具有很好的灵敏度，并能够通过蜂蜜中的甘露糖的含量鉴别该蜂蜜是否掺假。本发明的技术方案是：一种蜂蜜中甘露糖的超高效液相色谱检测方法，所述方法包括以下步骤：s1：线性方程及标准品色谱图：配置标准工作液：浓度为50mg/l，100mg/l，200mg/l，300mg/l，400mg/l，标准工作液进行超高效液相色谱条件检测测定，外标法定量，以峰面积y为纵坐标，浓度x为横坐标进行拟合得到标准曲线；s2：样品前处理：称取蜂蜜样品，加水提取，提取原液用水定容；从容量瓶中移取提取原液于容量瓶中，加乙腈定容，过滤膜，待测；s3：经步骤s2预处理后的样品进行超高效液相色谱条件检测，保留时间定性，外标法定量；完成蜂蜜中甘露糖的检测。优选地，所述方法中，超高效液相色谱条件为：1)仪器：超高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器；2)标准物质：甘露糖，纯度99.6％；3)填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；4)流动相：流动相a为0.2％eta(三乙胺)乙腈溶液，流动相b为水，流动相a与流动相b以84:16的比例离线混合；5)蒸发光检测器参数：增益：200；漂移管温度：65℃；载气压力：30psi；6)柱温：35℃；7)流速：0.3ml/min9)进样量：3μl；9)洗脱程序；等度洗脱。进一步优选地，所述超高效液相色谱采用的色谱柱为：watersacquitybehamide：粒径1.7μm，内径2.1，柱长100mm；进一步优选地，所述步骤s1中标准曲线为：y＝3.3327ln(x) 1.4435，甘露糖的保留时间为3.383min。进一步优选地，所述步骤s1中标准工作液采用标准储备液配置，标准储备液配置方法为称取145.27mg甘露糖标准物质，用水定容至25ml，标准储备液浓度为5787.6mg/l。进一步优选地，所述步骤s2中，提取方法为：35-55℃超声提取25-35min。进一步优选地，述步骤s2具体方法为，称取蜂蜜样品2.0g于50ml离心管中，加水30ml，45℃超声提取30min，提取液转移至50ml容量瓶中，用水定容至刻度；从容量瓶中准确移取5ml提取液于10ml容量瓶中，加乙腈定容至刻度，过0.22μm滤膜。进一步优选地，所述步骤s2中：蒸发光检测器条件：增益：200；漂移管温度：65℃；载气压力：30psi。本发明有益效果：1、由于天然蜂蜜中几乎不含有甘露糖，因此直接用掺有50％f55型大米糖浆的天然蜂蜜作为被检样，分别用四种方法检测其中甘露糖含量来对检测方法进行筛选。从方法检测限，仪器检测时间(仪器检测一个样品所需时间)，试验重复性，前处理稳定性等方面对四种方法进行对比与评价。高效液相色谱仪-示差折光检测法因检测限过高达不到检测要求；高效液相色谱法-柱前衍生紫外法有一个柱前衍生过程，使试验重复性降低，并且加大了前处理难度；离子色谱法与超高效液相色谱-蒸发光散射检测器法在方法检测限和试验重复性都满足条件，超高效液相色谱-蒸发光散射检测器法检测更快，效率更高，重复性更好，因此是比较理想的检测方法。2、本发明能够有效检测出蜂蜜中的甘露糖的含量，具有很好的灵敏度，检出限可达0.05g/100g。3、本方法能够通过蜂蜜中的甘露糖的含量鉴别该蜂蜜是否掺假，填补了国内此类检测方法的空白。4、本方法简便易行，准确度和精密度均较高，加标回收率可达96.4％-99.4％，rsd为1.1％。附图说明图1为五种常见糖类的高效液相色谱分离图谱；图2为甘露糖系列标准溶液标准曲线；图3为甘露糖加标回收及重复性测试图谱；具体实施方式本发明将通过以下实施例作进一步说明。实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记录内容相似或均等的方法及材料皆可用于本发明中，文中所述的较佳实施方法仅作示范之用。实施例1一种蜂蜜中甘露糖的超高效液相色谱检测方法，所述方法包括：1、仪器与试剂超高效液相色谱仪；美国waters-i-classuplc配蒸发光散射检测器检测；标准物质：甘露糖，纯度99.6％乙腈：色谱纯；三乙胺：色谱纯；本方法中所用水均为一级水。