相关申请的交叉引用本申请要求于2018年4月20日提交的美国临时专利申请号62/660,460的利益和优先权，所述美国临时专利申请的全部内容引入本文作为参考。背景读取包含多核苷酸的碱基序列的能力已对生物学研究具有并不夸张的影响。对于过去40年中的大多数时间，双脱氧dna‘桑格（sanger）’测序已在许多实验室中用作标准测序技术，并且它的顶峰是人基因组序列的完成。然而，由于桑格测序是对单个扩增子执行的，因此桑格测序的流通量是有限的，并且大规模桑格测序项目是昂贵且费力的。dna测序的范例随着‘下一代’测序（ngs）技术的出现而改变，所述ngs技术平行加工数十万至数百万个dna片段，导致生成序列每碱基的低成本、以及在单个测序运行中在千兆碱基（gb）到兆兆碱基（terabase）（tb）规模上的流通量。值得注意的是关于以下事实的思考：著名地于2001年在scienceandnature中共同公布的首个人基因组，需要15年来测序且花费近30亿美元。相比之下，现代的ngs测序仪可以在一天内对45个人基因组进行测序，每个基因组大约$1000。因此，ngs现在可以用于定义整个基因组的特征并且描绘它们之间的差异，允许研究人员获得遗传变异的全谱的更深入了解，并且定义其在表型变异和复杂性状的发病机理中的作用。然而，ngs对临床和诊断应用的应用可能受实验室内和实验室间高变化限制。这些问题降低了任何结果的价值，并且已阻止了这些测序方法在分子诊断中的用途。例如，ngs文库制备和测序反应制备的复杂性和可变性可以导致样品间差异和实验室间差异，其可以使得难以确定例如在样品中检测到的遗传变异或病原性生物的普遍性。在另一种情况下，诊断测定（例如filmarray实验对象组，biofire，slc，ut）中靶向的许多病原体，可以在环境中和作为在样品收集的部位处的共栖菌丛（commensals）而发现。例如，在疾病例如肺炎中，最频繁遇到的细菌病原体也可能作为口咽通道的“正常菌群”存在，所述口咽通道本身经常是样品采集的部位（痰和气管抽吸物或鼻咽拭子（nps））、或用于收集更具侵入性的样本例如支气管肺泡灌洗物（bal）的路径。在此类情况下，被正常菌群的频繁污染或正常菌群的共同收集基本上是不可避免的。在此类情形下，ngs的诊断能力可能受以下事实限制：由于ngs可以检测到高浓度和最低限度浓度的生物的存在（即，ngs具有几乎无限的动态范围）的可能性，而没有提供大量的内在背景来解释测序数据中检测的临床相关性（例如，ngs可以检测病原体（即，来自病原体的核酸）的存在及其与其它检测到的核酸或生物的相对丰度（%），而没有提供检测到的病原体是否以临床相关浓度存在的任何指示），临床相关的生物无法容易地与共栖菌丛或污染区别开。微生物实验室中的传统实践是执行半定量培养或定量培养，以区别细菌的致病性负荷与非临床相关的共栖菌丛携带。对于不同类型的样本，存在不同的诊断滴度指南。类似的方法已应用于ngs测定。就其性质而言，ngs提供了半定量数据，并且在不存在混杂因素（例如样品制备错误或测序效率中的差异）的情况下，关于靶的测序读取数可能与靶的丰度相关。几个团队已利用这种关系来获得关于ngs中的未知核酸的相对定量数据。例如，可以通过以下来确定样品中核酸的相对丰度：对一个或多个样品执行一系列的连续稀释（说明性地，10倍稀释），对稀释样品的系列进行测序，然后绘制在各自中找到的读取数。这些团队已假定，如果连续稀释样品中的读取数之间的关系具有线性关系（例如，10倍稀释导致测序读取数中的大约10倍降低，大约100倍稀释导致测序读取数中的100倍降低等），则测序读取数可以用于相对定量样品中存在的不同靶（例如，相对定量高和低浓度的靶）。例如，如果第一测序核酸具有10个测序读数，而第二测序核酸具有100个测序读数，则在这种情形下可以得出结论，第二核酸的浓度是第一核酸的10x。这可以用于例如检测基因重复和/或确定基因组中的基因拷贝数。然而，这种方法仅仅是相对的，并且因此，由于不存在可以用作参考的已知绝对浓度的核酸，因此无法确定第一核酸或第二核酸的浓度。结果，这种方法可能不是非常准确。例如，在高浓度检测和低浓度检测之间的大差异（例如，几个数量级）的情况下，分辨率在较低和/或高浓度下可能丧失，导致与真实差异相比，降低了高和低之间的倍数差异。这种方法由于以下事实也不是非常特异性的：它只是相对的，它是样品/测序运行特异性的，并且它并未说明实验室内差异和实验室间差异。另一种常见的定量方法是在分开的反应中定量用于ngs的样品中的核酸。例如，定量pcr（qpcr）可以用于绝对定量，频繁地使用标准曲线方法。在这种方法中，通过针对已知数量的单个参考模板绘制从实时pcr获得的交叉点（cp）值生成的标准曲线提供了回归线，其可以用于推断目标样品中的相同靶基因的数量。与含有需要定量的特异性基因靶的样品一起，建立了参考模板的连续稀释（说明性地，10倍稀释）。运行各种分开的反应，通常对于参考靶的每个水平一次且对于目标样品各一次。另外，由于pcr效率中的测定特异性差异经常影响定量，因此可以对于不同的基因靶建立具有分开参考模板的分开标准曲线。然而，ngs的强大之处在于它的大量平行性-即，可以同时且平行处理10s至100s至1000s的样品。在这种情形下，使用qpcr来定量靶可能是挑战性的。尽管已使用qpcr执行来自100s至1000s次分开核酸反应的靶的定量（参见例如，high-throughputdropletdigitalpcrsystemforabsolutequantitationofdnacopynumber，hindson等人，analchem.2011年11月15日；83（22）：8604–8610），但这种方法在技术上是挑战性的，并且需要专用设备。另外，qpcr方法一般假定或要求测定在单重反应和多重反应中具有相同的pcr效率，但事实并非如此。另外，迄今为止公布的所有基于标准曲线的定量方法都需要建立外部反应和计算标准曲线。另一种方法是使用测定特异性竞争模板来定量ngs中的核酸（参见例如，us2015/0292001）。此类方法旨在通过依靠天然靶序列与分别的竞争性内部扩增对照（所述对照专门设计用于该天然靶序列）的比例关系，来提供样品中的核酸拷贝数的测量中的再现性。us2015/0292001中描述的竞争性模板使用与目标天然核酸模板等同的引发位点，但使用了设计的（例如人工）引物间序列，以便模拟pcr反应中天然靶的动力学，并且因此控制pcr效率中的靶特异性变异。然而，结果是此类方法是对于测定和目标模板特异性的（即，竞争模板是靶和样品特异性的）。为了采用us2015/0292001中描述的方法，需要对于每个新测定和/或待测序的模板设计新的竞争性内部扩增对照，这限制了这种方法的一般适用性。另外，靶一般需要伴随和不伴随竞争性模板进行测序，以便使单独的靶的测序应答与靶加上竞争性模板的测序应答解卷积。这增加了方法的复杂性水平，并且有可能在计算内引入误差。因此，在本领域中需要用于ngs的通用内部定量标准品和有关的定量方法。由于来自患者样品的核酸纯化整合到ngs工作流内，因此无法通过外部标准曲线容易地估计样品驱动的变异性在核酸提取中的效应，以及任何样品衍生的抑制剂对pcr的作用，以及因此对定量的作用。概述本公开内容提供了用于通用内部标准品的方法、系统和试剂盒，所述通用内部标准品可以提供多个靶物种的同时定量，所述方法、系统和试剂盒还考虑了测序结果中的测定特异性变化和基质衍生变化的效应。因为该标准是通用标准，所以它对靶、样品或测定并非特异性的，并且像这样，本文所述的标准、方法和试剂盒可以用于任何测序测定（例如，ngs测定）中。本公开内容还教导了使用过程对照和/或检测限（lod）对照用于测定特异性校正。在本公开内容的一个方面，公开了用于测序测定的读数值归一化的方法。该方法包括提供包含待测序的一种或多种未知核酸的样品；向样品中添加已知数量的内部定量标准品（iqs）；制备用于测序的包含内部定量标准品的样品；测序以生成样品的测序数据集，其中所述测序数据集包含从未知核酸和内部定量标准品观察到的测序读数；计数测序数据集中源于未知核酸和内部定量标准品的测序读取数；并且对测序数据集进行归一化，其中所述归一化（1）基于关于样品的内部定量标准品的测序读数的最小数目的存在（例如，保留归一化的测序读取数），将数据接受/拒绝标准应用于测序数据集，并且（2）确保将基本上相同的检测限（lod）应用于测序测定中的所有未知核酸。在一个实施方案中，制备用于测序的包含内部定量标准品的样品可以包括：将测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列引入样品中的未知核酸和内部定量标准品内。在另一个实施方案中，制备用于测序的包含内部定量标准品的样品可以包括以下的一种或多种：裂解样品中的细胞，从裂解产物中回收核酸，核酸纯化，使用具有突出端的靶特异性引物的第一多重pcr，第二次核酸纯化，使用样品特异性测序衔接子引物的第二多重pcr，第三次核酸纯化，以及用于测序的多重相似制备的样品的合并。因为标准在样品制备开始时添加，所以标准贯穿所有步骤，并且对于所有步骤都考虑了系统损失和效率。在一个实施方案中，样品中的每种未知核酸可以具有约0-1013个拷贝/ml的浓度–即，在一些情况下，未知核酸可能不存在（存在0个拷贝/ml），或未知物的浓度可能非常高（例如，高达1013个拷贝/ml）。在通常的样品中，未知核酸的浓度范围可以为约103-109个拷贝/ml。