本发明涉及植物源驱避剂，尤其涉及一种对桃蛀螟具有驱避作用的挥发性活性化合物的测定方法及应用。
背景技术：
桃蛀螟(conogethespunctiferalisguenée)隶属于鳞翅目、草螟科，以幼虫蛀食板栗、桃、向日葵等果实为害，是一种重要且难以防治的钻蛀性害虫。近年来，伴随我国农业产业结构的调整，桃蛀螟的危害也日趋严重。如在黄淮海夏玉米产区和西南山地夏玉米，桃蛀螟在玉米果穗上的种群数量迅速增加，致使其为害程度超过亚洲玉米螟(ostriniafurnacalis)，成为当地夏玉米穗期的主要害虫。而且由于现阶段对桃蛀螟的防治主要依靠化学农药，造成害虫抗药性产生、生态环境污染等问题。因此，寻求一种环境友好、经济有效的绿色防控技术，实现桃蛀螟的田间有效控制，是亟需解决的问题。
近年来通过利用寄主植物挥发性化合物设计特异性引诱剂或驱避剂调控昆虫行为已发展成为害虫绿色防控的一项重要措施。目前，已有应用性信息素或寄主植物挥发性化合物设计引诱剂，进行桃蛀螟田间防治的实例。
但到目前为止，国际上已开发关于桃蛀螟性信息素诱剂配方和利用寄主植物挥发物作为引诱剂的报道，但是有关桃蛀螟驱避剂尚未见报道。
技术实现要素：
基于现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种对桃蛀螟具有驱避作用的挥发性活性化合物的测定方法及应用，能解决目前因没有一种能驱避桃蛀螟的药剂而无法更好地使用“推-拉策略”对桃蛀螟进行田间防治的问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明实施方式提供一种对桃蛀螟具有驱避作用的挥发性活性化合物的测定方法，包括以下步骤：
步骤1，利用顶空动态气体采样法收集花期和成熟期向日葵花盘挥发物，采用气相色谱-质谱联用仪对收集到的所述挥发物进行鉴定，确定出所述向日葵花盘挥发物种类；
步骤2，通过对两个时期的向日葵花盘挥发物成分进行比较分析，从中筛选出十二种两个时期所特有的且两者间含量变化比较大的化合物：d-柠檬烯(d-limonene)、邻苯二甲酸二乙酯(diethylphthalate)、正十五烷(pentadecane)、莰烯(camphene)、β-水芹烯(β-phellandrene)、萜品油烯(terpinolene)、萜品烯(γ-terpinen)、α-水芹烯(α-phellandrene)、桉叶油醇(eucalyptol)、(1s)-(-)-β-蒎烯((1s)-(-)-β-pinene)和柠檬烯(limonene)作为后续对桃蛀螟具有活性的的测试样品；
步骤3，通过桃蛀螟y型嗅觉仪行为测试，对选出作为测试样品的十二种化合物分别进行测定，确定其中的β-水芹烯在浓度为0.01(v/v)时对桃蛀螟具有驱避作用，能作为桃蛀螟的驱避剂。
本发明实施方式还提供一种体积浓度为0.01(v/v)的β-水芹烯作为对桃蛀螟雌蛾进行驱避的驱避剂的应用。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的对桃蛀螟具有驱避作用的挥发性活性化合物的测定方法及应用，其有益效果为：
该方法从向日葵花盘挥发物组分中准确测定出β-水芹烯对桃蛀螟雌蛾具有很好的驱避作用，能作为桃蛀螟的植物源驱避剂，用于该虫的田间防治，对田间桃蛀螟种群控制具有重要作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1为本发明实施例提供的测定方法中的桃蛀螟y型嗅觉仪行为反应测试结果图，其中，化合物体积浓度均为0.01(v/v)，*表示待测化合物与对照间差异显著，**表示待测化合物与对照间差异极显著。
具体实施方式
下面结合本发明的具体内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。本发明实施例中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
