技术领域：
本发明涉及基于生态化学计量平衡干扰的化感抑制机制的验证方法，属于群落生态学中种间竞争的相关领域。
背景技术：
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生态化学计量平衡理论是生态化学计量学中解释有关种群动态和群落稳定的重要理论，其中，生态化学计量平衡既包括植物体内碳(c)、氮(n)、磷(p)含量的平衡稳定，又包括c/n、c/p、n/p间比例的平衡稳定。该理论认为维持生态化学计量平衡，生物方可正常生长；反之，生物生长异常，甚至死亡。然而，生物维持其自身生态化学计量平衡的能力是有限的。外部某些环境的变化常诱发植物养分的平衡需求与环境供给间错配，进而通过干扰植物生态化学计量平衡，抑制其正常生长，甚至导致该种群的退化。
对于化感受体植物而言，化感植物对其的化感作用事实上就是一种外界环境的变化，同时研究还发现，某些化感植物常通过释放的酚酸类化感物质，限制受体植物对n或p的吸收。因此，有理由认为，这些化感植物可以通过化感物质释放→限制受体植物的养分吸收→诱发受体植物养分错配→干扰受体植物生态化学计量平衡→抑制受体植物生长，即化感作用或许通过干扰受体植物的生态化学计量平衡而抑制其生长。若果真如此，它将揭示化感抑制的一个新机制。那么，利用什么方法及实验材料可验证这一机制是否存在呢？
虉草和芦苇同为极具竞争力的根茎类禾本科克隆植物，常分布于各类自然湿地，形成单一的虉草群落或芦苇群落。但有研究显示，在长江中下游的滨江湿地植被演替过程中，常呈现出虉草群落→虉草-芦苇群落→芦苇群落的演替序列，即在此过程中，芦苇种群可通过种间竞争替代虉草种群。而进一步研究发现，芦苇正是通过酚酸类化感物质的释放抑制虉草的生长，进而实现对虉草种群的替代。因此，本发明将选择芦苇这一强化感植物为化感供体植物，虉草为化感受体植物，验证基于生态化学计量平衡干扰效应的化感抑制新机制是否确实存在。即本技术将提供一种基于生态化学计量平衡干扰的化感抑制机制的验证方法。
技术实现要素：
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技术问题：本发明将通过测试共存状态下虉草-芦苇群落内的芦苇酚酸类化感物质的释放及其对虉草生态化学计量平衡的干扰和生长抑制，验证基于生态化学计量平衡干扰效应的化感抑制新机制是否确实存在。因此，本技术方法的提供将对化感抑制新理论的探索具有重要的推动作用。
技术方案：为实现以上目的，本发明将按照下述步骤进行：
(1)样地选择
首先，于长江中下游滨江湿地虉草芦苇共存区域内，按照芦苇密度由低到高，设置2-3个具有明显密度梯度的样地，分别代表样地内虉草承受化感强度由弱到强。然后，在单一虉草群落内，选择一样地作为无化感作用的对照。每个样地内设3个面积为1m2的样方，代表3次重复。
(2)指标测定
测定时间选择在4月下旬，此时虉草和芦苇均处于生长旺盛期，化感作用最为明显。测定指标主要包括化感供体释放到土壤中的酚酸类化感物质含量、化感受体植物叶片的有机c、n、p的含量及其地上部分单株生物量。
虉草叶片c、n、p的含量测定：在每个样方内取5-7株长势一致的虉草植株，自上而下采集3-5片展开叶，带回实验室，测量其叶片的c、n、p含量。其中，有机c、全n、全p分别采用重铬酸钾氧化-分光光度法、凯氏定氮法和碱熔-钼锑抗分光光度法测量。
生物量测定：在每个样方另选8-10株长势均匀的虉草，收割地上部分称其鲜重，然后取每株均值。这样便得到不同化感强度下生长的虉草单株地上部分生物量。