在一个实施方案中，加入样品中的iqs的已知数量在约104-106个拷贝/ml（例如，约5x105个拷贝/ml）的范围内。可以根据检测限（lod）或为了实现（lod），向样品中添加或多或少的iqs。在一个实施方案中，可以将一种类型的iqs加入样品中。在另一个实施方案中，可以以不同的输入浓度，将两种或更多种类型的iqs加入样品中，使得可以用两个或更多个参考点生成标准曲线用于定量。在一个实施方案中，在加入样品中的内部定量标准品的数量与关于内部定量标准品的测序读取数之间可能优选存在线性关系。即，归于内部定量标准品的测序读取数可能不等于内部定量标准品的输入数量，但读取数应该与输入数量线性相关。如果该关系不是线性的，则这可以解释为指示添加内部定量标准品、样品制备或测序中的一种或多种中的问题。在一个实施方案中，归一化保留归一化的测序读取数（norm），其中norm=测序读取数*（f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数）。‘f’是固定的用户设定的归一化系数，其限定了iqs测序读取的最小预计数目。在一个实施方案中，f的值可以是测定特异性的。‘f’是设定为确保对于测序测定的检测限（lod）足够的测序读取深度的测序读取数值。norm可能代表测序数据的子集，并且是保存用于进一步分析和定量的测序读取数。例如，如果‘f’和观察到的源于内部定量标准品的测序读取数相同，则norm等于记录的测序读取数。另一方面，如果数据集中的内部定量标准品测序读取数大于‘f’，则norm缩减数据规模以解决过度读取的问题，并且确保跨越所有样品应用相同的lod。如果数据集中的内部定量标准品测序读取数小于‘f’，则来自该样品的数据可能被拒绝。在一个实施方案中，可以用关系alpha对数据进行归一化，其中未知核酸读数和内部定量标准品读数各自通过相同比率alpha分别进行归一化，其中alpha=f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数。在一个实施方案中，测序读取深度在约1000个内部定量标准品测序读数至约100,000个内部定量标准品测序读数，优选约2000个内部定量标准品测序读数至约75,000个内部定量标准品测序读数，更优选约5000个内部定量标准品测序读数至约50,000个内部定量标准品测序读数的范围内，或者最优选至少5000个内部定量标准品测序读数。如果对内部定量标准品记录小于‘f’的测序数据，则关于与‘f’读取数不足有关的样品的数据可能被拒绝。在一个实施方案中，该方法可以包括在归一化之后，计算样品中的未知核酸的输入数量（iqt），其中由于内部定量标准品的输入数量是已知的，因此可以通过iqt=归于未知核酸的归一化的未知核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f），来计算未知核酸的输入数量（iqt）。在一个实施方案中，该方法可以包括在作为iqtn=归于“第n”未知核酸的归一化的未知“n”个核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）归一化之后，通过计算样品中的多个未知核酸（如果存在的话）的输入数量（iqti，iqtj，iqtk…iqtn），来计算样品中的两种或更多种未知核酸的输入数量。在一个实施方案中，两个或更多个样品可以在使它们经受测序之前进行合并。在一个实施方案中，可以在制备各个样品用于测序之后并且在实际测序之前合并样品。在一个实施方案中，可以在制备之后和在测序之前合并2-1000个样品，优选地可以在制备之后和在测序之前合并2-500个样品，更优选地可以在制备之后和在测序之前合并2-100个样品，更优选地可以在制备之后和在测序之前合并2-50个样品，或者最优选地可以在制备之后和在测序之前合并2-32个样品。可以合并用于测序的样品数目一般仅受区分所得数据中的样品的能力限制。例如，库中的样品可以通过样品特异性测序衔接子引物加以区分，所述引物用于鉴定源于特异性样品的测序数据。在这个实施例中，区分可能受测序衔接子引物的长度和多样性限制。在一个实施方案中，每个合并的样品具有与之相关的一组独特的样品特异性鉴定序列，使得可以区别且分开来自该库中的每个样品的测序数据。在一个实施方案中，每个合并的样品具有其自身的内部定量标准品，所述内部定量标准品与其自身的一组独特的样品特异性鉴定序列相关，并且其中将归一化分开地应用于该库中的每个样品。在一个实施方案中，归一化分开地（1）将数据接受/拒绝标准应用于库中的每个样品，并且（2）确保将基本上相同的检测限（lod）应用于每个样品中的所有未知核酸。在一个实施方案中，该方法可以包括在归于每个样品的数据已归一化之后，计算每个样品中的未知核酸的输入数量（iqt）。由于每个样品中的内部定量标准品的输入数量是已知的，因此可以计算未知核酸的输入数量（iqt）。在作为iqtn=归于“第n”未知核酸的归一化的未知“n”个核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）归一化之后，可以计算合并样品中的多个未知核酸的输入数量（iqti，iqtj，iqtk…iqtn）。在一个实施方案中，制备用于测序的样品可以包括样品裂解，以生成裂解产物，从裂解产物中回收核酸，并且任选地纯化回收的核酸，并且将引物结合位点和样品特异性鉴定序列引入待测序核酸的区域内。附接可以包括以下之一：使用具有双重索引测序突出端的靶特异性引物，在扩增反应中扩增待测序的核酸，所述靶特异性引物包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列，或使待测序的核酸片段化，并且连接至片段化的核酸测序特异性衔接子，所述衔接子包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列。在一个实施方案中，扩增待测序的核酸可以包括：使用具有定制突出端的靶特异性引物执行第一多重pcr反应，执行第一次核酸纯化，使用双重索引测序衔接子引物执行第二pcr反应，所述引物对第一pcr中引入的定制突出端退火或连接，并且执行第二次核酸纯化。在一个实施方案中，双重索引测序衔接子引物是靶不依赖性的，并且包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列。在一个实施方案中，可以执行扩增以限制或压缩待测序样品中的核酸浓度的动态范围的上限。这可以减少测序和数据分析负荷，并且减少其中仅极高浓度的核酸出现在测序数据集中的情形数目。在一个实施方案中，扩增可以包括将第一多重pcr反应中的靶特异性引物浓度或循环数中的一个或多个限制于以大于所需动态范围的浓度存在的核酸的平台扩增，作为实施例可以执行压缩以将核酸的动态范围压缩至约107个拷贝/ml的平台浓度，而以小于107个拷贝/ml存在的核酸在指数扩增期中以一系列浓度存在。在其它实施方案中，可以执行扩增以限制或压缩动态范围的其它部分。如果例如仅高浓度的种类是测序测定中感兴趣的，则可以这样限制扩增，使得仅观察到较高浓度的核酸（例如，>105个拷贝/ml）。在任何前述方法实施方案中，测序测定可以是下一代测序测定。在另一个方面，公开了用于执行定量下一代测序（ngs）测定的方法。该方法包括提供包含待测序的一种或多种未知核酸的样品，其中所述未知核酸具有约0-1013个拷贝/ml的浓度；向样品中添加已知数量的iqs，其中所述iqs的已知数量在约104-106个拷贝/ml的范围内（取决于测定的靶向动态范围）；制备用于测序的包含内部定量标准品的样品；对样品中的未知核酸和内部定量标准品进行测序，以生成测序数据；计数测序数据集中源于未知核酸和内部定量标准品的测序读取数；并且对测序数据集进行归一化，并且通过iqt=源于未知核酸的归一化的未知核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f），来计算未知核酸的输入数量（iqt），其中‘f’是固定的内部定量标准品测序读数的最小预计数目。在一个实施方案中，归一化可以包括保留归一化的测序读取数（norm），其中norm=测序读取数*（f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数）。归一化分开地（1）将数据接受/拒绝标准应用于测定中的每个样品，并且（2）确保将基本上相同的检测限（lod）应用于每个样品中的所有未知核酸。在一个实施方案中，未知核酸可以具有约101-1012个拷贝/ml，或优选地约101-109个拷贝/ml的浓度。在一个实施方案中，‘f’与测定的lod相关。例如，如果对于约105个拷贝/ml的iqs输入浓度，‘f’为约102-103，则样品中关于未知核酸的lod为约103-102个拷贝/ml。如果对于相同的iqs输入浓度，‘f’为约103-104（即，读取深度增加，并且每个读数的权重相应地增加），则样品中关于未知核酸的lod为约102-101个拷贝/ml。对于给定的iqs输入浓度，可以通过增加或降低读取深度（即，通过增加或降低‘f’的程度），以及相应地增加或降低归于每个个别测序读数的权重，使lod上升或下降。在一个实施方案中，用于执行定量下一代测序（ngs）测定的方法可以包括：将样品中的多个未知核酸（如果存在的话）的输入数量（iqti，iqtj，iqtk…iqtn）计算为iqtn=归于“第n”未知核酸的归一化的未知“n”个核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）。