本公开涉及指纹图谱技术领域，具体提供一种灵芝各指标检测方法及真伪鉴定方法。
背景技术：
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
灵芝(ganodermalucidum)古称瑞草，始载于《神农本草经》，是我国传统的扶正固本、滋补强壮的名贵中药，兼具食用和药用两种功能。灵芝多糖(ganodermalucidumpolysaccharides)是灵芝的主要功效成分之一，具有降血脂、降血糖、抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗肿瘤、提高免疫力等多种活性。同时也是《中国药典》一部灵芝药材的主要质量控制指标。多糖是由单糖通过糖苷键结合而成，其药理作用不仅与多糖的组成和含量有关，还与单糖间的连接方式、连接顺序等结构特征和理化性质等有关。
近年来，灵芝及其提取物在中草药、保健品及食品领域的应用越来越大，造成其混淆品滥用和掺假现象时有发生。现有技术中提供了好几种灵芝的鉴定方法，包括测定dna的生物鉴定方法，但该方法鉴定成本较高，现有技术中低成本鉴定方法主要包括指纹图谱法，但发明人发现，现有技术中的指纹图谱法主要是将灵芝中的主要成分进行提取，鉴定，然后与数据库中的标准图谱进行比对，从而鉴定灵芝真伪。但灵芝种类较多，且灵芝作为真菌类的一种，也有很多与其类似的菌种，某些成分存在一致性情况，因此在实际判断过程中可能出现偏差。
另外，发明人发现，现有的针对灵芝多糖的含量测定方法不能全面反应灵芝药材的质量，具有片面性。因此，开展灵芝多糖的专属性、整体质量评价方法研究具有重要现实意义。
技术实现要素：
针对现有技术中指纹图谱鉴定灵芝真伪的方法误差较大，以及对于灵芝药材中多糖含量鉴定方法存在片面性问题。
本公开一个或一些实施方式中，提供一种灵芝各指标检测方法，包括如下步骤：对灵芝中总多糖含量进行鉴定，然后将总多糖分解为低聚糖和几种单糖，所述几种单糖分别为鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，并采用hilic-电喷雾质谱法建立低聚糖和几种单糖的指纹图谱。
本公开一个或一些实施方式中，提供一种灵芝真伪鉴定方法，将上述灵芝各指标检测方法得到的总多糖含量、指纹图谱录入数据库，将待测物按照上述灵芝各指标检测方法进行处理，将待测物总多糖含量、指纹图谱与数据库中的数值进行比较。
上述技术方案中的一个或一些技术方案具有如下优点或有益效果：
1)本公开发展了基于亲水色谱-电喷雾式检测器/电喷雾质谱技术(hilic-cad-esi-ms)的灵芝多糖分析表征方法，并结合单糖组成、特征指纹图谱及统计学分析用于赤灵芝及混淆品(如：平盖灵芝)的区分研究，提高了灵芝多糖的真伪鉴别及质量评价的准确度。
2)对不同品种灵芝中多糖的含量进行分析比较，结果表明：平盖灵芝的多糖含量高于赤芝的多糖含量。赤灵芝和平盖灵芝多糖均由岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，但其单糖含量和比例存在一定差异。建立了灵芝多糖部分酸水解物的特征指纹图谱，结合相似度分析和聚类分析，可以实现赤灵芝和其混淆品(平盖灵芝)的正确区分。
3)本公开将分解后的低聚糖与单糖分别进行研究，建立各自指纹图谱，由于灵芝多糖的低聚糖构型区别较大，因此从不同位置分解单糖后剩余的多糖也不相同，因此本公开加入了对多糖组分的测定，即从整体上反映，又对组分进行测定，以宏观与微观相结合的方式，避免了灵芝多糖含量检测的片面性，进一步提高灵芝多糖真伪鉴别的准确度。
附图说明
构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为现有技术中不同品种灵芝单糖含量对比。