土壤总酚酸含量测定：在每个样方内取3-5个取土点，用土钻取0-30cm土层的土样(虉草根系多分布于此)，带回实验室，用磷钼酸-磷钨酸盐比色法测土壤总酚酸的含量。
(3)生态化学计量平衡干扰分析
①平衡状态下虉草的生态化学计量特征及生长特征
在单一虉草群落内，正常生长的虉草不会受到芦苇的化感抑制作用，其生态化学计量特征基本处于平衡状态。按照以上方法，分别测定出虉草叶片c、n、p的含量及c/n、c/p、n/p值，从而得到无芦苇化感抑制且处于平衡状态下的虉草生态化学计量特征；同时测量出该状态下虉草的地上部分单株生物量。分别以该状态下虉草生态化学计量特征和单株生物量为对照，验证不同强度化感作用(即不同芦苇密度)对共存虉草生态化学计量平衡的干扰及生长抑制。
②不同强度化感作用下虉草生态化学计量特征及生长特征
在不同样地内，分别测定出土壤0-30cm土层内总酚酸类物质的含量，定量表征化感强度的强弱；测定出与芦苇共存虉草叶片c、n、p的含量及c/n，c/p，n/p值，定量表征不同强度化感作用下虉草的生态化学计量特征；同时测量出该状态下虉草的地上部分单株生物量。
③不同强度化感作用对虉草生态化学计量平衡干扰及生长抑制分析
变异系数是统计学上用来反映一组数据间的离散程度，其公式为
式中cv为变异系数，s和
在本发明方法中，其部分环节需明确化感作用对虉草生态化学计量平衡干扰，而这种干扰通常需以平衡状态为参照，因此，本方法提出相对变异系数概念，即相对于平衡状态下生态化学计量特征，受干扰后的生态化学计量特征的变异状况。其公式如下：
式中rcv为变异系数，xi是受干扰组数据中的第i个数据，n是受干扰组数据的个数，
利用以上公式，计算不同强度化感作用下虉草叶片c、n、p含量及c/n、c/p、n/p等参数相对于平衡状态下虉草叶片以上各参数的相对变异系数，反映不同强度化感作用对虉草生态化学计量平衡的干扰程度；再以不同强度化感作用下虉草地上部分单株生物量相对于平衡状态下虉草单株生物量的相对变异系数，反映不同强度化感作用对虉草生长抑制程度。
(4)验证基于生态化学计量平衡干扰的化感抑制机制。
根据不同强度化感作用对虉草生态化学计量平衡干扰强度和生长抑制强度的大小，结合化感强度、生态化学计量平衡干扰和生长抑制等指标间的相关分析，验证基于生态化学计量平衡干扰效应的化感抑制机制是否存在。若干扰和抑制强度大，以上三类指标间相关性强，以上新机制则存在；反之，新机制不存在。
综上所述，本发明的有益效果：
化感作用的抑制机制复杂多样，本发明沿着“化感物质含量→生态化学计量平衡干扰→植物生长抑制”主线，利用相对变异系数这一概念，验证基于生态化学计量平衡干扰的化感抑制机制。
具体实施方式
实施地点位于长江下游沿江城市镇江市滨江湿地，它是由长江江水携带泥沙常年淤积形成。湿地植被演替呈现裸滩→虉草群落→虉草-芦苇群落→芦苇群落的演替进程。在芦苇群落替代虉草群落的过程中，芦苇密度逐步增加，直至密度高达40株/m2，虉草消失。具体步骤为：
1、样地选择
在滨江湿地的虉草-芦苇群落内，按照芦苇密度由低到高，设置2个样地，芦苇密度分别为10-12株/m2和24-26株/m2，分别代表由弱到强的两个化感强度处理，即t1和t2两个处理。然后，在单一的虉草群落内，选择一样地作为无化感作用的对照处理ck。在以上三个不同样地代表内再分别取3个面积为1m2的样方，代表3次重复。
2、指标测定
4月24日，赴湿地取样，进行系列指标测量和测定，其中，
虉草叶片c、n、p含量测定：在每个样方内取5株长势一致的虉草，自上而下采集5片展开叶，带回实验室，测量其叶片的有机碳、全氮和全磷的含量。其中，c、n、p含量分别采用重铬酸钾氧化-分光光度法、凯氏定氮法和碱熔-钼锑抗分光光度法测量。