在一个实施方案中，用于执行定量下一代测序（ngs）测定的方法可以包括合并两个或更多个样品，并且使其同时经受测序，其中所述两个或更多个样品在制备之后和在测序之前进行合并。在一个实施方案中，每个合并的样品可以具有与之相关的一组独特的样品特异性鉴定序列，使得可以区别且分开来自该库中的每个样品的测序数据。在一个实施方案中，每个合并的样品可以具有其自身的内部定量标准品，所述内部定量标准品与其自身的一组独特的样品特异性鉴定序列相关，并且其中将定量分开地应用于来自该库中的每个样品的每种核酸。如上文关于一个样品中的多重核酸，可以将归一化和定量应用于多重样品中的多重核酸。该方法包括将合并样品中的多个未知核酸的输入数量（iqti，iqtj，iqtk…iqtn）计算为iqtn=归于“第n”未知核酸的归一化的未知“n”个核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）。在一个实施方案中，用于执行定量下一代测序（ngs）测定的方法可以包括：提供待测序的一组测定特异性阳性对照，其中所述阳性对照包括对应于测定中测序的一种或多种未知核酸各自的阳性对照。在一个实施方案中，用于执行定量下一代测序（ngs）测定的方法可以包括：基于测定特异性阳性对照的序列读取计数，将测定特异性校正因子应用于一种或多种未知核酸中的每种。如果pcr扩增的效率不够理想，或者如果靶和内部标准品的效率不同，则校正因子可以取决于反应内的阳性对照输入的数量。因此，在一个实施方案中，阳性对照的数量应该在相应靶的靶向动态范围的中间。在另外一个方面，描述了用于对下一代测序（ngs）测定中的未知核酸进行归一化和定量的试剂盒。试剂盒可以包括内部定量标准品（iqs），其中所述iqs是配置为待以已知量加入样品中的核酸，所述样品包含待测序的未知核酸；以及关于使用iqs用于对测序数据集进行归一化、以及用于计算未知核酸的输入数量的说明书。在一个实施方案中，试剂盒可以包括待以不同的已知浓度添加的一组iqs，用于生成用于定量未知核酸的标准曲线。在一个实施方案中，试剂盒中提供的iqs可以被配置为待以约104-106个拷贝/ml的范围加入样品中；然而，可以增加或降低一种或多种iqs的数量，以扩大或压缩检测范围的上限和下限。在一个实施方案中，使用内部定量标准品，对测序数据进行归一化，以保留归一化的测序读取数（norm），其中norm=测序读取数*（f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数），其中‘f’是固定的内部定量标准品测序读数的最小预计数目，并且使用内部定量标准品，通过iqt=源于未知核酸的归一化的未知核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f），来计算未知核酸的输入数量（iqt）。在一个实施方案中，试剂盒进一步包括用于至少内部定量标准品的测序特异性衔接子，其包含测序衔接子位点和样品特异性鉴定序列。在一个实施方案中，试剂盒可以进一步包括具有定制突出端的靶特异性引物，其配置用于扩增内部定量标准品，并且用于对测序特异性衔接子退火或连接。在另外一个方面，描述了用于执行比较物研究的方法。用于执行比较物研究的方法可以包括：提供包含一种或多种靶核酸的单次或多重扩增和检测的第一测定，该第一测定具有检测限（lod），并且提供不同于第一测定的第二测定，用于确认检测和第一测定的lod。第二测定应该具有至少与第一测定相同的lod，但它可能具有较低的lod。在一个或多个实施方案中，第二测定可以包括：制备用于测序的包括至少一种内部定量标准品的样品；测序以生成样品的测序数据集，其中所述测序数据集包括从靶核酸和内部定量标准品观察到的测序读数；计数测序数据集中源于靶核酸和内部定量标准品的测序读取数；并且对测序数据集进行归一化，其中所述归一化（1）基于关于样品的内部定量标准品的测序读数的最小数目的存在，将数据接受/拒绝标准应用于测序数据集，并且（2）确保将基本上相同的检测限（lod）应用于测序测定中的所有未知核酸，并且其中第二测定的lod与第一测定的lod基本上相同。在一个实施方案中，第一测定可以是定性分子诊断测定。在另一个实施方案中，第一测定可以是半定量分子诊断测定。在一个实施方案中，第一测定可以进一步包括向样品中添加一种或多种内部定量标准品，并且执行定量两步扩增。在一个实施方案中，定量两步扩增可以包括：在第一阶段多重扩增混合物中扩增样品，所述扩增混合物包含多个靶引物，每个靶引物对配置为扩增可能存在于样品中的不同靶，以及至少一个定量标准品引物对，所述定量标准品引物对配置为扩增内部定量标准品核酸，将第一阶段扩增混合物分成多个第二阶段个别反应，各自包含至少一个引物对的第一组多个第二阶段个别反应，所述引物对配置为进一步扩增可能存在于样品中的不同靶之一，以及各自包含至少一个引物对的第二组多个第二阶段个别反应，所述引物对配置为进一步扩增内部定量标准品核酸之一，并且使多个第二阶段个别反应经受扩增条件，以生成一个或多个靶扩增子和多个定量标准品扩增子，每个定量标准品扩增子具有相关的定量标准品交叉点（cp），其中每种靶核酸具有cp，并且每个内部标准品在第一测定中具有已知浓度和已知定量标准品cp。在一个实施方案中，该方法可以进一步包括：由第一测定中的两个或更多个定量标准品交叉点（cp）生成标准曲线；并且使用该标准曲线来定量一种或多种靶核酸中的每种。在一个实施方案中，可以使用标准曲线在第一测定中定量每种靶核酸，所述标准曲线使用对以下的最小二乘回归线拟合生成：log10（浓度）=（cp-b）/a其中cp是对于每个靶测量的交叉点，b，截距，代表当靶的log10（浓度）为零时的cp值，并且a是代表cp随着浓度中的单个单位改变而改变的程度的斜率。在一个实施方案中，第二测定可以进一步包括对测序数据集进行归一化，以保留norm测序读数，其中norm=测序读取数*（f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数）。在一个实施方案中，可以通过iqt=源于靶核酸的归一化的靶核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f），其中‘f’是固定的内部定量标准品测序读数的最小预计数目，通过计算样品中的每种靶核酸的输入数量（iqt），来定量第二测定中的核酸。相同的原理应用于计算样品中的多个未知核酸的输入浓度。样品中的多重靶核酸（如果存在的话）的输入数量（iqti，iqtj，iqtk…iqtn）可以计算为iqtn=归于“第n”未知核酸的归一化的未知“n”个核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）。在一个实施方案中，第二测定中的‘f’可能与第二测定的检测限（lod）相关。第二测定的lod选择为与第一测定的lod基本上相同。在一个实施方案中，‘f’与测定的lod相关。例如，如果对于约105个拷贝/ml的iqs输入浓度，‘f’为约103，则样品中关于未知核酸的lod为约102个拷贝/ml。如果对于相同的iqs输入浓度，‘f’为约104（即，读取深度增加，并且每个读数的权重相应地增加），则样品中关于未知核酸的lod为约10个拷贝/ml。对于给定的iqs输入浓度，可以通过增加或降低读取深度（即，通过增加或降低‘f’的程度），以及相应地增加或降低归于每个个别测序读数的权重，使lod上升或下降。在一个实施方案中，用于执行比较物研究的方法可以包括合并两个或更多个样品，并且使其同时经受测序，其中所述两个或更多个样品在制备之后和在测序之前进行合并。在一个实施方案中，每个合并的样品可以具有与之相关的一组独特的样品特异性鉴定序列，使得可以区别且分开来自该库中的每个样品的测序数据。在一个实施方案中，每个合并的样品可以具有其自身的内部定量标准品，所述内部定量标准品与其自身的一组独特的样品特异性鉴定序列相关。如上文关于一个样品中的多重核酸描述的，可以将归一化和定量应用于多重合并样品中的多重核酸。该方法包括将合并样品中的多个未知核酸的输入数量（iqti，iqtj，iqtk…iqtn）计算为iqtn=归于“第n”未知核酸的归一化的未知“n”个核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）。在任何前述实施方案中，本文所述的测序测定、方法和试剂盒并不包括执行相对定量。即，本文所述的测序测定、方法和试剂盒确实包括已知浓度的内部定量标准品，因此不必依赖测序读数的相对数目或检测到的核酸的相对丰度，来确定未知物的相对浓度。在任何前述实施方案中，本文所述的测序测定、方法和试剂盒并不包括在与测序测定分开的反应中执行定量。即，本文所述的测序测定、方法和试剂盒确实包括已知浓度的内部定量标准品，因此不必执行另一个分开的反应（例如qpcr），来确定测序反应中核酸的输入浓度。在任何前述实施方案中，本文所述的测序测定、方法和试剂盒并不包括使用测定或模板特异性定量标准品。即，本文所述的测序测定、方法和试剂盒确实包括通用内部标准品，其可以在任何测序测定（例如，ngs测定）中提供多重靶物种的同时定量，而不是依赖对于特异性测定或特异性靶设计的标准。在任何前述实施方案中，本文所述的测序测定、方法和试剂盒并不包括使用竞争性模板作为定量标准品。