图2为实施例2中对照品(a)和灵芝样品(b)的hplc-cad色谱图，其中，3.鼠李糖；4.岩藻糖；5,10.阿拉伯糖；6,7.木糖；13.甘露糖；14,16.葡萄糖；15,17.半乳糖。
图3为实施例2中不同批次灵芝多糖的hplc指纹图谱。
图4为实施例2中灵芝、黄芪、何首乌、巴戟天、枸杞和香菇的粗多糖色谱图。
图5为实施例2中灵芝样品聚类分析图。
具体实施方式
下面将对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本公开的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本公开的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本公开保护的范围。
针对现有技术中指纹图谱鉴定灵芝真伪的方法误差较大，以及对于灵芝药材中多糖含量鉴定方法存在片面性问题。
本公开一个或一些实施方式中，提供一种灵芝各指标检测方法，包括如下步骤：对灵芝中总多糖含量进行鉴定，然后将总多糖分解为低聚糖和几种单糖，所述几种单糖分别为鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，并采用hilic-电喷雾质谱法建立低聚糖和几种单糖的指纹图谱。
本公开所述的低聚糖含义为总多糖除了几种单糖之外的未分解的多糖。
本公开将分解后的低聚糖与单糖分别进行研究，建立各自指纹图谱，由于灵芝多糖的低聚糖构型区别较大，因此从不同位置分解单糖后剩余的多糖也不相同，因此本公开加入了对多糖组分的测定，进一步提高灵芝多糖真伪鉴别的准确度。
优选的，总多糖含量进行鉴定包括如下步骤：对灵芝中粗多糖进行提取，配置标准溶液，绘制标准曲线，对多糖含量进行测定；
优选的，粗多糖进行提取包括如下步骤：将灵芝样品置于真空干燥并烘干后切片，粉碎，过筛，准确称取样品粉末，按一定料液比加入适量蒸馏水，在一定温度下超声提取一定时间，提取后的样品迅速冷却至室温，然后将提取液离心。上清液抽滤，再向上清液中加入乙醇，醇沉一段时间后离心，沉淀物于在水浴中干燥，并用热水复溶，再次离心定容，待用；
进一步优选的，采用真空干燥，真空干燥温度为55-65℃，优选为60℃，
进一步优选的，过筛为过38-42目筛，优选为40目筛，
进一步优选的，样品与蒸馏水的料液比为1-2:15-20，单位g:ml，优选为1:15，单位g:ml，
进一步优选的，超声温度为90℃，
进一步优选的，超声功率为300w，
进一步优选的，超声提取时间为30-40min，优选为30min，
进一步优选的，向上清液中加入体积分数为95％乙醇，使得溶液中乙醇的最终浓度为体积分数80％，
进一步优选的，醇沉温度为4℃，
进一步优选的，醇沉时间为12h，
进一步优选的，醇沉后离心时间为15min，
进一步优选的，水浴干燥温度为80℃，
进一步优选的，再次离心参数为转速为5000r/min，时间为15min。
优选的，所述标准溶液为葡萄糖溶液与苯酚溶液，优选的，所述葡萄糖溶液的浓度为0.1mg/ml，优选的，所述苯酚溶液的质量分数为5％；
或，绘制标准曲线包括如下步骤：用蒸馏水配成一系列不同浓度的葡萄糖标准溶液，每个浓度下的标准溶液分别与苯酚混合摇匀，再加入浓硫酸溶液，振摇放置后，置沸水浴中水浴加热后，快速冷却至室温，用1cm比色皿在波长487nm下测定，以葡萄糖的浓度值，单位为μg/ml为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，
优选的，水浴时间为8-15min，优选为10min。
