本发明涉及一种诊断试剂，特别涉及一种组胺应用于活动性结核病的鉴别与诊断。
背景技术：
结核病(tuberculosis,tb)是由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis,m.tb)感染引发的一种严重威胁人类健康的慢性传染性疾病，是全球十大死亡原因之一，也是单一传染源导致死亡的主要原因。全球将近四分之一的人感染结核分枝杆菌，并长期处于潜伏感染状态，其中5％～10％可能会在一生中发生活动性结核病。从结核分枝杆菌潜伏感染发展到活动性疾病对结核病的传播构成了持久的威胁。从地域上看，2018年大多数结核病病例是在东南亚地区(44％)，其中中国占全球患病人数9％，仅次于印度(27％)。因此对结核感染状态的快速准确诊断是结核病防控的重要组成部分之一。然而由于结核分枝杆菌的自身的细胞壁较厚、脂肪酸含量较高、细胞内寄生等生物学特点，结核病早期以及快速诊断的灵敏度和检出率均较低，一直未有突破进展。尤其是在卫生管理不善和医疗水平薄弱的国家和地区，仍然有将近一半的病原学阴性的结核病人无法得到科学、合理和快速有效的诊断，甚至贻误病情、导致耐药和传播。因此，如何实现结核病患者的早期和快速诊断、研发可用于结核病早期诊断的、新的特异性生物标识物成为我国和世界性的重大公共卫生领域亟需解决的关键科学问题。
目前结核病毒诊断方法有：(一)病原学检查：痰涂菌检查和痰结核菌检查是诊断肺结核“金指标”，简便易行，准确性较高，痰中查出结核菌，就能确诊患了结核病。一般初次就诊要查三个痰标本，即夜间痰、清晨痰和即时痰，结果可信度高，并可以培养结核菌做药敏试验。但诊断率低，培养结核菌需耗费6-8周，周期过长，应用受到限制。(二)x射线检查：胸部x线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受。胸部ct可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般x线检查的不足。但检查价格相对，且容易与其他肺部疾病混淆，需要专业医生进行确诊。(三)肺结核病免疫学诊断：1.结核菌素纯蛋白衍化物(ppd)试验，该试验阳性是常用的感染过结核菌的证据之一，但是假阳性率高，容易误诊。2.血或痰结核抗体检测，血中或痰中抗体阳性也有助于诊断，但易出现假阳率，不能区分潜伏感染和活动性结核。3.bactec法，通过检测结核分枝杆菌的代谢物进行诊断，一般两周可分离出分枝杆菌，但菌量的数量会影响阳性结果出现的时间。4.聚合酶链反应(pcr)，优点是敏感性可达98％-100％，缺点是特异性较差。5.γ-干扰素释放试验(igra)，虽然敏感性和特异性均较高，但价格昂贵针难以实现高通量检测。(四)其他检查：只能作为辅助诊断，不能作为诊断依据。1.纤维支气管镜检查，可以直接观察或间接判断支气管、肺内病变，并且有活组织检查、灌洗、录像、拍摄气管内照片等功能，对于诊断和鉴别诊断特别有用。2.胸腔镜和纵隔镜检查，均可用于观察胸腔、纵隔内肿大淋巴结，并可取出活组织检查以利诊断和鉴别诊断。3.超声波检查，主要用于胸腔积液的诊断和鉴别诊断。
目前的结核病诊断的分子标识研究，主要有结核分枝杆菌和宿主两个方向，但尚不能满足结核诊断的需求。本实验对活动性肺结核患者和潜伏感染患者进行无创性代谢组学分析，在代谢组水平上寻找可用于结核诊断的相关分子标识，并对结核诊断的分子标识研究提供路径。
组胺，结构式如下：
化学式：c5h9n3
分子量：111
组胺是由组氨酸在组氨酸脱羧酶作用下脱羧形成的，是肥大细胞颗粒的主要成分，具有多种免疫活性，在炎症反应中起重要作用，但其作为生物标志在结核病诊断方面尚未有研究。
目前常用的结核病诊断标准一般是细菌学，就是痰查抗氮杆菌阳性或者是痰培养阳性，还有就是通过分子生物学检查，如pcr或者是t-spot检查，如果是阳性，考虑确诊结核病。
本发明在现有技术的基础上，采用生物标志物方法，意外发现一种新的生物标志物，即组胺，由于组胺是人们非常熟悉的物质，检测方法异常简便，费用低廉。为此，本发明提供一种新的结核病诊断方法，即采用组胺作为生物标志物，检测尿液中组胺的含量，并以特定的含量的量值作为诊断指标，低于该指标即判断为阳性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供组胺作为生物标志物在结核病诊断中的应用。本发明首次发现，组胺能够作为诊断活动性结核或潜伏结核感染的生物标志物，并且进一步发现其具有良好的敏感性和特异性。