一般而言，竞争性模板是测定或模板特异性定量标准品的特异性类型。然而，需要对于每个新测定和/或待测序的模板设计新的竞争性内部扩增对照。相反，本文所述的测序测定、方法和试剂盒包括通用内部标准品，其可以在任何测序测定（例如，ngs测定）中提供多重靶物种的同时定量。本文描述的是：a1.一种用于测序测定的读数值归一化的方法，其包括：提供包含待测序的一种或多种未知核酸的样品；向样品中添加已知数量的内部定量标准品；制备用于测序的包含内部定量标准品的样品，其中所述制备包括将测序特异性衔接子位点和样品特异性鉴定序列引入样品中的未知核酸和内部定量标准品内；测序以生成样品的测序数据集，其中所述测序数据集包括从未知核酸和内部定量标准品观察到的测序读数；计数测序数据集中源于未知核酸和内部定量标准品的测序读取数；和对测序数据集进行归一化，其中所述归一化（1）基于关于样品的内部定量标准品的测序读数的最小数目的存在，将数据接受/拒绝标准应用于测序数据集，并且（2）确保将基本上相同的检测限（lod）应用于测序测定中的所有未知核酸。a2.条款a1的方法，其中所述样品中的每种未知核酸具有约0-1013个拷贝/ml（例如，约102-109个拷贝/ml）的浓度。a3.条款a1或条款a2中至少一个的方法，其中加入样品中的内部定量标准品的已知数量在约103-106个拷贝/ml（例如，约105-106个拷贝/ml）的范围内。a4.条款a1-a3中一个或多个的方法，其中在加入样品中的内部定量标准品的已知数量与关于内部定量标准品的测序读取数之间存在线性关系。a5.条款a1-a4中任何一个或多个的方法，其中对测序数据集进行归一化保留norm测序读数，其中norm=测序读取数*（f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数），并且其中‘f’是固定的内部定量标准品测序读数的最小预计数目。a6.条款a1-a5中任何一个或多个的方法，其中‘f’是设定为确保对于测序测定的lod足够的测序读取深度的测序读取数值。a7.条款a1-a6中任何一个或多个的方法，其中所述测序读取深度在约1000个内部定量标准品测序读数至约100,000个内部定量标准品测序读数，优选约2000个内部定量标准品测序读数至约75,000个内部定量标准品测序读数，更优选约5000个内部定量标准品测序读数至约50,000个内部定量标准品测序读数的范围内，或者最优选至少5000个内部定量标准品测序读数。a8.条款a1-a7中任何一个或多个的方法，其中未知核酸读数和内部定量标准品读数各自通过相同比率alpha分别进行归一化，其中alpha=f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数。a9.条款a1-a8中任何一个或多个的方法，其进一步包括在归一化之后，计算样品中的未知核酸的输入数量（iqt），其中由于内部定量标准品的输入数量是已知的，因此可以通过iqt=归于未知核酸的归一化的未知核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f），来计算未知核酸的输入数量（iqt）。a10.条款a1-a9中任何一个或多个的方法，其进一步包括：在作为iqtn=归于“第n”未知核酸的归一化的未知“n”个核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）归一化之后，来计算样品中的多个未知核酸（如果存在的话）的输入数量（iqti，iqtj，iqtk…iqtn）。a11.条款a1-a10中任何一个或多个的方法，其中制备样品包括样品裂解，从裂解产物中回收核酸，并且任选地纯化回收的核酸，并且将引入的引物结合位点和样品特异性鉴定序列附接到待测序核酸的区域内。a12.条款a1-a11中任何一个或多个的方法，其中所述附接包括以下之一：使用具有双重索引测序突出端的靶特异性引物，在扩增反应中扩增待测序的核酸，所述靶特异性引物包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列，或使待测序的核酸片段化，并且连接至片段化的核酸测序特异性衔接子，所述衔接子包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列。a13.条款a1-a12中任何一个或多个的方法，其中扩增待测序的核酸包括：使用具有定制突出端的靶特异性引物执行第一多重pcr反应，执行第一次核酸纯化，使用双重索引测序衔接子引物执行第二pcr反应，所述引物对第一pcr中引入的突出端退火或连接，其中所述双重索引测序衔接子引物是靶不依赖性的，并且包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列，执行第二次核酸纯化。a14.条款a1-a13中任何一个或多个的方法，其进一步包括将第一多重pcr反应中的靶特异性引物浓度或循环数中的一个或多个限制于以大于约107个拷贝/ml的浓度存在的核酸的平台扩增，并且保存在指数扩增期小于约107个拷贝/ml的核酸。a15.条款a1-a14中任何一个或多个的方法，其进一步包括合并两个或更多个样品，并且使其同时经受测序，其中所述两个或更多个样品在制备之后和在测序之前进行合并。a16.条款a1-a15中任何一个或多个的方法，其中在制备之后和在测序之前合并2-1000个样品，优选地在制备之后和在测序之前合并2-500个样品，更优选地在制备之后和在测序之前合并2-100个样品，更优选地在制备之后和在测序之前合并2-50个样品，或者最优选地在制备之后和在测序之前合并2-32个样品。a17.条款a1-a16中任何一个或多个的方法，其中每个合并的样品具有与之相关的一组独特的样品特异性鉴定序列，使得可以区别且分开来自该库中的每个样品的测序数据。a18.条款a1-a17中任何一个或多个的方法，其中每个合并的样品具有其自身的内部定量标准品，所述内部定量标准品与其自身的一组独特的样品特异性鉴定序列相关，并且其中将归一化分开地应用于该库中的每个样品。a19.条款a1-a18中任何一个或多个的方法，其中所述归一化分开地（1）将数据接受/拒绝标准应用于库中的每个样品，并且（2）确保将基本上相同的检测限（lod）应用于每个样品中的所有未知核酸。a20.条款a1-a19中任何一个或多个的方法，其进一步包括：在作为iqtn=归于“第n”未知核酸的归一化的未知“n”个核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）归一化之后，来计算合并样品中的多个未知核酸的输入数量（iqti，iqtj，iqtk…iqtn）。a21.条款a1-a20中任何一个或多个的方法，其中所述测序测定是下一代测序测定。a22.条款a1-a21中任何一个或多个的方法，其中所述测序测定并不包括执行相对定量。a23.条款a1-a22中任何一个或多个的方法，其中所述测序测定并不包括在与测序测定分开的反应中执行定量。a24.条款a1-a23中一个或多个的方法，其中所述测序测定并不包括使用测定或模板特异性定量标准品。a25.条款a1-a24中任何一个或多个的方法，其中所述测序测定并不包括使用竞争性模板作为定量标准品。b1.一种用于执行定量下一代测序（ngs）测定的方法，其包括：提供包含待测序的一种或多种未知核酸的样品；向样品中添加已知数量的内部定量标准品；制备用于测序的包含内部定量标准品的样品；对样品中的未知核酸和内部定量标准品进行测序，以生成测序数据；计数测序数据集中源于未知核酸和内部定量标准品的测序读取数；和对测序数据集进行归一化，并且通过iqt=源于未知核酸的归一化的未知核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f），来计算未知核酸的输入数量（iqt），其中‘f’是固定的内部定量标准品测序读数的最小预计数目。b2.条款b1的方法，其中所述样品中的每种未知核酸具有约0-1013个拷贝/ml（例如，约102-109个拷贝/ml）的浓度。b3.条款b1或条款b2中至少一个的方法，其中加入样品中的内部定量标准品的已知数量在约104-106个拷贝/ml（例如，约105-106个拷贝/ml）的范围内。b4.条款b1-b3中任何一个或多个的方法，其进一步包括通过norm=测序读取数*（f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数），对测序数据集进行归一化。b5.条款b1-b4中任何一个或多个的方法，其中所述归一化分开地（1）将数据接受/拒绝标准应用于测定中的每个样品，并且（2）确保将基本上相同的检测限（lod）应用于跨越多重样品在每个样品中的所有未知核酸，所述多重样品跨越多重用户、多天等使用的合并在一起。b6.条款b1-b5中任何一个或多个的方法，其中所述未知核酸具有约102-1010个拷贝/ml，或优选地约102-109个拷贝/ml的浓度。b7.条款b1-b6中任何一个或多个的方法，其中‘f’与ngs测定的检测限（lod）相关，并且其中如果‘f’为约1x103–5x103，则关于未知核酸的lod为约102–103个拷贝/ml。b8.条款b1-b7中任何一个或多个的方法，其中‘f’与ngs测定的检测限（lod）相关，并且其中如果‘f’为约1x104–5x104，则关于未知核酸的lod为约101–102个拷贝/ml。b9.