优选的，多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，包括如下步骤：将粗多糖溶液稀释后与苯酚混匀，再加入浓硫酸溶液，振摇静置后，置沸水浴中加热一段时间，快速冷却至室温，用1cm比色皿在487nm处测定，测得的吸光度值在标准曲线上获得样品的浓度，并按回归方程计算出各样品中总多糖的含量；
优选的，粗多糖溶液稀释到原先的1/10；
优选的，多糖、苯酚与浓硫酸的体积比为1-2:1-2:5-10；优选为1:1:5；
优选的，浓硫酸溶液振摇时间为6-10min，静置时间为5-10min，进一步优选的振摇时间为6min，静置时间为5min。
优选的，水浴加热时间为10-15min，优选为10min。
灵芝总多糖百分含量w＝(c×d×v/m)×100％，其中，c为样品液中葡萄糖浓度，d为稀释倍数，v为提取液总体积，m为所称样品重量。
优选的，总多糖分解为低聚糖和几种单糖包括如下步骤：将粗多糖溶液用三氟乙酸溶液进行处理，置于恒温超声波清洗机中，水解产物用甲醇洗涤并用氮气吹干。
优选的，所述三氟乙酸的浓度为4mol/l；
优选的，恒温超声波清洗机中，65-75℃下孵育1-2h，进一步优选的，70℃下孵育1.0h。
优选的，hilic-电喷雾质谱法的色谱条件为：色谱柱：xbridgetmbehamide柱(2.1×150mm，2.5μm)，流动相a为乙腈溶液，流动相b为水。洗脱梯度：0～13min，91％～90％a；13～20min，90％a～80％a；20～40min，80％a；流速：0.3ml/min；进样量：10μl；柱温：25℃。cad检测参数：气体源为n2，压力61.2psi，filter5.0sec，雾化器温度35℃。
优选的，还包括利用色谱法对总多糖分解物进行识别的步骤，
优选的，色谱条件为色谱柱：acquity
优选的，还包括对灵芝各指标检测方法进行考察的步骤，即进行精密性、稳定性、重复性实验。
本公开一个或一些实施方式中，提供一种灵芝真伪鉴定方法，将上述灵芝各指标检测方法得到的总多糖含量、指纹图谱录入数据库，将待测物按照上述灵芝各指标检测方法进行处理，将待测物总多糖含量、指纹图谱与数据库中的数值进行比较。
优选的，数据库中录入多个不同品种的灵芝数据。
实施例1
1.1材料
干燥的灵芝样品子实体均购于济南市药王楼(表1)。
表1灵芝供试样品
1.2试剂
95％乙醇(分析纯，山东禹王实业有限公司化工分公司)，苯酚(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)，乙腈(色谱纯，瑞典oceanpak试剂公司)，氢氟酸(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，三氟乙酸、浓盐酸、甲酸铵(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，d-( )-葡萄糖、l-鼠李糖、d-半乳糖、d-甘露糖、d-阿拉伯糖、d-( )-木糖、l-( )-岩藻糖(纯度大于98％，上海源叶生物科技有限公司)。
1.3仪器
万分之一电子分析天平(美国sartouriusbsa公司)，sbl-10dt型恒温超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，tg16-ws型台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，genesys10s紫外可见分光光度计(德国thermofisher公司)，hh-s4数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)，赛默飞ultimate高效液相色谱仪(德国thermofisher公司)。
1.4多糖含量测定
1.4.1粗多糖的提取
