本发明属于分析技术领域，特别涉及一种3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮纯度的检测方法。
背景技术：
阿瑞匹坦临床上主要用于预防高度致吐性抗肿瘤化疗的初次和重复治疗过程中出现的急性和迟发性恶心和呕吐。3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮，其cas号为252742-72-6，3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮是生产阿瑞匹坦的重要中间体，3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度、杂质含量直接影响阿普斯特的纯度、杂质含量的大小，从而直接影响阿瑞匹坦的药物疗效。
在制备阿瑞匹坦的过程中，3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度及杂质含量的检测尤为重要，但现有技术中还未发现3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度及杂质含量的检测方法的相关文献及报道。为了加强3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮质量控制，进一步控制阿瑞匹坦的质量，提供一种3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度及杂质含量的检测方法尤为重要。
技术实现要素：
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮纯度的检测方法，该检测方法能准确检测出待测样品中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度，以及杂质的含量，有利于制备高质量的阿瑞匹坦。该检测方法简便、准确、快速、可靠，有助于3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮工业化生产。另外，该检测方法还能有效分离待测样品中的杂质。该检测方法以保留时间定性，峰面积定量。
一种3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮纯度的检测方法，包括以下步骤：
将3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮溶于稀释液中，得到对照样品溶液；
将含3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的待测样品溶于稀释液中，得到待测样品溶液；
取所述对照样品溶液，以液相色谱进行检测，记录色谱图a；
取所述待测样品溶液，以液相色谱进行检测，记录色谱图b；
根据所述色谱图a和色谱图b计算待测样品中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度；
所述液相色谱的条件包括：采用的流动相包括流动相a和流动相b；所述流动相a为磷酸盐缓冲液和乙腈；所述流动相b为乙腈；所述流动相a中的磷酸盐缓冲液和乙腈的体积比为(950±5):(50±0.5)。
优选的，所述磷酸盐缓冲液为kh2po4缓冲液。
优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.1mol/l；进一步优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.05mol/l；更优选的浓度为0.02mol/l。
优选的，所述磷酸盐缓冲液的ph为3.0±0.08；进一步优选的，所述磷酸盐缓冲液的ph为3.0±0.05；更优选的，磷酸盐缓冲液的ph为3.0。所述磷酸盐缓冲液的ph的选择有助于改善峰型，特别是当ph为3.0，峰型最佳。
优选的，所述稀释液为kh2po4缓冲液和乙腈的混合物；进一步优选的，所述稀释液中的kh2po4缓冲液和乙腈的体积比为(75-85):(18-22)；进一步优选的体积比为80:20。
优选的，所述对照样品溶液中，所述3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的浓度为0.1-0.8mg/ml；进一步优选的，所述3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的浓度为0.4-0.6mg/ml；更优选的，所述3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的浓度为0.5mg/ml。
优选的，所述待测样品溶液中，所述待测样品的浓度为0.1-0.8mg/ml；进一步优选的，所述待测样品的浓度为0.4-0.6mg/ml；更优选的，所述待测样品的浓度为0.5mg/ml。所述待测样品是指待检测纯度的3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮。所述待测样品的浓度是指待检测纯度的3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮在溶液中的浓度。
优选的，所述流动相的使用过程中，按照以下浓度梯度进行洗脱：
0分钟，所述流动相中流动相a的体积占比100％；
10分钟，所述流动相中流动相a的体积占比80-90％，流动相b的体积占比10-20％；
15分钟，所述流动相中流动相a的体积占比100％；
25分钟以后，所述流动相中流动相a的体积占比100％。
优选的，所述以液相色谱进行检测的过程中的流动相的流速为0.8-1.2ml/分钟；进一步优选1ml/分钟。
优选的，所述以液相色谱进行检测的过程中的色谱柱为eclipseplusc18(4.6*250mm,5μm)及其等同的色谱柱。
优选的，所述以液相色谱进行检测的过程中的液相色谱仪的色谱柱温度为28-32℃；进一步优选30℃。
优选的，所述以液相色谱进行检测的过程中的液相色谱仪的检测波长为205-215nm；进一步优选210nm。
