本发明涉及一种药物的检测方法，尤其涉及新药托匹司他片的有关物质测定方法，属医药技术领域。
背景技术：
尿酸为嘌呤核苷酸代谢的正常产物，当尿酸生成过多和尿酸排泄减少时，血中尿酸升高超过正常范围即形成高尿酸血症；血中过多的尿酸主要沉积于关节、软骨、皮下软组织及肾脏，引起关节炎和肾脏病变等综合临床表现，即称之为痛风，故高尿酸血症及尿酸在器官组织内沉积是痛风的基本发病机制。而导致尿酸升高的病因较为复杂，可分为原发性和继发性两大类。随着人们生活水平的提高，营养条件的改善，摄入动物蛋白、脂肪的增加及生活行为的改变（饮酒、吸烟等），高尿酸血症和痛风的发病率逐渐上升，发病年龄提前，高尿酸血症可引起痛风性急性关节炎反复发作、痛风石形成、痛风石性关节炎和关节畸形，累及肾脏引起慢性间质性肾炎和尿酸肾结石形成，常增加患者痛苦，并严重影响患者生活质量。
目前，我国痛风患者仍不断增加，且呈现出向低龄化蔓延的趋势，因此抗痛风类药物在我国市场潜力很大，但目前市场上的抗痛风类药物多为老药，虽价格低廉但副作用明显，如果有新的药物适时推出，市场前景将非常可观。
托匹司他对氧化型和还原型的黄嘌呤氧化酶均有显著的抑制作用，因而其降低尿酸的作用更强大、持久，因此本品可用于治疗痛风的慢性高尿酸血症。与别嘌呤醇相比有两个优势：1）别嘌呤醇只对还原型的黄嘌呤氧化酶有抑制作用，而托匹司他对氧化型和还原型的黄嘌呤氧化酶均有显著的抑制作用，因而其降低尿酸的作用更强大、持久；2）由于别嘌呤醇为嘌呤类似物，不可避免的造成涉及嘌呤及吡啶代谢其他酶活性的影响，因此别嘌呤醇治疗中，需要重复大剂量给药来维持较高的药物水平,由此也带来由于药物蓄积所致的严重甚至致命的不良反应。而托匹司他为非嘌呤类黄嘌呤氧化酶抑制剂，因此具有更好的安全性。
非布索坦是近20年来唯一的一个被批准上市的抑制尿酸生成的药物，本品与别嘌醇等其它抗痛风药物相比，具有以下显著优点：1)作用机制独特。非布索坦是一种强大的非嘌呤类选择性黄嘌呤氧化酶抑制剂，通过占据酶的疏水口，阻止底物结合来抑制酶的活性，对氧化型和还原型黄嘌呤氧化酶均有强大抑制作用。在治疗浓度，非布索坦不抑制嘌呤或嘧啶代谢过程中涉及的其它酶，即：鸟嘌呤脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、乳清酸磷酸核糖转移酶、乳清酸核苷酸脱羧酶或嘌呤核苷磷酸化酶。而别嘌醇对黄嘌呤氧化酶缺乏选择性，可抑制黄嘌呤氧化酶以外的嘌呤或嘧啶代谢过程中涉及的酶。2)降低尿酸的效力优于别嘌醇，且疗效更加持久。非布索坦对氧化型和还原型黄嘌呤氧化酶均有强大抑制作用且疗效持久，临床只需1日1次用药即可满足治疗要求，增加了患者的顺应性；而别嘌醇通常需1日2～3次给药，才能维持其有效血药浓度。3)不良反应更小。非布索坦对黄嘌呤氧化酶具有更高的选择性，不像别嘌醇那样可抑制黄嘌呤氧化酶以外的嘌呤或嘧啶代谢过程中涉及的酶，因此相对于别嘌醇更加安全。4)非布索坦可通过肝脏和肾脏双通道消除，与别嘌醇大量经肾排泄消除相比，非布索坦对肾功能不全患者具有更高的安全性。临床上轻度或中度肾功能不全患者无需调整非布索坦剂量，并且非布索坦对肾功能不全患者具有比别嘌醇更好的疗效。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的是提供一种能提高重现性和精密度，从而能更好地控制新药托匹司他片的杂质。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：新药托匹司他片的有关物质测定方法，该方法包括如下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取本品细粉适量，精密称定，用甲醇超声溶解并定量稀释制成每1ml中约含托匹司他0.5mg的溶液，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
（2）对照溶液的制备：精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；
（3）系统适用性溶液的制备：取杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、托匹司他对照品适量用甲醇溶解并用流动相a定量稀释制成约1μg/ml的溶液，作为系统适用性溶液；
（4）有关物质测定：照高效液相色谱法试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以20mmol/l磷酸二氢钾（用磷酸调节ph至3.2）为流动相a，乙腈为流动相b，按下表进行梯度洗脱，检测波长为270nm。精密量取系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，杂质a、杂质b、杂质c、托匹司他、杂质d依次出峰，主峰与相邻杂质峰的分离度应大于1.5。精密量取供试品溶液和对照溶液各20µl，分别注入液相色谱议，记录色谱图，扣除溶剂峰后，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，杂质a、杂质b、杂质c、杂质d峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍(0.2%)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍(0.2%)；各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积1.0倍(1.0%)。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步阐述本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1初拟色谱条件