条款b1-b8中任何一个或多个的方法，其进一步包括：将样品中的多个未知核酸（如果存在的话）的输入数量（iqti，iqtj，iqtk…iqtn）计算为iqtn=归于“第n”未知核酸的归一化的未知“n”个核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）。b10.条款b1-b9中任何一个或多个的方法，其进一步包括合并两个或更多个样品，并且使其同时经受测序，其中所述两个或更多个样品在制备之后和在测序之前进行合并。b11.条款b1-b10中任何一个或多个的方法，其中每个合并的样品具有与之相关的一组独特的样品特异性鉴定序列，使得可以区别且分开来自该库中的每个样品的测序数据。b12.条款b1-b11中任何一个或多个的方法，其中每个合并的样品具有其自身的内部定量标准品，所述内部定量标准品与其自身的一组独特的样品特异性鉴定序列相关，并且其中将定量分开地应用于来自该库中的每个样品的每种核酸。b13.条款b1-b12中任何一个或多个的方法，其进一步包括：将合并样品中的多个未知核酸的输入数量（iqti，iqtj，iqtk…iqtn）计算为iqtn=归于“第n”未知核酸的归一化的未知“n”个核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）。b14.条款b1-b13中任何一个或多个的方法，其进一步包括提供样品中待测序的一组测定特异性阳性对照，其中所述阳性对照包括对应于测定中测序的一种或多种未知核酸各自的阳性对照。b15.条款b1-b14中任何一个或多个的方法，其进一步包括基于测定特异性阳性对照的测序，将测定特异性校正因子应用于一种或多种未知核酸中的每种。b16.条款b1-b15中任何一个或多个的方法，其中执行定量ngs测定并不包括执行相对定量。b17.条款b1-b16中任何一个或多个的方法，其中执行定量ngs测定并不包括在与测序测定分开的反应中执行定量。b18.条款b1-b17中任何一个或多个的方法，其中执行定量ngs测定并不包括使用测定或模板特异性定量标准品。b19.条款b1-b18中任何一个或多个的方法，其中执行定量ngs测定并不包括使用竞争性模板作为定量标准品。c1.一种用于对下一代测序（ngs）测定中的未知核酸进行归一化和定量的试剂盒，其包括：内部定量标准品，其中所述内部定量标准品是配置为待以已知量加入样品中的核酸，所述样品包含待测序的未知核酸；和关于使用内部定量标准品用于对测序数据集进行归一化、以及用于计算未知核酸的输入数量的说明书，其中所述内部定量标准品被配置为待以约104-106个拷贝/ml的范围加入样品中，其中使用所述内部定量标准品，通过norm=测序读取数*（f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数），对测序数据进行归一化，其中‘f’是固定的内部定量标准品测序读数的最小预计数目，和其中使用所述内部定量标准品，通过iqt=源于未知核酸的归一化的未知核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f），来计算未知核酸的输入数量（iqt）。c2.条款c1的试剂盒，其进一步包括用于至少内部定量标准品的测序特异性衔接子，其包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列。c3.条款c1或条款c2中至少一个的试剂盒，其进一步包括具有定制突出端的靶特异性引物，其配置用于扩增内部定量标准品，并且用于对测序特异性衔接子退火或连接。c4.条款c1-c3中至少一个的试剂盒，其进一步包括两种或更多种内部定量标准品，其中所述两种或更多种内部定量标准品各自配置为以不同的已知浓度加入样品中，用于生成用于定量未知核酸的标准曲线。d1.一种用于执行比较物研究的方法，其包括：提供包含一种或多种靶核酸的多重扩增和检测的第一测定，该第一测定具有检测限（lod）；提供不同于第一测定的第二测定，用于确认检测和第一测定的lod，其中所述第二测定包括：制备用于测序的包含至少一种内部定量标准品的样品；测序以生成样品的测序数据集，其中所述测序数据集包括从靶核酸和内部定量标准品观察到的测序读数；计数测序数据集中源于靶核酸和内部定量标准品的测序读取数；和对测序数据集进行归一化，其中所述归一化（1）基于关于样品的内部定量标准品的测序读数的最小数目的存在，将数据接受/拒绝标准应用于测序数据集，并且（2）确保将基本上相同的检测限（lod）应用于测序测定中的所有未知核酸，并且其中第二测定的lod与第一测定的lod基本上相同。d2.条款d1的方法，其中所述第一测定进一步包括向样品中添加一种或多种内部定量标准品，并且对所述样品执行定量两步扩增，所述定量两步扩增包括：在第一阶段多重扩增混合物中扩增样品，该扩增混合物包含多个靶引物，每个靶引物配置为扩增可能存在于样品中的不同靶，以及至少一个定量标准品引物，该定量标准品引物配置为扩增内部定量标准品核酸，将第一阶段扩增混合物分成多个第二阶段个别反应，各自包含至少一个引物的第一组多个第二阶段个别反应，所述引物配置为进一步扩增可能存在于样品中的不同靶之一，以及各自包含至少一个引物的第二组多个第二阶段个别反应，所述引物配置为进一步扩增内部定量标准品核酸之一，和使多个第二阶段个别反应经受扩增条件，以生成一个或多个靶扩增子和多个定量标准品扩增子，每个定量标准品扩增子具有相关的定量标准品cp，其中每种靶核酸具有交叉点（cp），并且每个内部标准品在第一测定中具有已知浓度和已知定量标准品cp。d3.条款d1或条款d2中至少一个的方法，其进一步包括由定量标准品cp生成标准曲线；和使用标准曲线来定量一种或多种靶核酸中的每种。d4.条款d1-d3中任何一个或多个的方法，其中使用标准曲线来定量每种靶核酸，所述标准曲线使用对以下的最小二乘回归线拟合生成log10（浓度）=（cp-b）/a其中cp是对于每个靶测量的交叉点，b，截距，代表当靶的log10（浓度）为零时的cp值，和a是代表cp随着浓度中的单个单位改变而改变的程度的斜率。d5.条款d1-d4中任何一个或多个的方法，其进一步包括通过norm=测序读取数*（f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数），对第二测定中的测序数据集进行归一化。d6.条款d1-d5中任何一个或多个的方法，通过iqt=源于靶核酸的归一化的靶核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f），来计算样品中的每种靶核酸的输入数量（iqt），其中‘f’是固定的内部定量标准品测序读数的最小预计数目。d7.条款d1-d6中任何一个或多个的方法，其中‘f’与第二测定的检测限（lod）相关，并且其中所述第二测定的lod选择为与所述第一测定的lod基本上相同。d8.条款d1-d7中任何一个或多个的方法，其中如果‘f’为约1x103–5x103，则所述第二测定中用于检测靶核酸的lod为约102–103个拷贝/ml。d9.条款d1-d中任何一个或多个的方法，其中如果‘f’为约1x104–5x104，则所述第二测定中用于检测靶核酸的lod为约101–102个拷贝/ml。d10.条款d1-d9中任何一个或多个的方法，其进一步包括：将样品中的多重靶核酸（如果存在的话）的输入数量（iqti，iqtj，iqtk…iqtn）计算为iqtn=归于“第n”未知核酸的归一化的未知“n”个核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）。d11.条款d1-d10中任何一个或多个的方法，其进一步包括合并两个或更多个样品，并且使其在第二测定中同时经受测序，其中所述两个或更多个样品在制备之后和在测序之前进行合并。d12.条款d1-d11中任何一个或多个的方法，其中每个合并的样品具有与之相关的一组独特的样品特异性鉴定序列，使得可以区别且分开来自该库中的每个样品的测序数据。d13.条款d1-d12中任何一个或多个的方法，其中每个合并的样品具有其自身的内部定量标准品，所述内部定量标准品与其自身的一组独特的样品特异性鉴定序列相关，并且其中定量被分开地应用于来自库中的每个样品的每种核酸。d14.条款d1-d13中任何一个或多个的方法，其进一步包括：将合并样品中的多个未知核酸的输入数量（iqti，iqtj，iqtk…iqtn）计算为iqtn=归于“第n”未知核酸的归一化的未知“n”个核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）。d15.条款d1-d14中任何一个或多个的方法，其中所述定量标准品核酸和靶核酸都具有相似的扩增效率和测序效率。d16.条款d1-d15中任何一个或多个的方法，其中所述第二测定是下一代测序测定。d17.条款d1-d16中任何一个的方法，其中所述第二测定并不包括执行相对定量，d18.条款d1-d17中任何一个的方法，其中所述第二测定并不包括在与测序测定分开的反应中执行定量。d19.条款d1-d18中任何一个的方法，其中所述第二测定并不包括使用测定或模板特异性定量标准品。d20.条款d1-d19中任何一个的方法，其中所述第二测定并不包括使用竞争性模板作为定量标准品。在用于执行比较物研究的方法的任何前述实施方案中，第二测定可以是下一代测序测定。