本发明更加详细的技术方案描述如下：
本发明提供组胺在制备结核病诊断的试剂中的应用。
本发明进一步提供组胺在制备结核病诊断的医疗器械中的应用。
所述的诊断结核病以组胺作为诊断分子标记物。
本发明提供一种试剂组合，该试剂组合的使用可以直接或间接从尿液中提取分离出组胺，进一步检测组胺含量，并将组胺含量作为诊断指标，以确定尿液提供者是否患有结核病，即本发明提供一种试剂组合，该试剂组合以组胺作为检测目标，并以其作为生物标志物用于诊断结核病。
为此，本发明进一步提供本发明所述的试剂组合在制备诊断结核病试剂盒的应用。
本发明所述的生物标志物组胺，为已知化合物，可以根据任何一种现有方法提取或检测，所述方法包括任何一种组胺的检测方法，如现有文献中报道的：色谱法，elisa方法，优选采用高效液相色谱法，最优选采用超高效液相色谱和质谱连用的方法。
本发明所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。
本发明所述的结核病为肺结核或肺外结核。
本发明所述体液为尿液。
具体的，本发明的试剂盒，包括任何一种可以用于提取分离组胺的试剂。
本发明的试剂盒，包括任何一种现有的检测组胺的试剂盒，如：组胺分析试剂盒，组胺检测试剂盒，默克组胺检测试剂盒等。
优选的，本发明试剂盒中包括含有组胺标准对照品，还包括检测方法说明书，检测标准的参考数值，有机或无机试剂，溶剂的配制方法等。
本发明的技术方案是经过研究得到的，研究方法如下：
1.技术方案
1.1研究对象和方法
1.1.1研究对象
研究对象及纳入标准
研究对象中，活动性结核来自北京市胸科医院的确诊的肺结核住院患者，诊断标准依据《中华人民共和国卫生行业标准(ws288—2017)肺结核诊断》标准，且病原学检测阳性即：痰涂片或痰培养至少1项为阳性，无既往结核病史(问诊及x射线胸片检查无陈旧性结核病灶)，初次抗结核治疗，用药少于7天；潜伏感染者为有结核暴露或接触史，结核免疫学检查为阳性，痰涂片或痰培养为阴性，胸部x射线检查正常；非活动性肺结核非潜伏感染者(对照组)病原学检查及免疫学检查均为阴性。共选用健康对照组30人，结核病潜伏感染组30人，活动性肺结核组30人，年龄、性别等详细信息见表1。所有研究对象均年龄小于70岁、无妊娠或哺乳期妇女以及合并其它严重慢性疾病及免疫缺陷性疾病。遵循中国医学科学院/北京协和医学院病原生物学研究所和北京胸科医院伦理委员会制定的伦理标准，并签订知情意见通知书。
表1.样本人口统计学资料
标本来源
分别收集上述研究对象的晨尿的中段尿于50ml离心管中，并在室温下以4000×g离心10分钟，分离上清液并保存在-20℃以下，得到尿液样本以备分析。
1.1.2研究方法
代谢组学是基于液相质谱与色谱联用，对代谢物进行鉴定分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式。由于代谢物大多是功能分子、信号分子，因此相比其他组学，代谢物浓度的测量是表征细胞、组织和机体代谢状态的更直接的方法。超高效液相色谱(ultraperformanceliquidchromatography，uplc)分析通量大、速度快、灵敏度和分离度高。质谱技术是通过测量离子质荷比的鉴定技术，timeofflightmassspectrometer(tof)是常用的质谱类型之一，其质量分析器是一个离子漂移管(iondrifttube)，加速后的以恒定速度飞向离子接收器，记录各离子的到达时间和丰度以得到离子的荷质比，形成质谱图。
1.1.2.1尿液样本处理
样品解冻后取100μl上清，加入300μl甲醇、5μldl-o-三氯苯基丙氨酸(2.8mg/ml，内标)涡旋震荡30s。在-40℃下存放1小时，涡旋震荡30s，然后12000rpm，4℃离心15分钟，将200μl上清液转移到样品管准备上样。
1.1.2.2uplc-tof-ms