生物量测定：在每个样方筛选10株长势均匀的虉草，收割地上部分称其鲜重，然后取每株均值。
土壤总酚酸含量测定：在每个样方内选3个取土点，根据虉草根系多分布在0-30cm土层这一特性，用土钻取0-30cm土层的土样，带回实验室，用磷钼酸-磷钨酸盐比色法测土壤总酚酸的含量。
3、不同密度芦苇下土壤总酚酸类物质含量的变化
酚酸是最常见的化感物质，土壤中含量的高低常用以表征化感强度的强弱。由不同芦苇密度下(即不同化感强度下)土壤总酚酸类物质的含量(表1)可知，在无芦苇的单一虉草群落内，土壤虽含有少量的酚酸类物质，但随着芦苇的侵入及其密度增加，土壤内其含量显著上升，即芦苇密度增加对土壤总酚酸含量升高效应明显，这表明本方法利用芦苇密度的差异表征化感作用的强弱科学合理。
表1不同芦苇密度下总酚酸含量
注：不同小写字母代表不同处理间的差异显著(p<0.05)
4、不同强度化感作用对虉草生态化学计量平衡干扰及生长抑制分析
由表2可知，随化感作用增强，虉草叶片的c、n含量显著增加，而p含量下降，c/p和n/p的计量比则持续上升，c/n的计量比则因c、n的增幅不同而出现一定波动；虉草地上部分单株生物量则随化感作用增强显著降低。这表明芦苇的化感作用已明显干扰了虉草的生态化学计量平衡，并进而显著抑制其正常生长。
利用本发明提出的相对变异系数公式分别计算不同化感强度下虉草生态化学计量比及生长等指标的相对变异系数，用以反映不同化感强度对虉草生态化学计量平衡的干扰和生长的抑制。
(1)不同化感强度下虉草c含量的相对变异系数
①化感强度较弱的t1处理
c含量：ck处理下三次重复值分别为473.91g·kg-1、468.34g·kg-1、471.14g·kg-1，均值
t1处理下三次重复值分别为485.62g·kg-1、491.20g·kg-1、492.46g·kg-1
则标准差
②化感强度较强的t2处理
c含量：ck均值同上
t2处理下三次重复值分别为483.80g·kg-1、499.87g·kg-1、486.92g·kg-1
则标准差
(2)不同化感强度下虉草n、p、c/n、c/p、n/p和地上部分单株生物量的相对变异系数
各指标相对变异系数计算方法同上，具体数值如表2所示。结果发现，随着化感作用增强，生态化学计量各参数及地上部分单株生物量的相对变异系数均逐渐上升，这表明化感作用增强对虉草生态化学计量平衡干扰和生长抑制效应愈发明显。而较强化感作用下n、c/p、n/p等化学计量参数和虉草地上部分单株生物量的相对变异系数甚至高达15％以上，则表明化感作用对虉草生态化学计量平衡干扰和生长抑制的程度之深。
表2不同芦苇密度下虉草叶片碳、氮、磷含量及其计量比特征
注：rcv表相对变异系数，不同小写字母代表不同处理间的差异显著(p<0.05)
5、验证基于生态化学计量平衡干扰效应的化感抑制机制
化感作用的抑制机制复杂多样，通过对土壤总酚酸含量(不同化感强度)、虉草生态化学计量平衡干扰和生长抑制等指标间的相关性分析(表3)后发现，样地土壤总酚酸含量不仅与虉草c、p和c/n显著相关(正或负)，而且还与n、c/p、n/p极显著正相关，且与生物量极显著负相关；生物量与除c以外的各生态化学计量参数均呈显著或极显著相关关系，表明酚酸通过干扰虉草生态化学计量平衡，进而抑制其生长。因此，以芦苇和虉草为实验材料，利用本专利所提供的方法，最终可以验证基于生态化学计量平衡干扰效应的化感抑制机制。
表3土壤总酚酸含量、虉草叶片生态化学计量特征及其地上单株生物量间相关性分析
注：＊表示显著相关(p<0.05)；＊＊表示极显著相关(p<0.01)。