本发明实施例一种对桃蛀螟具有驱避作用的挥发性活性化合物的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，利用顶空动态气体采样法分别收集花期和成熟期的向日葵花盘挥发物，并采用气相色谱-质谱联用仪对收集到的所述挥发物种类进行鉴定；
步骤2，通过对花期和成熟期的向日葵挥发物进行比较分析，选择两个时期各自特有的以及两者间含量变化比较大的挥发物(共计12种)，进行桃蛀螟雌蛾行为反应测试，这12种化合物分别为d-柠檬烯(d-limonene)、邻苯二甲酸二乙酯(diethylphthalate)、正十五烷(pentadecane)、莰烯(camphene)、β-水芹烯(β-phellandrene)、萜品油烯(terpinolene)、萜品烯(γ-terpinen)、α-水芹烯(α-phellandrene)、桉叶油醇(eucalyptol)、(1s)-(-)-β-蒎烯((1s)-(-)-β-pinene)和柠檬烯(limonene)。
步骤3，利用y型嗅觉仪测试桃蛀螟已交配雌蛾对步骤2筛选出来的12种化合物的行为反应，确定其中的β-水芹烯在浓度为0.01(v/v)时对桃蛀螟具有显著的驱避作用，能作为桃蛀螟驱避剂加以利用。
所述方法步骤1中，利用顶空动态气体采样法分别收集花期和成熟期的向日葵花盘挥发物为：
采用动态顶空吸附与溶剂洗脱相结合的方式分别收集花期和成熟期的向日葵花盘挥发物，其中，动态顶空吸附所用的吸附剂使用前在170℃下活化2h，然后用99.5％甲醇、99.9％无水乙醚和99.9％色谱纯正已烷各3ml淋洗、吹干；
采集结束后，用350μl色谱纯正已烷洗脱被所述吸附剂吸附的挥发物，然后吸取200μl洗脱液置于2ml色谱瓶中，并向其中加入浓度为0.48mg/μl的乙酸正壬酯1μl作为内标，用漩涡仪充分震荡摇匀，置-18℃冷藏柜保存备用，即完成向日葵花盘挥发物的采集。
上述测定方法中，所述采用动态顶空吸附与溶剂洗脱结合的方式收集日葵花盘挥发物的方式具体为：
由大气采样仪抽出空气并监测气体流量，使气体流量保持在450～600ml/min的范围内，空气依次进入蒸馏水瓶、活性炭过滤瓶，气体沿teflon管通过装有向日葵花盘的火鸡袋，袋口另一端接入装有50mg吸附剂的吸附柱，待吸附剂吸附、捕集向日葵花盘挥发物后，剩余气体再通过一个面板式气体流量计监测出气端气体流量，保持在350～450ml/min的范围内，不同部件间用洁净的乳胶管进行无缝连接，整套装置持续抽提4h。
所述方法的步骤1中，采用气相色谱-质谱联用仪对收集到的挥发物种类进行鉴定：
采用气相色谱-质谱联用仪对收集到的所述挥发物进行定性和定量分析，分析条件如下：毛细管柱为db-5；氦气作为载气，流速26cm/s；进样量为1μl，不分流进样；进样温度为250℃；程序升温为：先37℃保持6min；再以2℃/min的升温速率从37℃升至70℃，保持5min；再以5℃/min的升温速率从70℃升至20℃，保持5min；平衡0.5min，气谱-质谱接口温度为280℃，质谱离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃，电离能为70ev，扫描范围为30～300m/z；
通过与nist图库中的质谱图比对，对提取的挥发物组分进行定性分析；
部分化合物通过与购买的标准化合物的保留时间与质谱图进一步核实；
通过化合物峰面积与内标化合物峰面积的比较进行折算，得到各组分的相对含量和绝对含量；
根据对所述挥发物进行定性和定量分析，分别得出花期和成熟期向日葵花盘挥发物的成分组成。通过对两个时期的挥发物成分进行比较分析，从中选出两个时期各自特有的，以及两者间含量变化比较大的挥发物(共计12种)，进行桃蛀螟雌蛾行为反应测试。这12种化合物分别为d-柠檬烯(d-limonene)、邻苯二甲酸二乙酯(diethylphthalate)、正十五烷(pentadecane)、莰烯(camphene)、β-水芹烯(β-phellandrene)、萜品油烯(terpinolene)、萜品烯(γ-terpinen)、α-水芹烯(α-phellandrene)、桉叶油醇(eucalyptol)、(1s)-(-)-β-蒎烯((1s)-(-)-β-pinene)和柠檬烯(limonene)。通过后续行为反应测试，探讨这12种挥发性化合物是否具有生物活性。