将灵芝样品置于真空干燥箱中60℃烘干后切片，粉碎，过40目筛。准确称取2g样品粉末置于锥形瓶中，按一定料液比(1:15，g/ml)加入适量蒸馏水，在一定温度(90℃)下超声(功率300w)提取一定时间(30min)。提取后的样品迅速冷却至室温，然后将提取液离心。上清液抽滤，再向其中加入95％乙醇，使得溶液中乙醇的最终浓度为80％(v/v)，4℃醇沉12h后离心(15min)。沉淀物于80℃水浴干燥，并用热水复溶，再次离心(5000r/min，15min)，最终定容至5ml，待用。
1.4.2溶液的配制
葡萄糖标准溶液：精确称取无水葡萄糖标准品1.0mg于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度线，摇匀，配成0.1mg/ml的标准品溶液。
苯酚溶液：准确称取苯酚5.0g于50ml容量瓶中，加水至刻度线，配成质量分数为5％的苯酚溶液，摇匀后转移至棕色试剂瓶中，备用。
1.4.3标准曲线的绘制
准确量取葡萄糖标准溶液(0.1mg/ml)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0ml于10ml容量瓶中，加水至刻度线，摇匀，配成一系列葡萄糖标准溶液。分别取1.0ml系列标准溶液于干燥试管中，各加入5％苯酚溶液1.0ml摇匀，再沿试管壁缓缓加入浓硫酸溶液5ml，振摇6min，注意开盖放气，放置5min后，置沸水浴中水浴10min，快速冷却至室温，用1cm比色皿在波长487nm下测定，以葡萄糖的浓度值(单位：μg/ml)为横坐标(x)，吸光度值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。
1.4.4样品中多糖含量的测定
采用改进的苯酚-硫酸法对不同品种灵芝多糖含量进行测定。准确量取各粗多糖溶液0.3ml于10ml容量瓶中，加水定容至刻度线，摇匀。准确吸取稀释后的粗多糖溶液1.0ml于试管中，加入5％苯酚溶液1.0ml，摇匀，再沿壁加入浓硫酸溶液5.0ml，振摇6min，静置5min后，置沸水浴中加热10min，快速冷却至室温，用1cm比色皿在487nm处测定，测得的吸光度值在标准曲线上获得样品的浓度，并按回归方程计算出各样品中总多糖的含量。灵芝总多糖百分含量w＝(c×d×v/m)×100％(c为样品液中葡萄糖浓度，d为稀释倍数，v为提取液总体积，m为所称样品重量)。
1.5灵芝多糖的单糖组成
1.5.1多糖的水解
将粗多糖溶液用4mol/l的三氟乙酸(tfa)溶液进行处理。置于恒温超声波清洗机中，在70℃下孵育1.0h。水解产物用甲醇洗涤并用氮气吹干。
1.5.2溶液的配制
供试品溶液的配制：将吹干的样品用水定容至1.0ml，经0.22μm微孔膜过滤，制成供试品溶液。
对照品溶液：分别精密称取鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖对照品各1.0mg，置于1ml容量瓶中，加入水至刻度线，配制成质量浓度为1.0mg/ml的对照品溶液。
1.5.3色谱条件
色谱柱：acquity
1.6灵芝多糖的特征指纹图谱
1.6.1多糖的水解
粗多糖溶液中加入4mol/l的三氟乙酸(tfa)溶液。置于水浴锅中，在80℃中水解5h，冷却至室温。水解产物用甲醇洗涤并用氮气吹干。
1.6.2溶液的配制
供试品溶液的配制：将吹干的样品用水定容至1.0ml，经0.22μm微孔膜过滤，制成供试品溶液。
混合对照品溶液：分别精确称量鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖对照品各1.0mg，用水溶解至1ml，配制成质量浓度为1.0mg/ml的对照品溶液。精密吸取各对照品溶液100μl于1ml容量瓶中，用水稀释至刻度线，所得溶液即为混合对照品溶液。