提供本概述以简化形式介绍选择的概念，所述概念在下文附图和详述中进一步描述。本概述既不预期鉴定请求保护的主题的关键特点或必要特点，也不预期用作确定请求保护的主题的范围的帮助。另外的特点和优点将在下述描述中阐述，并且部分基于描述将是明确的，或者可以通过本发明的实践来学习。这些和其它特点根据下述描述和所附权利要求将变得更加明显，或者可以通过如下文阐述的本发明的实践来学习。附图简述为了描述其中可以获得本发明的上述和其它优点和特点的方式，将通过参考在附图中示出的其特定实施方案来呈现上文简要描述的本发明的更具体的描述。应理解这些附图仅描绘了本发明的典型实施方案，并且因此不应视为对其范围的限制，本发明将通过使用附图用另外的特异性和细节进行描述和解释，在所述附图中：图1显示了根据本发明的一个实施方案的柔性小袋（pouch）。图2一起形成根据本发明的示例性实施方案，用于与图1的小袋一起使用的仪器的分解透视图，包括图1的小袋。图3显示了根据本发明的示例性实施方案，图2的仪器的局部横截面视图，包括图2的气囊部件，其中图1的小袋以虚线显示。图4显示了在图2的仪器的一个说明性实施方案中使用的电动机。图5显示了跨越四种不同的预期合成定量标准品的五个稀释度的cp。图6a类似于图5，但仅显示了关于三种定量标准品的数据。图6b显示了使用来自所有三种定量标准品的数据的单一曲线。图7显示了关于鲍氏不动杆菌（a.baumannii）的标准曲线连同由三种定量标准品生成的曲线。x轴是反应中包括的鲍氏不动杆菌或定量标准品的量，并且y轴是cp。图8a显示了来自定量标准品的复合标准曲线和对于鲍氏不动杆菌特异性的外部标准曲线，不含校正。图8b显示了与图8a相同的数据，具有测定特异性校正因子。图9示出了关于三个样品a、b和c的假设测序数据集。图10显示了关于合并样品集的原始测序计数。图11显示了图10的合并样品集中内部定量标准品（在本文中也称为qsm）片段计数/样品。图12示出了用于对测序数据集进行建仓（binning）和归一化的两种替代方法。图13示出了测序样品制备工作流的实施例。图14显示了在痰样品群体中的细菌和/或病毒载量分布。图15显示了pcr扩增曲线，其示出了用于保存测序反应的动态范围的方法，其中建立和停止反应，使得高拷贝靶处于平台期，而低拷贝靶处于指数扩增期。图16显示了通过测定的分批阳性对照（pc）定量。详述下文参考附图描述了示例性实施方案。许多不同的形式和实施方案是可能的，而不背离本公开内容的精神和教导，并且因此公开内容不应被解释为限于本文阐述的示例性实施方案。相反，提供这些示例性实施方案使得本公开内容将是彻底和完整的，并且将本公开内容的范围传达给本领域技术人员。在附图中，为了清楚起见，可夸大层和区域的尺寸和相对尺寸。在说明书自始至终，相同的参考数目表示相同的元件。除非另有定义，否则本文使用的所有术语（包括技术和科学术语）具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。将进一步理解，术语例如在通常使用的词典中定义的那些，应当被解释为具有与其在本申请和相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且不应该以理想化或过度形式化的意义来解释，除非在本文中明确如此定义。本文的本发明描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不预期限制本发明。虽然本文仅描述了某些示例性材料和方法，但与本文描述的那些类似或等价的许多方法和材料可以用于本公开内容的实践中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利或其它参考文献都整体引入作为参考。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。本公开内容的各个方面，包括装置、系统、方法等可以参考一个或多个示例性实现来说明。如本文使用的，术语“示例性”和“说明性”意指“充当示例、实施例或说明”，并且不一定应该解释为比本文公开的其它实施优选或有利。另外，对本公开内容或本发明的“实施”或“实施方案”的提及包括对其一个或多个实施方案的具体提及，且反之亦然，并且预期提供说明性示例而不限制本发明的范围，所述本发明的范围由所附权利要求而不是下述描述指示。应注意，如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非内容另有明确说明。因此，例如，对“分块（tile）”的提及包括一个、两个或更多个分块。类似地，除非内容和/或上下文另有明确说明，否则对多个指示物的提及应该被解释为包括单个指示物和/或多个指示物。因此，对“分块”的提及不一定需要多个此类分块。相反，应理解，不依赖于缀合；本文考虑了一个或多个分块。如在本申请自始至终使用的，词语“可以”和“可能”以允许性意义（即，意味着具有潜力），而不是强制性意义（即，意味着必须）使用。另外，术语“包括（including）”、“具有（having）”、“涉及（involving）”、“含有（containing）”、“特征在于”、其变体（例如，“包括”（includes）、“具有（has）”、“涉及（involves）”、“含有（contains）”等）、以及如本文包括权利要求使用的类似术语，应为包容性和/或开放性的，应具有与词语“包含（comprising）”及其变体（例如“包含（comprise）”和“包含（comprises）”）相同的含义，并且不排除另外的未叙述的说明性元件或方法步骤。如本文使用的，方向和/或任意术语，例如“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“上”、“下”、“上部”、“下部”、“内”、“外”、“内部”、“外部”、“内在”、“外在”、“近端”、“远端”、“前面”、“背面”等等可以仅用于指示相对方向和/或取向，并且可以不在其它方面预期限制本公开内容，包括说明书、发明和/或权利要求的范围。应理解，当元件被称为“联接”、“连接”或“响应”另一个元件或“在另一个元件上”时，它可以直接联接、连接、或响应另一个元件或在另一个元件上，或者也可以存在插入元件。相反，当元件被称为“直接联接”、“直接连接”或“直接响应”另一个元件或“直接在另一个元件上”时，不存在插入元件。本发明构思的示例性实施方案在本文中参考横截面图示进行描述，所述横截面图示是示例性实施方案的理想化实施方案（和中间结构）的示意图。像这样，预期由于例如制造技术和/或公差与图示形状的变化。因此，本发明构思的示例性实施方案不应被解释为限于本文示出的区域的特定形状，而是包括例如起因于制造的在形状中的偏差。相应地，附图中示出的区域本质上是示意性的，并且它们的形状不预期示出装置的区域的实际形状，并且不预期限制示例性实施方案的范围。应理解，尽管术语“第一”、“第二”等在本文中可以用于描述各种元件，但这些元件不应受这些术语的限制。这些术语仅用于区别一个元件与另一个元件。因此，“第一”元件可以被称为“第二”元件，而不脱离本实施方案的教导。还应理解，本文描述的各种实现可以与所描述或公开的任何其它实现组合利用，而不脱离本公开内容的范围。因此，根据本公开内容的某些实现的产品、构件、元件、装置、仪器、系统、方法、过程、组合物和/或试剂盒可以包括、掺入或以其它方式包含本文公开的其它实现（包括系统、方法、仪器和/或类似物）中描述的性质、特点、部件、构件、元件、步骤和/或类似物，而不脱离本公开内容的范围。因此，对与一个实现有关的特定特点的提及不应被解释为仅限于在所述实现内的应用。本文使用的标题仅用于组织目的，并不意味着用于限制说明书或权利要求的范围。为了便于理解，在可能时，相同的参考数目已用于表示附图共有的相同元件。此外，在可能时，在各个图中已使用了元件的相同编号。此外，特定元件的替代配置可以各自包括附加到元件编号的分开字母。术语“约”在本文中用于意指大约、在大致或大概的区域。当术语“约”与数目范围结合使用时，它通过扩展在所述数目的之上和之下的边界来修改该范围。一般而言，术语“约”在本文中用于将所述值之上和之下的数值修改5%的变化。当表达此类范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解该特定值形成另一个实施方案。应进一步理解，每个范围的端点相对于另一个端点并且独立于另一个端点均为有意义的。如本文使用的，词语“或”意指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。“样品”意指动物；来自动物的组织或器官；细胞（在受试者体内、直接取自受试者、或维持在培养物中或来自培养细胞系的细胞）；细胞裂解产物（或裂解产物级分）或细胞提取物；含有衍生自细胞、细胞材料或病毒材料（例如多肽或核酸）的一种或多种分子的溶液；或含有非天然存在的核酸示例性地cdna或下一代测序文库的溶液，其如本文所述进行测定。样品也可以是任何体液或排泄物（例如，但不限于血液、尿、粪便、唾液、泪、胆汁或脑脊髓液），其可能含有或不含有宿主或病原体细胞、细胞组分或核酸。如本文使用的，短语“核酸”指天然存在的或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论是dna还是rna或dna-rna杂交体、单链或双链、有义或反义，其能够通过沃森-克里克碱基配对与互补核酸杂交。