参见图1，所述方法的步骤3中，采用的桃蛀螟y型嗅觉仪行为反应测试为：
用移液枪取已配好的待测样品10μl滴于w型滤纸片上，随机放入y型嗅觉仪的一个侧臂前端的玻璃帽内，另一玻璃帽内放入滴加了10μl液体石蜡的w型滤纸片作为对照，让干净空气流通于臂内10min，流速为300ml/min；
将预先准备好的一头已交配桃蛀螟雌蛾引入所述y型嗅觉仪的主臂，记录所述桃蛀螟雌蛾的选择行为，每次测试一头已交配桃蛀螟雌蛾，每个测试样品共测试50头已交配桃蛀螟雌蛾，当桃蛀螟雌蛾爬过某侧臂三分之一处并持续30s以上视为选择，2min内无反应则记为不选择。
本发明实施例一种体积浓度为0.01(v/v)的β-水芹烯作为对桃蛀螟雌蛾具有驱避作用的驱避剂的应用。
本发明的方法从向日葵花盘挥发物组分中准确测定出β-水芹烯(0.01v/v)对桃蛀螟雌蛾具有很好的驱避作用，能作为植物源的桃蛀螟驱避剂，用于该虫的田间防治，对田间桃蛀螟种群控制具有重要作用。
下面对本发明实施例具体作进一步地详细描述。
本发明实施例提供一种对桃蛀螟具有驱避作用的挥发性活性化合物的测定方法，包括以下步骤：
步骤1)首先利用顶空动态气体采样法分别收集花期和成熟期向日葵花盘挥发物，并采用气相色谱-质谱(gc-ms)联用仪对收集到的两个时期的向日葵花盘挥发物分别进行定性和定量分析；继而通过比较向日葵花期和成熟期挥发物组分的差异，选择两个时期各自特有的，以及两者间含量变化比较大的挥发物(共计12种)进行试验测定，最后根据y型嗅觉仪行为实验确定对桃蛀螟具有驱避作用的向日葵花盘挥发物组分；
步骤2)确定所述桃蛀螟植物源驱避剂成分及适宜浓度为β-水芹烯(0.01v/v)，所述β-水芹烯为97％以上的标准品，这种纯度高，不含其它杂质。
上述方法的具体步骤为：
步骤1.从向日葵花盘中提取植物挥发性气味化合物：
实验采集向日葵花盘挥发性气味化合物：每次采集设3次重复，一组对照。
由于动态顶空吸附法能够捕集活体动、植物的挥发物,并可对微量化合物进行定性和定量分析,测定结果能真实地反映被测活体动、植物所释放的化学组分及其比例,携带方便,适合野外操作，所以，本实验中向日葵花盘挥发物的收集采用动态顶空吸附与溶剂洗脱相结合的方法进行。其中，吸附剂在使用前先在170℃下活化2h，然后用99.5％甲醇、99.9％无水乙醚和99.9％色谱纯正已烷各3ml淋洗、吹干。具体过程为：由大气采样仪抽出空气并监测气体流量(使其保持在450-600ml/min范围内)，空气依次进入蒸馏水瓶、活性炭过滤瓶，气体沿teflon管通过装有向日葵花盘的火鸡袋，袋口另一端接入装有50mg吸附剂的吸附柱，待吸附剂将向日葵花盘挥发物捕集后，剩余气体再通过一个面板式流量计，以监测出气端气体流量(保持在350-450ml/min的范围内)。不同部件间用洁净的乳胶管进行无缝连接，整套装置持续抽提4h。
采集结束后，立即用350μl色谱纯正已烷洗脱被吸附剂吸附的挥发物，然后吸取200μl洗脱液置于2ml色谱瓶中，并向其中加浓度为0.48mg/μl的乙酸正壬酯1μl作为内标，用漩涡仪充分震荡摇匀，置-18℃冷藏柜保存备用。
步骤2.化合物的鉴定：
挥发物的定性和定量采用气相色谱-质谱(gc-ms)联用仪。分析条件如下：毛细管柱为db-5(polyethyleneglycol20000,60m×0.25mm×0.15μm,agilent，美国)。氦气作载气，流速26cm/s。进样量1μl，不分流进样。进样温度250℃。程序升温为：先37℃保持6min；再以2℃/min的升温速率从37℃升至70℃，保持5min；再以5℃/min的升温速率从70℃升至20℃，保持5min。平衡0.5min，气谱/质谱接口温度280℃，质谱离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电离能70ev，扫描范围30–300m/z。通过与nist图库中的质谱图比对，对提取的挥发物组分进行定性。部分化合物还通过与购买的标准化合物的保留时间与质谱图进一步核实。通过化合物峰面积与内标化合物峰面积的比较进行折算，从而得到各组分的相对含量和绝对含量。