1.6.3色谱条件
色谱柱：xbridgetmbehamide柱(2.1×150mm，2.5μm)，流动相a为乙腈溶液，流动相b为水。洗脱梯度：0～13min，91％～90％a；13～20min，90％a～80％a；20～40min，80％a；流速：0.3ml/min；进样量：10μl；柱温：25℃。cad检测参数：气体源为n2，压力61.2psi，filter5.0sec，雾化器温度35℃。
实施例2
2.1不同品种灵芝多糖的对比分析
表2不同品种灵芝多糖含量比较(平均值，％)
根据1.4.3所述方法进行计算，按“1.4.4”项下的分析方法对不同品种灵芝(赤芝、平盖灵芝)多糖含量进行了测定。如表2所示，平盖灵芝多糖含量明显高于赤芝。其中，平盖灵芝多糖含量平均值为2.68％；赤芝平均含量为1.67％。不同品种灵芝多糖含量之间的差异，可能是在长期的演化过程中，由于天然杂交、自然选择、人工栽培等因素的影响，使得灵芝不同品种间次生代谢物发生变化。此外，遗传变异和生境变异的相互作用导致灵芝出现品质优劣的现象。以上可以看出，不同品种灵芝多糖含量表现出一定差异，说明测定多糖含量对评价灵芝药材质量用具有重要意义。
2.2灵芝多糖的单糖组成分析
提取的灵芝粗多糖样品经“1.5.1”项下方法水解后，按“1.5.2”项下方法制成供试品溶液，根据“1.5.3”项下色谱条件分别测定样品中7种单糖的含量，结果见表3。
表3粗多糖水解后单糖含量测定结果
多糖是一类天然生物大分子，由大量单糖基和糖苷键聚合而成，单糖组成复杂且差异较大。研究多糖中单糖的组成及含量可以为灵芝的品种鉴别提供信息参考。如表3所示，赤芝和平盖灵芝多糖水解产物均由鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖7种单糖共同组成，但各单糖的含量和分布又存在一定的相似和不同之处(图1)。首先，赤芝和平盖灵芝中各单糖总体含量高低趋势大致相同。其中，木糖含量均是最高的，其次为阿拉伯糖，含量最低的单糖两者稍有不同(赤芝是甘露糖含量最低，平盖灵芝是半乳糖含量最低)。其次，可以看出各品种灵芝单糖组成比例存在一定差异，赤芝中阿拉伯糖、甘露糖含量较平盖灵芝稍高；平盖灵芝中半乳糖含量明显较低，鼠李糖和木糖含量稍高。不同品种灵芝多糖的单糖组成差异说明多糖结构具有复杂性，进而导致其功能的多样性。
2.3灵芝多糖特征指纹图谱及混淆品区分研究
2.3.1灵芝多糖的色谱分析
将按照不同条件水解的灵芝多糖样品按“1.6.2”项下方法制成供试品溶液，并按照“1.6.3”项下色谱条件进样分析，所得灵芝多糖水解物的hplc色谱图如图2所示。
2.3.2方法学考察
2.3.2.3精密度试验
取同一供试品溶液，按“1.6.3”项下色谱条件连续进样6次，测得各单糖峰的保留时间rsd分别为0.85％、0.47％、0.43％、0.39％、0.85％、0.39％、0.79％、0.69％、0.30％、0.26％、0.34％，均小于1％；峰面积rsd分别为2.94％、3.09％、1.55％、0.88％、1.63％、2.66％、4.14％、3.94％、4.41％、1.46％、1.29％，均小于5％。结果表明仪器精密度良好。
2.3.2.4稳定性试验
取同一供试品溶液，按“1.6.3”项下色谱条件分别于0、4、8、12、16、24h进样分析，测得各单糖峰的保留时间rsd分别为0.74％、0.24％、0.45％、0.61％、0.88％、0.61％、0.55％、0.62％、0.37％、0.30％、0.35％，均小于1％；峰面积rsd分别为3.81％、3.12％、2.93％、2.89％、2.77％、3.25％、2.91％、2.50％、1.74％、4.38％、1.41％，均小于5％。表明供试品溶液在24h内较为稳定。