2、液相色谱条件：色谱柱：watersacquitybehamide1.7μm2.3×100mm流动相：0.2％eta乙腈溶液 水＝84 16蒸发光检测器条件：增益：200；漂移管温度：65℃；载气压力：30psi；柱温：35℃流速：0.3ml/min进样体积：3μl3、线性方程及标准品色谱图标准储备液配置：称取145.27mg甘露糖标准物质，用水定容至25ml，标准储备液浓度为5787.6mg/l。用上述标准储备液配置标准工作液：浓度为50mg/l,100mg/l,200mg/l,300mg/l,400mg/l。再上述色谱条件下进行测定，外标法定量。以峰面积y为纵坐标，浓度x为横坐标进行log-log对数拟合标准曲线，结果如表1。表1甘露糖保留时间，回归方程及线性相关系数化合物保留时间(min)回归方程相关系数甘露糖3.383y＝3.3327ln(x) 1.44350.9977844、样品前处理方法提取：称取蜂蜜样品2.0g(精确至0.001g)于50ml离心管中，加水30ml，45℃超声提取30min,提取液转移至50ml容量瓶中，用水定容至刻度；从容量瓶中准确移取5ml提取液于10ml容量瓶中，加乙腈定容至刻度，过0.22μm滤膜，待测。5、重复性实验称取6份空白基质样品，加标后按4所述前处理方法处理样品，按2所述超高效液相色谱条件检测，保留时间定性，外标法定量，实验结果甘露糖含量见表2，具体加标回收谱图见图3。表2重复性和加标回收实验结果加标量50mg，样品中加标回收率再96.4％-99.4％，rsd为1.1％。6、该方法检出限：甘露糖检出限为0.05g/100g。本发明在搜集的相关标准及文献资料基础上开始建立了高效液相色谱仪-示差折光检测法、超高效液相色谱-蒸发光散射检测器法、离子色谱法以及高效液相色谱法-紫外法四种检测甘露糖的仪器方法，其条件与参数如下：a.离子色谱法：表3仪器离子色谱仪(配备电化学检测器)色谱柱dionexcarbopacmai阴离子交换柱(4mm×250mm)流动相500mmol/l氢氧化钠溶液柱温35℃流动相流速0.5ml/min标准曲线方程y＝5.6564x 0.0371r2＝0.9997仪器检出限0.8mg/lb.高效液相色谱法-柱前衍生紫外法表4仪器岛津hplc(配备紫外检测器)衍生试剂0.5mol/l1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液色谱柱岛津odsc18色谱柱(250mm×4.6mm)流动相乙腈-20mmol/l乙酸铵溶液(80 20)柱温35℃流动相流速1.0ml/min标准曲线方程y＝48.223x 0.0191r2＝0.9991仪器检出限1.5mg/lc.高效液相色谱仪-示差折光检测法表5仪器岛津hplc(配备示差折光检测器)色谱柱watersnh2氨基色谱柱(4.6mm×250mm)流动相乙腈-水(75 25)柱温35℃流动相流速1.0ml/min检测器温度35℃标准曲线方程y＝1033.99x 6.1910r2＝0.9989仪器检出限125mg/ld.超高效液相色谱-蒸发光散射检测器法表6通过对比试验确定了基本的前处理方法：精确称取样品(精确至1mg)加水溶解，超声提取30min，离心，waterssep-pak固相萃取柱净化，过0.22μm滤膜，上机(或衍生后过膜上机)。由于天然蜂蜜中几乎不含有甘露糖，因此直接用掺有50％f55型大米糖浆的天然蜂蜜作为被检样，分别用四种方法检测其中甘露糖含量来对检测方法进行筛选。依据实验室目前的条件，从方法检测限，仪器检测时间(仪器检测一个样品所需时间)，试验重复性(10次重复试验rsd)，前处理稳定性等方面对四种方法进行对比与评价。表7综合考虑上述各因素，高效液相色谱仪-示差折光检测法因检测限过高达不到检测要求；高效液相色谱法-柱前衍生紫外法有一个柱前衍生过程，使试验重复性降低，并且加大了前处理难度；离子色谱法与超高效液相色谱-蒸发光散射检测器法在方法检测限和试验重复性都满足条件，但是超高效液相色谱-蒸发光散射检测器法检测更快，效率更高，重复性更好，因此是比较理想的检测方法。