使用ultimate3000lc结合qexactivems(thermo)进行分离，并用esi-ms(靶向ms/ms模式)进行质谱鉴定分析。液相系统搭载thermohypergoldc18(100×2.1mm1.9μm)。流动相由溶剂a(0.1％甲酸-5％乙腈-水)和溶剂b(0.1％甲酸-乙腈)组成，梯度洗脱(0～1.0min，100～100％a；1.0～6.0min，100～80％a；6.0～8.0min，80～70％a；8.0～12.0min，70～65％a；12.0～13.0min，65～30％a；13.0～15.0min，30～5％a；15.0-16.0min，5-5％a；16.0-17.0min，5-100％a；17.0-18.0min，100％a)。流动相流速为0.3ml·min-1。柱温保持在40℃，样品管理器温度设置为4℃。esi 质谱参数如下：加热器温度300℃；鞘气流量，45arb；辅助气体流量，15arb；扫气流量，1arb；喷涂电压，3.0kv；毛细管温度，350℃；s-lensrf电平，30％。
1.1.3数据分析
根据离子信号的m/z值和保留时间，使用compounddiscover(3.0，thermo)采集并对齐原始数据。离子数据被合并并导入simca-p程序(版本14.1)对数据进行归一化。使用graphpadprism7对结果进行非配对t检验统计分析。
2.研究结果
将simac-p得到的数据导入graphpadprism7，对数据进行可视化分析，结果见图1。由图可见，与非活动性肺结核非潜伏感染组和潜伏感染组相比，活动性结核病组的组胺的相对表达水平与健康对照组，差异极显著(*p＜0.0001)，与潜伏感染组差异极显著(*p＜0.0001)；潜伏感染组组胺的相对表达水平与健康对照组，差异极显著(*p＜0.0001)。可以区别诊断健康人和结核病患者、潜伏感染和结核病患者，因此化合物组胺可以用做结核病的分子诊断标识。
3.结论：组胺可明确区分活动性结核病患者与结核潜伏感染和非活动性肺结核非潜伏感染者，可以作为成为诊断活动性结核病的候选生物标志物，故将组胺申请专利。
本发明通过上述研究，得到的结论是，组胺可以作为结核病的生物标志物，通过有关的检测方法得到检测结果，该结果可被用于诊断和评估结核病及其严重程度。或者根据结果判断是否感染结核菌，以及感染是否为活动性感染。
本发明根据上述研究，得到一种判断标准，初步确定为，尿液中，组胺含量正常值约为640.226-915.475微克/毫升，低于该限度，为阳性结果，若低于300微克/毫升则考虑为活动性结核可能性较大。在该正常值范围内则为阴性。
名词解释：
tb：tuberculosis，结核病
m.tb：mycobacteriumtuberculosis，结核分枝杆菌
ppd：结核菌素纯蛋白衍化物实验
igra：interferongammareleaseassays，γ干扰素释放试验
atb：activetuberculosis,活动性结核
ltbi：latenttuberculosisinfection，结核潜伏感染者
hc：healthcontrol，非结核感染对照组
uplc：ultraperformanceliquidchromatography，超高效液相色谱
tof-ms：timeofflightmassspectrometer，飞行时间质谱
esi ：electronsprayionizationpositivemode，电喷雾离子源阳离子模式
参考文献：
[1]worldhealthorganization.globaltuberculosisreport2019.availablefrom:http://www.who.int/tb/publications/global_report/en.
[2]hury,crampinac,chisamboc,etal.identificationofimmunologicalbiomarkerswhichmaydifferentiatelatenttuberculosisfromexposuretoenvironmentalnontuberculousmycobacteriainchildren.clinicalandvaccineimmunology,2014,21(2):133-142.
[3]nicholsonjk,connellyj,lindonjc,etal.innovationmetabonomics:aplatformforstudyingdrugtoxicityandgenefunction.natrevdrugdiscov,2002,1(2):153-161
[4]s.j.hill,distribution,properties,andfunctionalcharacteristicsofthreeclassesofhistaminereceptor,pharmacolrev42(1990)45-83.