参见表1，步骤3.花期和成熟期向日葵挥发物的比较分析，待测化合物的筛选：
通过对两个时期的挥发物成分进行比较分析，从中选出两个时期各自特有的挥发物，以及两者间含量变化比较大的挥发物(共计12种)，进行桃蛀螟雌蛾行为反应测试。这12种化合物分别为d-柠檬烯(d-limonene)、邻苯二甲酸二乙酯(diethylphthalate)、正十五烷(pentadecane)、莰烯(camphene)、β-水芹烯(β-phellandrene)、萜品油烯(terpinolene)、萜品烯(γ-terpinen)、α-水芹烯(α-phellandrene)、桉叶油醇(eucalyptol)、(1s)-(-)-β-蒎烯((1s)-(-)-β-pinene)和柠檬烯(limonene)。
参见图1，步骤4.桃蛀螟已交配雌蛾进行y型嗅觉仪行为反应测试：用移液枪取已配好的待测样品10μl滴于“w”型滤纸片上，随机放入一个侧臂前端的玻璃帽内，另一玻璃帽内放入滴加了10μl液体石蜡的“w”型滤纸片作为对照，让干净空气流通于臂内10min，流速为300ml/min。将预先准备好的已交配桃蛀螟雌蛾一头引入y型嗅觉仪主臂，观察雌蛾的选择行为。每次测试1头雌蛾，每个样品共测试50头已交配桃蛀螟雌蛾。当桃蛀螟雌蛾爬过某侧臂三分之一处并持续30s以上视为选择，2min内无反应则记为不选择。
结果和分析如下：
(1)向日葵挥发物组分的鉴定：
采用气相色谱-质谱(gc-ms)联用仪分析、鉴定向日葵挥发物的主要化合物成分。
花期向日葵花盘挥发物的出峰时间多分布在15-25min、30-35min和39-45min这三个时段，共检测到49种化合物(含内标共50种，参见下表1)；成熟期向日葵挥发物出峰时间大多集中分布于10-16min和18-23min两个阶段，共检测到45种化合物(含内标共46种，参见下表1)。通过对两个时期的挥发物种类进行比较分析，从中选出两个时期各自特有的，以及两者间含量变化比较大的挥发物(共计12种)：d-柠檬烯(d-limonene)、邻苯二甲酸二乙酯(diethylphthalate)、正十五烷(pentadecane)、莰烯(camphene)、β-水芹烯(β-phellandrene)、萜品油烯(terpinolene)、萜品烯(γ-terpinen)、α-水芹烯(α-phellandrene)、桉叶油醇(eucalyptol)、(1s)-(-)-β-蒎烯((1s)-(-)-β-pinene)和柠檬烯(limonene)，将这些挥发物作为备选物质开展后续的行为实验。
(2)活性化合物的筛选：
用y-型嗅觉仪测定桃蛀螟成虫对单一化合物的行为反应，筛选出对桃蛀螟雌蛾具有驱避活性的化合物组分。
对已交配桃蛀螟雌蛾进行y型嗅觉仪行为测试，发现在浓度为0.01(v/v)时，β-水芹烯对已交配雌蛾具有明显的驱避作用。
通过上述数据可以看出，本发明从桃蛀螟寄主植物-向日葵花盘中提取的挥发性活性化合物中测定出的β-水芹烯在浓度为0.01(v/v)时，对桃蛀螟雌蛾有明显的驱避作用。可以应用于桃蛀螟田间种群防治，而且经济有效、无环境污染等问题。
综上所述，本发明的测定方法成功筛选获得适用于桃蛀螟驱避剂的驱避成分，可用于桃蛀螟成虫防治，解决幼虫期药剂防治效果不理想和化学农药造成环境污染等问题。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
1.一种对桃蛀螟具有驱避作用的挥发性活性化合物的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，利用顶空动态气体采样法收集花期和成熟期向日葵花盘挥发物，采用气相色谱-质谱联用仪对收集到的所述挥发物进行鉴定，确定出所述向日葵花盘挥发物种类；