2.3.2.5重复性试验
取同一批次粗多糖样品，按“1.6.2”项下方法制成6份供试品溶液，按“1.6.3”项下色谱条件进行测定，测得各单糖峰的保留时间rsd分别为0.89％、0.29％、0.55％、0.33％、0.38％、0.78％、0.52％、0.72％、0.21％、0.20％、0.40％，均小于1％；峰面积rsd分别为4.00％、3.91％、3.08％、4.32％、2.80％、3.86％、3.53％、3.56％、3.25％、4.62％、0.81％，均小于5％。结果表明方法重复性良好。
2.3.4特征指纹图谱的构建
将不同品种的多批次灵芝粗多糖样品，按“1.6.2”项下方法处理成供试品溶液，按“1.6.3”项下色谱条件分别进行测定，选定其中30个共有特征色谱峰的色谱图作为灵芝部分酸解的指纹图谱。不同批次灵芝多糖的hplc指纹图谱见图3。
2.3.7指纹图谱专属性验证
将不同样品(灵芝、黄芪、何首乌、巴戟天、枸杞和香菇)的粗多糖样品，按“1.6.2”项下方法处理成供试品溶液，按“1.6.3”项下色谱条件分别进行测定，其色谱图如图4所示。从图中可以看出，灵芝与其他样品多糖特征指纹存在一定差异，特别是画框区域色谱峰分布存在明显不同，说明该方法分析表征灵芝多糖具有一定专属性。
2.3.5相似度评价
运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004a版)对灵芝多糖的指纹图谱进行分析与评价，各样品的相似度见表4。通过表4可以看出，赤芝多糖特征指纹图谱的相似度在0.9249～0.9547之间；而10批平盖灵芝特征指纹图谱的相似度在0.8449和0.8735之间，说明不同品种灵芝样品其所含多糖成分存在一定差异。由此可见，赤芝和平盖灵芝种内相似度较为接近，种间的差异较大。这些差异可以为不同品种灵芝多糖的鉴别和其产品质量控制提供依据。
表4灵芝多糖指纹图谱相似度评价
2.3.6聚类分析
以各特征峰峰面积作为变量，采用系统聚类分析技术对赤芝和平盖灵芝进行分析。从图5可以看出，赤芝样品种内差异稍大，但可以较好地聚为一类；平盖灵芝样品种内差异较小，并且聚为一类。说明灵芝多糖特征指纹图谱技术集合聚类分析有望实现掺假灵芝的区分。
以上所揭露的仅为本公开的优选实施例而已，当然不能以此来限定本公开之权利范围，因此依本公开申请专利范围所作的等同变化，仍属本公开所涵盖的范围。
1.一种灵芝各指标检测方法，其特征在于，包括如下步骤：对灵芝中总多糖含量进行鉴定，然后将总多糖分解为低聚糖和几种单糖，所述几种单糖分别为鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，并采用hilic-电喷雾质谱法建立低聚糖和几种单糖的指纹图谱。
2.如权利要求1所述的灵芝各指标检测方法，其特征在于，总多糖含量进行鉴定包括如下步骤：对灵芝中粗多糖进行提取，配置标准溶液，绘制标准曲线，对多糖含量进行测定；
优选的，粗多糖进行提取包括如下步骤：将灵芝样品置于真空干燥并烘干后切片，粉碎，过筛，准确称取样品粉末，按一定料液比加入适量蒸馏水，在一定温度下超声提取一定时间，提取后的样品迅速冷却至室温，然后将提取液离心。上清液抽滤，再向上清液中加入乙醇，醇沉一段时间后离心，沉淀物于在水浴中干燥，并用热水复溶，再次离心定容，待用；
进一步优选的，采用真空干燥，真空干燥温度为55-65℃，优选为60℃，
进一步优选的，过筛为过38-42目筛，优选为40目筛，
进一步优选的，样品与蒸馏水的料液比为1-2:15-20，单位g:ml，优选为1:15，单位g:ml，
进一步优选的，超声温度为90℃，
进一步优选的，超声功率为300w，