附图说明
图1组胺相对定量结果注：tb：活动性肺结核患者；ltbi：潜伏感染者；hc：非活动性肺结核非潜伏感染者。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
收集李姓受试者中段尿50ml，室温下以4000×g离心10分钟，分离上清液，取100μl上清，加入300μl甲醇、5μldl-o-三氯苯基丙氨酸(2.8mg/ml，内标)涡旋震荡30s。在-40℃下存放1小时，涡旋震荡30s，然后12000rpm，4℃离心15分钟，将200μl上清液转移到样品管上样检测，检测方法采用以下液质联用，色谱条件如下：
使用ultimate3000lc结合qexactivems(thermo)进行分离，并用esi-ms(靶向ms/ms模式)进行质谱鉴定分析。液相系统搭载thermohypergoldc18(100×2.1mm1.9μm)。流动相由溶剂a(0.1％甲酸-5％乙腈-水)和溶剂b(0.1％甲酸-乙腈)组成，梯度洗脱(0～1.0min，100～100％a；1.0～6.0min，100～80％a；6.0～8.0min，80～70％a；8.0～12.0min，70～65％a；12.0～13.0min，65～30％a；13.0～15.0min，30～5％a；15.0-16.0min，5-5％a；16.0-17.0min，5-100％a；17.0-18.0min，100％a)。流动相流速为0.3ml·min-1。柱温保持在40℃，样品管理器温度设置为4℃。esi 质谱参数如下：加热器温度300℃；鞘气流量，45arb；辅助气体流量，15arb；扫气流量，1arb；喷涂电压，3.0kv；毛细管温度，350℃；s-lensrf电平，30％。
检测结果如下：
离子数据导入simac-p软件归一化换算后，测得样本组胺含量约为213.853微克/毫升。
正常值：640.226-915.475微克/毫升，检测结果超过该限度并低于300微克/毫升，为阳性结果，且为活动性感染的可能性较大。
实施例2
收集赵姓受试者中段尿50ml，室温下以4000×g离心10分钟，分离上清液，取100μl上清，加入300μl甲醇、5μldl-o-三氯苯基丙氨酸(2.8mg/ml，内标)涡旋震荡30s。在-40℃下存放1小时，涡旋震荡30s，然后12000rpm，4℃离心15分钟，将200μl上清液转移到样品管上样检测，检测方法采用以下液质联用，色谱条件如下：
使用ultimate3000lc结合qexactivems(thermo)进行分离，并用esi-ms(靶向ms/ms模式)进行质谱鉴定分析。液相系统搭载thermohypergoldc18(100×2.1mm1.9μm)。流动相由溶剂a(0.1％甲酸-5％乙腈-水)和溶剂b(0.1％甲酸-乙腈)组成，梯度洗脱(0～1.0min，100～100％a；1.0～6.0min，100～80％a；6.0～8.0min，80～70％a；8.0～12.0min，70～65％a；12.0～13.0min，65～30％a；13.0～15.0min，30～5％a；15.0-16.0min，5-5％a；16.0-17.0min，5-100％a；17.0-18.0min，100％a)。流动相流速为0.3ml·min-1。柱温保持在40℃，样品管理器温度设置为4℃。esi 质谱参数如下：加热器温度300℃；鞘气流量，45arb；辅助气体流量，15arb；扫气流量，1arb；喷涂电压，3.0kv；毛细管温度，350℃；s-lensrf电平，30％。
检测结果如下：
离子数据导入simac-p软件归一化换算后，测得样本谷胱甘肽含量约为880.83微克/微升。
正常值：640.226-915.475微克/毫升，检测结果在限度范围内，为阴性结果。
1.组胺在制备结核病诊断的试剂中的应用。
2.组胺在制备结核病诊断的医疗器械中的应用。
3.根据权利要求1或2任何一项权利要求所述的应用，其中所述结核病诊断是以组胺作为诊断分子标记物。
4.一种试剂组合，该试剂组合的使用可以直接或间接从体液中提取分离出组胺，进一步检测组胺含量，并将组胺含量作为诊断指标，以确定体液提供者是否患有结核病。
5.根据权利要求4所述的试剂组合，其中所述体液为尿液。
6.根据权利要求4所述的试剂组合，为一种试剂盒，其中包括任何一种可以用于提取分离组胺的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂组合，所述试剂盒中包括含有组胺标准对照品，还包括检测方法说明书，检测标准的参考数值，有机或无机试剂，溶剂的配制方法等。
8.权利要求4所述的试剂组合在制备诊断结核病试剂盒的应用。
9.根据权利要求1或2任何一项权利要求所述的应用，包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。
10.根据权利要求1或2任何一项权利要求所述的应用，所述的结核病为肺结核或肺外结核。
技术总结