优选的，所述以液相色谱进行检测的过程中使用紫外检测器进行检测。
优选的，所述检测方法还包括的步骤为空白试验，所述空白试验为：将所述稀释液以液相色谱进行检测，记录色谱图c，色谱图b扣除掉色谱图c中的色谱峰后，按面积归一化法计算。空白试验目的在于消除稀释液所带来的影响，可进一步提高检测的精确度。
优选的，所述稀释液、对照样品溶液或待测样品溶液进入液相色谱仪中的用量为8-15μl；进一步优选8-10μl。
本发明的另一方面提供上述检测方法的应用。
上述3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮纯度的检测方法在制备阿瑞匹坦中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明所述检测方法，由于选择合适的流动相，使得该检测方法能准确检测出待测样品中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度，以及杂质的含量，有利于制备高质量的阿瑞匹坦。
(2)本发明所述检测方法，流动相的洗脱梯度的选择，有助于提高该检测方法的准确度，有助于提高检测速度。另外，该检测方法还有助于分离待测样品中的杂质。
(3)本发明所述检测方法，简便、准确、快速、可靠，有助于3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮工业化生产。
附图说明
图1为实施例1检测方法中获得的色谱图a；
图2为实施例1检测方法中获得的色谱图b；
图3为实施例3检测方法中获得的色谱图b；
图4为实施例5检测方法中获得的色谱图b。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1：3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮纯度的检测方法
一种3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮纯度的检测方法，包括以下步骤：
空白试验为：将稀释液(稀释液为kh2po4缓冲液和乙腈按照体积比为80:20的混合物，kh2po4缓冲液的ph为3)以液相色谱进行检测，记录色谱图c，
将3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮溶于稀释液(稀释液为kh2po4缓冲液和乙腈按照体积比为80:20的混合物，kh2po4缓冲液的ph为3)中，得到对照样品溶液，对照样品溶液中，3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的浓度为0.5mg/ml；
将含3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的待测样品1溶于稀释液中(稀释液为kh2po4缓冲液和乙腈按照体积比为80:20的混合物，kh2po4缓冲液的ph为3)，得到待测样品溶液，待测样品溶液中待测样品的浓度为0.5mg/ml；
取对照样品溶液，以液相色谱进行检测，记录色谱图a；
取待测样品溶液，以液相色谱进行检测，记录色谱图b；
根据色谱图a和色谱图b以及色谱图c计算待测样品中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度(色谱图b扣除掉色谱图c中的色谱峰后结合色谱图a)，采用面积归一化法计算待测样品1中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度及杂质含量，结果如表1所示；
液相色谱的条件包括：采用的流动相包括流动相a和流动相b；流动相a为kh2po4缓冲液(kh2po4缓冲液的浓度为0.02mol/l，kh2po4缓冲液的ph为3)和乙腈；流动相b为乙腈；流动相a中的kh2po4缓冲液和乙腈的体积比为950:50；
流动相的使用过程中，按照以下浓度梯度进行洗脱：
0分钟，所述流动相中流动相a的体积占比100％；
10分钟，所述流动相中流动相a的体积占比90％，流动相b的体积占比10％；
15分钟，所述流动相中流动相a的体积占比100％；
25分钟以后，所述流动相中流动相a的体积占比100％；
以液相色谱进行检测的过程中的流动相的流速为1ml/分钟；
色谱柱为eclipseplusc18(4.6*250mm,5μm)；
液相色谱仪的色谱柱温度为30℃；
使用紫外检测器进行检测，检测波长为210nm；
稀释液、对照样品溶液或待测样品溶液进入液相色谱仪中的用量为10μl。
图1为实施例1检测方法中获得的色谱图a；图1中的“1”表示3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮对应的峰(图1中的纵坐标“absorbance”表示吸光度，单位为mau，横坐标表示时间，单位为min，即分钟)。
图2为实施例1检测方法中获得的色谱图b。图2中的“3”表示3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮对应的峰，图2中的“2”表示“最大单杂”对应的峰，图2中的“1”和“4”表示其他杂质对应的峰(图2中的纵坐标“absorbance”表示吸光度，单位为mau，横坐标表示时间，单位为min，即分钟)。
表1
从表1可以看出，待测样品1中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度达到99.76％(本发明的纯度或含量指质量纯度或质量含量)，最大单杂含量达到0.21％，总杂含量达到0.24％。
实施例2：3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮纯度的检测方法
实施例2与实施例1的区别仅在于用待测样品2替换待测样品1，其余过程相同。采用面积归一化法计算待测样品2中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度及杂质含量，结果如表2所示。
表2