1.基于生态化学计量平衡干扰的化感抑制机制的验证方法，其特征在于按照下述步骤进行：
(1)样地选择
首先，于长江中下游滨江湿地虉草芦苇共存区域内，按照芦苇密度由低到高，设置2-3个具有明显密度梯度的样地，分别代表样地内虉草承受化感强度由弱到强；然后，在单一虉草群落内，选择一样地作为无化感作用的对照；每个样地内设3个面积为1m2的样方，代表3次重复；
(2)指标测定
测定时间选择在4月下旬，此时虉草和芦苇均处于生长旺盛期，化感作用最为明显；测定指标主要包括化感供体释放到土壤中的酚酸类化感物质含量、化感受体植物叶片的有机c、n、p的含量及其地上部分单株生物量；
虉草叶片c、n、p的含量测定：在每个样方内取5-7株长势一致的虉草植株，自上而下采集3-5片展开叶，带回实验室，测量其叶片的c、n、p含量；其中，有机c、全n、全p分别采用重铬酸钾氧化-分光光度法、凯氏定氮法和碱熔-钼锑抗分光光度法测量；
生物量测定：在每个样方另选8-10株长势均匀的虉草，收割地上部分称其鲜重，然后取每株均值；这样便得到不同化感强度下生长的虉草单株地上部分生物量；
土壤总酚酸含量测定：在每个样方内取3-5个取土点，用土钻取0-30cm土层的土样(虉草根系多分布于此)，带回实验室，用磷钼酸-磷钨酸盐比色法测土壤总酚酸的含量；
(3)生态化学计量平衡干扰分析
①平衡状态下虉草的生态化学计量特征及生长特征
在单一虉草群落内，正常生长的虉草不会受到芦苇的化感抑制作用，其生态化学计量特征基本处于平衡状态；按照以上方法，分别测定出虉草叶片c、n、p的含量及c/n、c/p、n/p值，从而得到无芦苇化感抑制且处于平衡状态下的虉草生态化学计量特征；同时测量出该状态下虉草的地上部分单株生物量；分别以该状态下虉草生态化学计量特征和单株生物量为对照，验证不同强度化感作用(即不同芦苇密度)对共存虉草生态化学计量平衡的干扰及生长抑制；
②不同强度化感作用下虉草生态化学计量特征及生长特征
在不同样地内，分别测定出土壤0-30cm土层内总酚酸类物质的含量，定量表征化感强度的强弱；测定出与芦苇共存虉草叶片c、n、p的含量及c/n，c/p，n/p值，定量表征不同强度化感作用下虉草的生态化学计量特征；同时测量出该状态下虉草的地上部分单株生物量；
③不同强度化感作用对虉草生态化学计量平衡干扰及生长抑制分析
变异系数是统计学上用来反映一组数据间的离散程度，其公式为
式中cv为变异系数，s和
在本发明方法中，其部分环节需明确化感作用对虉草生态化学计量平衡干扰，而这种干扰通常需以平衡状态为参照，因此，本方法提出相对变异系数概念，即相对于平衡状态下生态化学计量特征，受干扰后的生态化学计量特征的变异状况；其公式如下：
式中rcv为变异系数，xi是受干扰组数据中的第i个数据，n是受干扰组数据的个数，
利用以上公式，计算不同强度化感作用下虉草叶片c、n、p含量及c/n、c/p、n/p等参数相对于平衡状态下虉草叶片以上各参数的相对变异系数，反映不同强度化感作用对虉草生态化学计量平衡的干扰程度；再以不同强度化感作用下虉草地上部分单株生物量相对于平衡状态下虉草单株生物量的相对变异系数，反映不同强度化感作用对虉草生长抑制程度；
(4)验证基于生态化学计量平衡干扰的化感抑制机制；
根据不同强度化感作用对虉草生态化学计量平衡干扰强度和生长抑制强度的大小，结合化感强度、生态化学计量平衡干扰和生长抑制等指标间的相关分析，验证基于生态化学计量平衡干扰效应的化感抑制机制是否存在；若干扰和抑制强度大，以上三类指标间相关性强，以上新机制则存在；反之，新机制不存在。
技术总结