本发明的核酸还可以包括核苷酸类似物（例如brdu）、经修饰或处理的碱基和非磷酸二酯核苷间键合（例如肽核酸（pna）或硫代二酯键合）。特别地，核酸可以包括但不限于dna、cdna、gdna、ssdna、dsdna、rna包括所有rna类型例如mirna、mtrna、rrna、包括编码区或非编码区、或其任何组合。“探针”、“引物”或“寡核苷酸”意指具有限定序列的单链核酸分子，其可以与含有互补序列的第二核酸分子（“靶”）碱基配对。所得到的杂交体的稳定性取决于长度、gc含量和碱基配对发生的程度。碱基配对的程度受参数例如探针和靶分子之间的互补程度以及杂交条件的严格程度影响。杂交严格程度受参数例如温度、盐浓度和有机分子如甲酰胺的浓度影响，并且通过本领域技术人员已知的方法测定。探针、引物和寡核苷酸可以通过本领域技术人员众所周知的方法，放射性、荧光或非放射性地可检测标记。dsdna结合染料可以用于检测dsdna。应理解，“引物”特别配置为通过聚合酶延伸，而“探针”或“寡核苷酸”可以如此配置或不如此配置。作为探针，寡核苷酸可以用作本领域已知的许多荧光pcr引物和基于探针的化学物质的部分，包括共享荧光猝灭和/或荧光共振能量转移（fret）配置的使用的那些，例如5'核酸酶探针（taqman®探针）、双杂交探针（hybprobes®）、或eclipse®探针或分子信标、或amplifluor®测定例如scorpions®、lux®或qzyme®pcr引物，包括具有天然或经修饰的碱基的那些。“dsdna结合染料”意指当与双链dna结合时比与单链dna结合或在溶液中游离时差异发荧光的染料，通常通过更强烈地发荧光。虽然提及了dsdna结合染料，但应理解本文可以使用任何合适的染料，其中一些非限制性说明性染料描述于美国专利号7,387,887中，其引入本文作为参考。其它产生信号的物质可以用于检测核酸扩增和解链，示例性地酶、抗体等，如本领域已知的。“特异性杂交”意指探针、引物或寡核苷酸在高严格条件下识别基本上互补的核酸（例如，样品核酸）并与其物理相互作用（即，碱基配对），并且基本上不与其它核酸碱基配对。“高严格条件”意指在约解链温度（tm）减5℃下（即，比核酸的tm低5°）。在功能上，高严格条件用于鉴定具有至少80%序列同一性的核酸序列。虽然pcr是本文实施例中使用的扩增方法，但应理解使用引物的任何扩增方法都是合适的。此类合适的程序包括任何类型（单步、两步或其它）的聚合酶链反应（pcr）；链置换扩增（sda）；基于核酸序列的扩增（nasba）；级联滚环扩增（crca）、dna的环介导等温扩增（lamp）；等温和嵌合引物引发的核酸扩增（ican）；基于靶的解旋酶依赖性扩增（hda）；转录介导的扩增（tma）、下一代测序技术等等。因此，当使用术语pcr时，它应理解为包括其它替代扩增方法，包括氨基酸定量方法。对于不含不连续循环的扩增方法，可以使用其中测量以循环或cp进行的反应时间，并且可以添加其中在本文描述的实施方案中添加另外的pcr循环的另外反应时间。应理解可能需要相应地调整方案。如本文使用的，术语“交叉点”（cp）（或可替代地，循环阈值（ct）、定量循环（cq）或本领域中使用的同义术语）指获得高于给定的pcr产物（例如靶或内部标准品）的某个阈值的荧光信号所需的pcr循环数，如在实验上确定的。其中每个反应上升高于阈值的循环取决于在pcr反应开始时存在的靶（即反应模板）的量。阈值通常可以设置为其中可检测到高于背景荧光的产物的荧光信号的点；然而，可以采用其它阈值。作为设置略微任意的阈值的替代方案，可以通过计算在其下一阶、二阶或n阶导数具有其最大值的反应点来确定cp，其确定在其下扩增曲线的曲率是最大的循环。美国专利号6,303,305中教导了说明性的衍生方法，所述美国专利整体引入本文作为参考。然而，只要对于待比较的所有反应使用相同的阈值，通常在何处或如何设置阈值不太重要。如本领域中已知的，也可以使用其它点，并且在本文讨论的任何方法中，任何此类点可以取代cp、ct或cq。“样品处理对照”意指病原体、微生物、细胞（无论是否存活）、核酸、或者天然或合成的任何颗粒，具有模拟病原体或其一部分、或核酸及其在样品工作流期间的行为的能力。样品处理对照经常以已知量包括在装置中，以控制由样品遵循的工作流的一些或所有步骤，说明性地确保样品已被正确裂解，潜在感染靶病原体的核酸已被正确提取和纯化，并且靶病原体的特定序列的正确扩增和检测已发生。说明性地，用作样品处理对照的微生物（说明性地粟酒裂殖酵母（schizosaccharomycespombe）（粟酒裂殖酵母（s.pombe））尽可能接近地模拟待检测和定量的靶微生物。样品处理对照颗粒可以复制待检测病原体的结构（例如膜和/或衣壳和/或包膜），允许其模拟病原体及其靶核酸沿着工作流的行为。样品过程对照的目标是确保靶的裂解和核酸提取产率与样品处理对照的产率相似，并且适当地处理纯化的核酸以确保最佳扩增/检测。对于定性结果，病原体可以报告为阳性或阴性，或者如果运行对照失败，则可以报告为未确定的。样品处理对照可以是几种运行对照之一，并且应该是阳性的，并且可能在指定范围内，以验证运行，因为一些抑制条件可以降低提取、纯化或pcr扩增/检测的产率。样品处理对照可以用于监测这种抑制，产量的降低在样品处理对照和靶病原体之间是相似的。对于定性结果，如果未检测到此类抑制，则可以导致假阴性结果。对于定量结果，工作流的步骤之一的抑制可以提供低估的定量结果。因此，本发明的几个说明性实施方案使用至少一个样品处理对照（spc）用于至少两个目标：1）控制和验证工作流：如上所述的spc的经典作用，和2）帮助定量测试样品中的靶核酸：spc的新作用，其也用作定量标准品。说明性地，spc遵循样品所经受的一些或全部过程。因此，可以在样品裂解的步骤之前或期间添加spc。可以基于靶病原体的类型来选择样品处理对照。例如，可以选择细菌噬菌体如phix174用于针对病毒的测定，细菌噬菌体是模拟靶病毒、或酵母例如粟酒裂殖酵母的良好候选物，用于广泛的细菌和酵母定量测定中。如果待检测单一病原体，则可以设计两种扩增测定，说明性地pcr测定（靶病原体和用作定量标准品的样品处理对照），以达到相同或相似的热力学特征，并且使得能够使用合成定量标准品准确定量（如实施例5中）。对于多种病原体的定量（即多重扩增），（说明性地由于序列可变性和扩增子长度）可能难以使样品处理对照的扩增方案，（说明性地pcr设计）与扩增测定的方案（说明性地关于每种病原体的pcr测定）拟合，以获得相同的热力学特征。因此，不同靶病原体的pcr效率可能不同。为此，对于每种病原体可以计算校正因子，所述校正因子将获得的定量与定量标准品和输入的标准曲线相关联。在合成定量标准品的替代方案中，可以针对具有已知浓度的已知天然微生物或针对其它天然存在的核酸模板进行校准。在本发明的另一个实施方案中，还能够在具有至少两种不同的，说明性的三种或四种不同的样品处理对照的任何扩增系统中可靠地定量病原体，条件是这些样品处理对照可以经由已知的鉴定技术，例如荧光、放射性、化学发光、酶促等等标记的序列特异性探针进行鉴定，如本领域已知的。虽然本文的各种实施例提及人靶和人病原体，但这些实施例仅是说明性的。本文描述的方法、试剂盒和装置可以用于检测和测序来自广泛多种样品，包括人、兽医、工业和环境的广泛多种核酸序列。本文公开的各种实施方案使用独立的核酸分析小袋来测定样品中各种生物物质的存在，说明性地抗原和核酸序列，说明性地在单个封闭系统中。此类系统，包括小袋和用于与小袋一起使用的仪器更详细地公开于美国专利号8,394,608；和8,895,295；以及美国专利申请号2014-0283945中，所述专利引入本文作为参考。然而，应理解，此类仪器和小袋仅是说明性的，并且本文讨论的核酸制备和扩增反应可以在如本领域已知的各种开放或封闭系统样品器皿中的任一种中执行，包括96孔板、其它配置的平板、阵列、转盘等等，使用各种核酸纯化和扩增系统，如本领域已知的。虽然本文使用术语“样品孔”、“扩增孔”、“扩增容器”等等，但这些术语意欲涵盖如这些扩增系统中使用的孔、管和各种其它反应容器。此类扩增系统可以包括扩增容器中的单个多重步骤，并且可以任选地在多个个别反应孔中包括多个第二阶段个别或更低级的多重反应。在一个实施方案中，小袋用于测定多种病原体。小袋可以包括用作样品孔的一个或多个泡罩，说明性地在封闭系统中。说明性地，可以在任选的一次性使用的小袋中执行各种步骤，包括核酸制备、初级大体积多重pcr、初级扩增产物的稀释和二次pcr，最后为任选的实时检测或扩增后分析例如解链曲线分析。此外，应理解，虽然可以在本发明的小袋中执行各个步骤，但对于某些用途可以省略一个或多个步骤，并且小袋配置可以相应地改变。图1显示了可以在各种实施方案中使用，或者可以对于各种实施方案重新配置的说明性小袋510。小袋510类似于美国专利号8,895,295的图15，其中相同的项目编号相同。配件590提供有入口通道515a到515l，其也充当试剂贮存器或废物贮存器。说明性地，试剂可以在配件590中冷冻干燥并且在使用前再水合。泡罩522、544、546、548、564和566以及它们各自的通道514、538、543、552、553、562和565类似于美国专利号8,895,295的图15的相同编号的泡罩。图1的第二阶段反应区580类似于美国专利申请号8,895,295的那种，但高密度阵列581的第二阶段反应区582以稍微不同的图案排列。图1的高密度阵列581的更圆形图案消除了拐角处的孔，并且可以导致第二阶段孔582的更均匀填充。