步骤2，通过对两个时期的向日葵花盘挥发物成分进行比较分析，从中筛选出十二种两个时期所特有的且两者间含量变化大的化合物：d-柠檬烯、邻苯二甲酸二乙酯、正十五烷、莰烯、β-水芹烯、萜品油烯、萜品烯、α-水芹烯、桉叶油醇、(1s)-(-)-β-蒎烯和柠檬烯作为后续对桃蛀螟具有活性的的测试样品；
步骤3，通过桃蛀螟y型嗅觉仪行为测试，对选出作为测试样品的十二种化合物分别进行测定，确定其中的β-水芹烯在浓度为0.01v/v时对桃蛀螟具有驱避作用，能作为桃蛀螟的驱避剂。
2.根据权利要求1所述的对桃蛀螟具有驱避作用的挥发性活性化合物的测定方法，其特征在于，所述方法步骤1中，利用顶空动态气体采样法收集向日葵花盘的挥发物为：
采用动态顶空吸附与溶剂洗脱结合的方式分别收集花期和成熟期的向日葵花盘挥发物，其中，动态顶空吸附所用的吸附剂使用前在170℃下活化2h，然后用99.5％甲醇、99.9％无水乙醚和99.9％色谱纯正已烷各3ml淋洗、吹干；
采集结束后，用350μl色谱纯正已烷洗脱被所述吸附剂吸附的挥发物，然后吸取200μl洗脱液置于2ml色谱瓶中，并向其中加入浓度为0.48mg/μl的乙酸正壬酯1μl作为内标，用漩涡仪充分震荡摇匀，置-18℃冷藏柜保存备用，即完成向日葵花盘的挥发物的采集。
3.根据权利要求2所述的对桃蛀螟具有驱避作用的挥发性活性化合物的测定方法，其特征在于，所述采用动态顶空吸附与溶剂洗脱结合的方式收集向日葵花盘挥发物的方式具体为：
由大气采样仪抽出空气并监测气体流量，使气体流量保持在450～600ml/min的范围内，空气依次进入蒸馏水瓶、活性炭过滤瓶，气体沿teflon管通过装有向日葵花盘的火鸡袋，袋口另一端接入装有50mg吸附剂的吸附柱，待吸附剂将向日葵花盘的挥发物捕集后，剩余气体再通过一个面板式流量计监测出气端气体流量，保持在350～450ml/min的范围内，不同部件间用洁净的乳胶管进行无缝连接，整套装置持续抽提4h。
4.根据权利要求1至3任一项所述的对桃蛀螟具有驱避作用的挥发性活性化合物的测定方法，其特征在于，所述方法的步骤1中，采用气相色谱-质谱联用法对收集到的所述挥发物进行分析为：
采用气相色谱-质谱联用法对收集到的所述挥发物进行定性和定量分析，分析条件如下：毛细管柱为db-5；氦气作为载气，流速26cm/s；进样量为1μl，不分流进样；进样温度为250℃；程序升温为：先37℃保持6min；再以2℃/min的升温速率从37℃升至70℃，保持5min；再以5℃/min的升温速率从70℃升至20℃，保持5min；平衡0.5min，气谱-质谱接口温度为280℃，质谱离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃，电离能为70ev，扫描范围为30～300m/z；
通过与nist图库中的质谱图比对，对提取的挥发物组分进行定性；
部分化合物通过与购买的标准化合物的保留时间与质谱图进一步核实；
通过化合物峰面积与内标化合物峰面积的比较进行折算，得到各组分的定量；
通过比较分析花期和成熟期向日葵花盘挥发物成分，从中筛选出两个时期各自所特有的以及两者间含量变化大的12种挥发性化合物，包括：d-柠檬烯、邻苯二甲酸二乙酯、正十五烷、莰烯、β-水芹烯、萜品油烯、萜品烯、α-水芹烯、桉叶油醇、(1s)-(-)-β-蒎烯和柠檬烯，作为后续测定的测试样品。
5.根据权利要求1至3任一项所述的对桃蛀螟具有驱避作用的挥发性活性化合物的测定方法，其特征在于，所述方法的步骤3中，采用的桃蛀螟y型嗅觉仪行为测试为：
用移液枪取已配好的待测样品10μl滴于w型滤纸片上，随机放入y型嗅觉仪的一个侧臂前端的玻璃帽内，另一玻璃帽内放入滴加了10μl液体石蜡的w型滤纸片作为对照，让干净空气流通于臂内10min，流速为300ml/min；
将预先准备好的一头已交配桃蛀螟雌蛾引入所述y型嗅觉仪的主臂，记录所述桃蛀螟雌蛾的选择行为，每次测试一头已交配桃蛀螟雌蛾，每个测试样品共测试50头已交配桃蛀螟雌蛾，当桃蛀螟雌蛾爬过某侧臂三分之一处并持续30s以上视为选择，2min内无反应则记为不选择。
6.一种体积浓度为0.01v/v的β-水芹烯作为对桃蛀螟雌蛾进行驱避的驱避剂的应用。
技术总结