从表2可以看出，待测样品2中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度达到99.12％，最大单杂含量达到0.50％，总杂含量达到0.88％。
实施例3：3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮纯度的检测方法
实施例3与实施例1的区别仅在于用待测样品3替换待测样品1，其余过程相同。采用面积归一化法计算待测样品3中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度及杂质含量，结果如表3所示。
图3为实施例3检测方法中获得的色谱图b。图3中的“4”表示3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮对应的峰，图3中的“1”表示“最大单杂”对应的峰，图3中的“2”和“3”表示其他杂质对应的峰(图3中的纵坐标“absorbance”表示吸光度，单位为mau，横坐标表示时间，单位为min，即分钟)。
表3
从表3可以看出，待测样品3中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度达到99.36％，最大单杂含量达到0.42％，总杂含量达到0.64％。
实施例4：3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮纯度的检测方法
实施例4与实施例1的区别仅在于用待测样品4替换待测样品1，其余过程相同。采用面积归一化法计算待测样品4中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度及杂质含量，结果如表4所示。
表4
从表4可以看出，待测样品4中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度达到99.28％，最大单杂含量达到0.34％，总杂含量达到0.72％。
在本发明记载的技术方案内，改变流动相a中的磷酸盐缓冲液和乙腈的体积比，或者磷酸盐缓冲液的具体种类，或者按照本发明技术的技术方案改变液相色谱过程中的一些参数，只要是在本发明的发明内容记载的技术方案内，对待测样品中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度以及杂质含量的检测效果，与实施例1-4类似。
实施例5
与实施例1相比，实施例5的不同之处仅在于，所用的kh2po4缓冲液的ph为7.0±0.05。
图4为实施例5检测方法中获得的色谱图b。图4中的“3”表示3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮对应的峰，其他的峰为杂质对应的峰(图4中的纵坐标“absorbance”表示吸光度，单位为mau，横坐标表示时间，单位为min，即分钟)。从实施例1和实施例5对应的色谱图b可以看出，所用的kh2po4缓冲液的ph会影响峰的形状。
1.一种3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮纯度的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮溶于稀释液中，得到对照样品溶液；
将含3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的待测样品溶于稀释液中，得到待测样品溶液；
取所述对照样品溶液，以液相色谱进行检测，记录色谱图a；
取所述待测样品溶液，以液相色谱进行检测，记录色谱图b；
根据所述色谱图a和色谱图b计算待测样品中3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的纯度；
所述液相色谱的条件包括：采用的流动相包括流动相a和流动相b；所述流动相a为磷酸盐缓冲液和乙腈；所述流动相b为乙腈；所述流动相a中的磷酸盐缓冲液和乙腈的体积比为(950±5):(50±0.5)。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液为kh2po4缓冲液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的ph为3.0±0.08。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述稀释液为kh2po4缓冲液和乙腈的混合物；所述稀释液中的kh2po4缓冲液和乙腈的体积比为(75-85):(18-22)。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述对照样品溶液中，所述3-氯甲基-1,2,4-三唑啉-5-酮的浓度为0.1-0.8mg/ml；所述待测样品溶液中，所述待测样品的浓度为0.1-0.8mg/ml。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的使用过程中，按照以下浓度梯度进行洗脱：
0分钟，所述流动相中流动相a的体积占比100％；
10分钟，所述流动相中流动相a的体积占比80-90％，流动相b的体积占比10-20％；
15分钟，所述流动相中流动相a的体积占比100％；
25分钟以后，所述流动相中流动相a的体积占比100％。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述以液相色谱进行检测的过程中的流动相的流速为0.8-1.2ml/分钟。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述以液相色谱进行检测的过程中的液相色谱仪的色谱柱温度为28-32℃，检测波长为205-215nm；所述稀释液、对照样品溶液或待测样品溶液进入液相色谱仪中的用量为8-15μl。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括的步骤为空白试验，所述空白试验为：将所述稀释液以液相色谱进行检测，记录色谱图c。
10.权利要求1-9中任一项所述的检测方法在制备阿瑞匹坦中的应用。
技术总结