应用本发明超高效液相色谱-蒸发光散射检测器法对比检测市面上一款天然蜂蜜与掺入10％f55型大米糖浆的该天然蜂蜜，检测结果分别为：a,天然蜂蜜甘露糖含量为未检出；b.掺入10％f55型大米糖浆的天然蜂蜜甘露糖含量为0.16％,其差值大于该方法的检测限。结果表明超高效液相色谱-蒸发光散射检测器法基本上能识别出掺入f55型大米糖浆量大于10％的蜂蜜产品，能满足对市场掺假蜂蜜的检测需求。以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种蜂蜜中甘露糖的超高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
s1：线性方程及标准品色谱图：配置标准工作液：浓度为50mg/l，100mg/l，200mg/l，300mg/l，400mg/l，标准工作液进行超高效液相色谱条件检测测定，外标法定量，以峰面积y为纵坐标，浓度x为横坐标进行拟合得到标准曲线；
s2：样品前处理：称取蜂蜜样品，加水提取，提取原液用水定容；从容量瓶中移取提取原液于容量瓶中，加乙腈定容，过滤膜，待测；
s3：经步骤s2预处理后的样品进行超高效液相色谱条件检测，保留时间定性，外标法定量；
完成蜂蜜中甘露糖的检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，超高效液相色谱条件为：
1）仪器：超高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器；
2）标准物质：甘露糖，纯度99.6%；
3）填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；
4）流动相：流动相a为0.2%eta乙腈溶液，流动相b为水，流动相a与流动相b以84:16的比例离线混合；
5）蒸发光检测器参数：增益：200；漂移管温度：65℃；载气压力：30psi;
6）柱温：35℃；
7）流速：0.3ml/min
8）进样量：3μl；
9）洗脱程序；等度洗脱。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述超高效液相色谱采用的色谱柱为：watersacquityuplc®behamide：粒径1.7μm，内径2.3mm，柱长75mm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤s1中标准曲线为：y=3.3327ln(x) 1.4435，甘露糖的保留时间为3.383min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤s1中标准工作液采用标准储备液配置，标准储备液配置方法为称取145.27mg甘露糖标准物质，用水定容至25ml，标准储备液浓度为5787.6mg/l。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤s2中，提取方法为：35-55℃超声提取25-35min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤s2具体方法为，称取蜂蜜样品2.0g于50ml离心管中，加水30ml，45℃超声提取30min，提取液转移至50ml容量瓶中，用水定容至刻度；从容量瓶中准确移取5ml提取液于10ml容量瓶中，加乙腈定容至刻度，过0.22μm滤膜。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤s2中：蒸发光检测器条件：增益：200；漂移管温度：65℃；载气压力：30psi。
技术总结本发明涉及一种检测蜂蜜中甘露糖的超高效液相色谱分析方法，所述方法包括：线性方程及标准品色谱图，样品前处理，经预处理后的样品进行超高效液相色谱条件检测。本发明能够有效检测出蜂蜜中的甘露糖的含量，具有很好的灵敏度，并能够通过蜂蜜中的甘露糖的含量鉴别该蜂蜜是否掺假。
技术研发人员：鲍德艳;刘翼;李媛;张晚梅;沈蒙;田贡洲;刘丹丹;肖建红;王榕;李莎
受保护的技术使用者：华测检测认证集团湖北有限责任公司
技术研发日：2020.11.04
技术公布日：2021.03.12