色谱柱：c18(merckc18,150×4.6mm,5μm)；
检测波长：270nm、220nm；柱温：25℃；进样量：20μl
流动相a为0.02mol/l磷酸二氢钾（用磷酸调节ph值至3.2），流动相b为乙腈，按下表进行线性梯度洗脱：
（1）有关物质供试品溶液浓度的确定
取本品片适量，研磨成细粉，精密称定（约相当于托匹司他25mg），置50ml量瓶中，加适量甲醇超声助溶，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液，精密量取供试品溶液20µl，注入液相色谱仪，记录色谱图。实验结果表明，样品浓度为0.5mg/ml时，能满足杂质的有效检出，因此，初步确定本品有关物质的浓度为0.5mg/ml；
（2）空白辅料和溶剂干扰试验
精密称取处方量的空白辅料（约62.5mg），置50ml量瓶中，加适量甲醇超声助溶并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液20µl，照上述色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，空白辅料及溶剂峰对检查均无干扰。由此，可初步断定，可以采用本品原料有关物质测定方法来测定本品的有关物质。
实施例2破坏性试验
取本品研细的粉末适量，分别用高温、酸、碱、氧化、光照等剧烈条件对本品破坏后进行有关物质测定，以考察所选择的色谱条件能否检测出托匹司他片可能产生的降解产物，检测波长为220nm和270nm，具体如下：
①未破坏：取本品细粉适量（约相当于托匹司他25mg），精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；
②高温破坏（固体）：取本品细粉适量，置105℃烘箱中加热24小时后，放冷，精密称定（约相当于托匹司他25mg），置50ml量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；
③高温破坏（液体）：取本品细粉末适量，精密称定（约相当于托匹司他25mg），置50ml量瓶中，加适量甲醇超声溶解后，置100℃水浴锅中水浴加热5小时后取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；
④酸加热破坏：精密称取本品细粉适量（约相当于托匹司他25mg），置50ml量瓶中，加1mol/l盐酸溶液0.5ml，60℃破坏20小时后加等量1mol/l氢氧化钠溶液中和，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；
⑤碱破坏：精密称取本品细粉适量（约相当于托匹司他25mg），置50ml量瓶中，加1mol/l氢氧化钠溶液0.5ml，室温放置1.5小时后，加1mol/l盐酸溶液中和，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；
⑥氧化破坏：精密称取本品细粉适量（约相当于托匹司他25mg），置50ml量瓶中，加30%过氧化氢0.1ml，室温放置24小时后，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；
⑦光照破坏（固体）：取本品细粉适量，置强光条件下（4500lx±500lx）照射24小时后，精密称取适量（约相当于托匹司他25mg），置50ml量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；
⑧光照破坏（液体）：取本品细粉适量，精密称定（约相当于托匹司他25mg），置50ml量瓶中，加适量甲醇超声使溶解后，置强光条件下（4500lx±500lx）照射24小时后取出，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
实施例3供试品溶液的稳定性试验
取本品细粉适量，加甲醇超声溶解并稀释制成每1ml中含托匹司他0.5mg的溶液，作为供试品溶液。分别在配制后室温放置0h、2h、4h、6h、8h时进样分析，考察样品溶液的稳定性，结果见表1。
表1样品溶液的稳定性试验结果
试验结果表明本品有关物质样品溶液室温放置8小时内基本稳定。
实施例4已知杂质定量方法学研究
（1）进样精密度试验
取上述线性项下的0.15%溶液分别连续进样6次，记录峰面积，计算其偏差，结果下表2：
表2进样精密度试验结果(0.15%)
试验结果表明，各杂质在相对托匹司他0.15%的浓度下，进样精密度良好；
（2）杂质对照溶液稳定性试验
配制杂质对照溶液，分别于0、2、4、6、8小时检测，考察各杂质峰面积在8小时内的变化，计算rsd值，试验结果见表3。
表3杂质对照溶液稳定性试验结果