进一步优选的，超声提取时间为30-40min，优选为30min，
进一步优选的，向上清液中加入体积分数为95％乙醇，使得溶液中乙醇的最终浓度为体积分数80％，
进一步优选的，醇沉温度为4℃，
进一步优选的，醇沉时间为12h，
进一步优选的，醇沉后离心时间为15min，
进一步优选的，水浴干燥温度为80℃，
进一步优选的，再次离心参数为转速为5000r/min，时间为15min。
3.如权利要求2所述的灵芝各指标检测方法，其特征在于，所述标准溶液为葡萄糖溶液与苯酚溶液，优选的，所述葡萄糖溶液的浓度为0.1mg/ml，优选的，所述苯酚溶液的质量分数为5％；
或，绘制标准曲线包括如下步骤：用蒸馏水配成一系列不同浓度的葡萄糖标准溶液，每个浓度下的标准溶液分别与苯酚混合摇匀，再加入浓硫酸溶液，振摇放置后，置沸水浴中水浴加热后，快速冷却至室温，用1cm比色皿在波长487nm下测定，以葡萄糖的浓度值，单位为μg/ml为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，
优选的，水浴时间为8-15min，优选为10min。
4.如权利要求1所述的灵芝各指标检测方法，其特征在于，多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，包括如下步骤：将粗多糖溶液稀释后与苯酚混匀，再加入浓硫酸溶液，振摇静置后，置沸水浴中加热一段时间，快速冷却至室温，用1cm比色皿在487nm处测定，测得的吸光度值在标准曲线上获得样品的浓度，并按回归方程计算出各样品中总多糖的含量；
优选的，粗多糖溶液稀释到原先的1/10；
优选的，多糖、苯酚与浓硫酸的体积比为1-2:1-2:5-10；优选为1:1:5；
优选的，浓硫酸溶液振摇时间为6-10min，静置时间为5-10min，进一步优选的振摇时间为6min，静置时间为5min。
优选的，水浴加热时间为10-15min，优选为10min。
灵芝总多糖百分含量w＝(c×d×v/m)×100％，其中，c为样品液中葡萄糖浓度，d为稀释倍数，v为提取液总体积，m为所称样品重量。
5.如权利要求1所述的灵芝各指标检测方法，其特征在于，总多糖分解为低聚糖和几种单糖包括如下步骤：将粗多糖溶液用三氟乙酸溶液进行处理，置于恒温超声波清洗机中，水解产物用甲醇洗涤并用氮气吹干。
优选的，所述三氟乙酸的浓度为4mol/l；
优选的，恒温超声波清洗机中，65-75℃下孵育1-2h，进一步优选的，70℃下孵育1.0h。
6.如权利要求1所述的灵芝各指标检测方法，其特征在于，hilic-电喷雾质谱法的色谱条件为：色谱柱：xbridgetmbehamide柱(2.1×150mm，2.5μm)，流动相a为乙腈溶液，流动相b为水。洗脱梯度：0～13min，91％～90％a；13～20min，90％a～80％a；20～40min，80％a；流速：0.3ml/min；进样量：10μl；柱温：25℃。cad检测参数：气体源为n2，压力61.2psi，filter5.0sec，雾化器温度35℃。
7.如权利要求1所述的灵芝各指标检测方法，其特征在于，还包括利用色谱法对总多糖分解物进行识别的步骤，
优选的，色谱条件为色谱柱：acquity
8.如权利要求1所述的灵芝各指标检测方法，其特征在于，还包括对灵芝各指标检测方法进行考察的步骤，即进行精密性、稳定性、重复性实验。
9.一种灵芝真伪鉴定方法，其特征在于，将权利要求1-8任一项所述的灵芝各指标检测方法得到的总多糖含量、指纹图谱录入数据库，将待测物按照权利要求1-8任一项所述的灵芝各指标检测方法进行处理，将待测物总多糖含量、指纹图谱与数据库中的数值进行比较。
10.如权利要求9所述的灵芝真伪鉴定方法，其特征在于，数据库中录入多个不同品种的灵芝数据。
技术总结