试验结果表明，上述杂质对照溶液在8小时内稳定性良好；
（3）重复性试验
精密称取托匹司他片适量，研成细粉，用甲醇溶解并定量稀释成0.5mg/ml的溶液，作为供试品溶液，平行制备6份。取各杂质对照品适量，精密称定，用稀释剂溶解并定量稀释成1μg/ml的溶液，作为杂质对照溶液，分别精密量取杂质对照溶液和供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各已知杂质的含量，结果表4。
表4重复性试验结果
试验结果表明：本测定方法重复性良好；
（4）回收率试验
采用加样回收法测定各加入杂质回收率，验证本法测定结果准确度。取本品研磨成细粉，精密称取细粉175mg至100ml量瓶中，平行九份，分别按有关物质测定浓度（0.5mg/ml）的0.10%、0.20%、0.30%加入已知杂质，加适量甲醇超声使溶解后，用甲醇稀释至刻度作为供试品溶液；另取各杂质对照品适量，精密称定，加甲醇稀释制成1μg/ml的溶液，作为杂质对照溶液，分别精密量取杂质对照溶液和供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各已知杂质的测得量，计算其回收率；
（5）杂质定量限和检测限
参照本品原料10号资料。取中间体ⅱa、ⅱb、中间体ⅲ、中间体ⅳ、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e和托匹司他对照品，甲醇溶解后用起始比例甲醇逐级稀释，再精密量取各稀释液，照上述色谱条件依次进样20μl，记录色谱图，按信噪比3:1计算本品及各杂质的检测限，按信噪比10:1计算本品及各杂质的定量限。结果见表5。
表5杂质检测限和定量限测定结果
数据表明，本品各杂质的定量限浓度均在报告限度0.05%（0.25μg/ml）以下，即表明采用上述色谱条件可有效地检出上述各工艺杂质。
实施例5有关物质测定方法的确定
取本品细粉适量，精密称定，用甲醇超声溶解并定量稀释制成每1ml中约含托匹司他0.5mg的溶液，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、托匹司他对照品适量用甲醇溶解并用流动相a定量稀释制成约1μg/ml的溶液，作为系统适用性溶液。照高效液相色谱法试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以20mmol/l磷酸二氢钾（用磷酸调节ph至3.2）为流动相a，乙腈为流动相b，按下表进行梯度洗脱，检测波长为270nm。精密量取系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，杂质a、杂质b、杂质c、托匹司他、杂质d依次出峰，主峰与相邻杂质峰的分离度应大于1.5。精密量取供试品溶液和对照溶液各20µl，分别注入液相色谱议，记录色谱图，扣除溶剂峰后，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，杂质a、杂质b、杂质c、杂质d峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍(0.2%)；其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍(0.2%)；扣除空白溶剂峰后各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积1.0倍(1.0%)。
实施例6样品有关物质的检测
按本品有关物质测定方法对九批中试样品有关物质进行测定，结果见表6。
表6中试样品有关物质检测结果
结果表明：本品九批中试样品有关物质均符合要求。
1.新药托匹司他片的有关物质测定方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取本品细粉适量，精密称定，用甲醇超声溶解并定量稀释制成每1ml中约含托匹司他0.5mg的溶液，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
（2）对照溶液的制备：精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；
（3）系统适用性溶液的制备：取杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、托匹司他对照品适量用甲醇溶解并用流动相a定量稀释制成约1μg/ml的溶液，作为系统适用性溶液；
（4）有关物质测定：照高效液相色谱法试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以20mmol/l磷酸二氢钾（用磷酸调节ph至3.2）为流动相a，乙腈为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长为270nm，精密量取系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，杂质a、杂质b、杂质c、托匹司他、杂质d依次出峰，主峰与相邻杂质峰的分离度应大于1.5，精密量取供试品溶液和对照溶液各20µl，分别注入液相色谱议，记录色谱图。
技术总结