如所示，高密度阵列581提供有102个第二阶段孔582。小袋510适用于filmarray®仪器（biofirediagnostics，llc，saltlakecity，ut）。然而，应理解，小袋实施方案仅是说明性的。虽然可以使用其它容器，但说明性地，小袋510由两层柔性塑料薄膜或其它柔性材料形成，所述其它柔性材料例如聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯（pet）、聚碳酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯及其混合物，其可以通过本领域已知的任何方法制备，所述方法包括挤出、等离子体沉积和层压。也可以使用具有铝层压结构的金属箔或塑料。其它阻隔材料是本领域已知的，其可以密封在一起以形成泡罩和通道。如果使用塑料薄膜，则可以说明性地通过热封将这些层粘合在一起。说明性地，该材料具有低核酸结合能力。对于采用荧光监测的实施方案，优选吸光度足够低且在操作波长下自发荧光的塑料薄膜。可以通过测试不同的塑料、不同的增塑剂和复合比率以及不同厚度的薄膜来鉴定此类材料。对于具有铝或其它箔层压结构的塑料，待通过荧光检测装置读取的小袋的部分可以无需箔而留下。例如，如果在小袋510的第二阶段反应区580的第二阶段孔582中监测到荧光，则在孔582处的一个或两个层将无需箔而留下。在pcr的例子中，由约0.0048英寸（0.1219mm）厚的聚酯（mylar，dupont，wilmingtonde）和0.001-0.003英寸（0.025-0.076mm）厚的聚丙烯薄膜组成的薄膜层压结构表现良好。说明性地，小袋510由能够透射大约80%-90%的入射光的透明材料制成。在说明性实施方案中，通过在泡罩和通道上施加压力，说明性地气动压力，使材料在泡罩之间移动。相应地，在采用压力的实施方案中，小袋材料说明性地足够柔性，以允许压力具有所需效应。术语“柔性”在本文中用于描述小袋的材料的物理特征。术语“柔性”在本文中定义为易于通过本文使用的压力水平变形，而不破裂、破坏、开裂等等。例如，薄的塑料片，例如saran™包装和ziploc®袋，以及薄金属箔，例如铝箔，是柔性的。然而，即使在采用气动压力的实施方案中，仅泡罩和通道的某些区域需要是柔性的。此外，泡罩和通道的仅一侧需要是柔性的，只要泡罩和通道易于变形。小袋510的其它区域可以由刚性材料制成，或者可以用刚性材料强化。说明性地，塑料薄膜用于小袋510。可以研磨或以其它方式切割金属片，示例性地铝或其它合适材料，以产生具有凸起表面图案的模具。当安装到气动压力机（说明性地a-5302-pds，janesvilletoolinc.，miltonwi）时，说明性地在195℃的操作温度下调节，气动压力机像印刷机一样工作，熔化模具仅在其中接触薄膜的塑料薄膜的密封表面。随着小袋510形成，各种组分，例如pcr引物（说明性地点在薄膜上并干燥）、抗原结合基底、磁珠和硅酸锆珠可以密封在各种泡罩内。用于样品处理的试剂可以在密封之前共同地或分开地点在薄膜上。在一个实施方案中，核苷酸三磷酸将（ntp）与聚合酶和引物分开点在薄膜上，基本上消除了聚合酶的活性，直到反应被含水样品水合。如果含水样品在水合之前已加热，则这为真正的热启动pcr创造了条件，并且减少或消除了对于昂贵的化学热启动组分的需求。小袋510可以以与美国专利号8,895,295中描述的那种类似的方式使用。在一个说明性实施方案中，将包含待测试样品（100μl）和裂解缓冲液（200μl）的300μl混合物注入入口通道515a附近的配件590中的注入口（未示出），并且将样品混合物抽取到入口通道515a内。水也被注入到与入口通道515l相邻的配件590的第二注入口（未示出）内，并且经由配件590中提供的通道（未示出）分配，从而水合高达11种不同的试剂，所述试剂各自先前在入口通道515b到515l处以干燥形式提供。这些试剂说明性地可以包括冷冻干燥的pcr试剂、dna提取试剂、洗涤溶液、免疫测定试剂或其它化学实体。说明性地，所述试剂用于核酸提取、第一阶段多重pcr、多重反应的稀释、和第二阶段pcr试剂的制备以及对照反应。在图1所示的实施方案中，所有需要注入的是一个注入口中的样品溶液和另一个注入口中的水。注入后，可以密封两个注入口。关于小袋510和配件590的各种配置的更多信息，参见已经引入作为参考的美国专利号8,895,295。在注入后，样品经由通道514从注入通道515a移动到裂解泡罩522。裂解泡罩522提供有珠或颗粒534，例如陶瓷珠，并且配置为使用在filmarray®仪器中提供的旋转叶片或桨叶，经由撞击用于涡旋。通过在裂解颗粒如硅酸锆（zs）珠534的存在下摇动或涡旋样品的珠磨，是形成裂解产物的有效方法。应理解，如本文使用的，术语例如“裂解（lyse）”、“裂解（lysing）”和“裂解产物”并不限于破裂细胞，相反此类术语包括非细胞颗粒例如病毒的破坏。图4显示了珠击打电动机819，其包括叶片821，所述叶片821可以安装在图2中所示的仪器800的支撑构件802的第一侧811上。叶片可以延伸穿过槽804以接触小袋510。然而，应理解，电动机819可以安装在仪器800的其它结构上。在一个说明性实施方案中，电动机819是安装在支撑构件802上的mabuchirc-280sa-2865dcmotor（chiba，日本）。在一个说明性实施方案中，电动机以5,000至25,000rpm，更说明性地10,000至20,000rpm，且再更说明性地大约15,000至18,000rpm转动。对于mabuchi电动机，已发现7.2v提供足够的rpm用于裂解。然而，应理解，当叶片821撞击小袋510时，实际速度可能稍微慢一些。取决于所使用的电动机和桨叶，其它电压和速度可以用于裂解。任选地，可以将受控的小体积空气提供到与裂解泡罩522相邻的气囊822内。已发现，在一些实施方案中，用一个或多个小体积空气部分填充相邻气囊帮助在裂解过程期间定位和支撑裂解泡罩。可替代地，其它结构，说明性地裂解泡罩522周围的刚性或顺应性垫圈或其它保持结构，可以用于在裂解期间约束小袋510。还应理解，电动机819仅是说明性的，并且其它装置可以用于研磨、摇动或涡旋样品。一旦细胞已被充分裂解，样品就通过通道538、泡罩544和通道543移动到泡罩546，在其中样品与核酸结合物质，例如二氧化硅涂布的磁珠533混合。允许混合物温育适当的时间长度，说明性地大约10秒至10分钟。位于与泡罩546相邻的仪器内的可伸缩磁体从溶液中捕获磁珠533，形成抵靠泡罩546内表面的团块。然后将液体移出泡罩546并且通过泡罩544返回并进入泡罩522内，所述泡罩522现在用作废物容器。来自注入通道515c至515e中的一个或多个的一种或多种洗涤缓冲液经由泡罩544和通道543提供至泡罩546。任选地，使磁体缩回，并且通过经由通道543从泡罩544和546来回移动珠来清洗磁珠533。一旦磁珠533被洗涤，就通过启动磁体将磁珠533重新捕获在泡罩546中，然后将洗涤溶液移至泡罩522。可以根据需要重复该过程，以从核酸结合磁珠533中洗涤裂解缓冲液和样品碎片。在洗涤后，将贮存在注入通道515f中的洗脱缓冲液移至泡罩548，并且使磁体缩回。溶液经由通道552在泡罩546和548之间循环，打碎泡罩546中的磁珠533的团块，并且允许捕获的核酸与珠脱离并进入溶液内。再次启动磁体，捕获泡罩546中的磁珠533，并且将洗脱的核酸溶液移入泡罩548内。将来自注入通道515g的第一阶段pcr主混合物与泡罩548中的核酸样品混合。任选地，通过经由通道553迫使混合物在548和564之间来混合混合物。在几个混合循环之后，溶液包含在泡罩564中，在其中提供第一阶段pcr引物的团块，对于每个靶的至少一组引物，并且执行第一阶段多重pcr。如果存在rna靶，则可以在第一阶段多重pcr之前或同时执行逆转录（rt）步骤。filmarray®仪器中的第一阶段多重pcr温度循环说明性地执行15-30个循环，尽管根据具体应用的要求，其它水平的扩增可能是期望的。如本领域已知的，第一阶段pcr主混合物可以是各种主混合物中的任一种。在一个说明性实施例中，第一阶段pcr主混合物可以是us2015/0118715中公开的任何化学物质，所述专利引入本文作为参考，用于与每个循环花费20秒或更少的pcr方案一起使用。在第一阶段pcr已进行所需数目的循环后，可以将样品稀释，说明性地通过迫使大部分样品回到泡罩548内，在泡罩564中仅留下少量，并且从注入通道515i添加第二阶段pcr主混合物。可替代地，可以将来自515i的稀释缓冲液移至泡罩566，然后通过在泡罩564和566之间来回移动流体，与泡罩564中的扩增样品混合。如果需要的话，可以使用来自注入通道515j和515k的稀释缓冲液重复稀释几次，或者可以保留注入通道515k用于测序或用于其它pcr后分析，然后将来自注入通道515h的第二阶段pcr主混合物添加到一些或全部稀释的扩增样品中。应理解，可以通过改变稀释步骤的数目，或通过在与稀释缓冲液或第二阶段pcr主混合物混合之前改变丢弃的样品百分比来调节稀释水平，所述第二阶段pcr主混合物包含用于扩增的组分，说明性地聚合酶、dntp和合适的缓冲液，尽管其它组分可能是合适的，特别是对于非pcr扩增方法。如果需要的话，样品和第二阶段pcr主混合物的这种混合物可以在移动到第二阶段孔582之前在泡罩564中预热，用于第二阶段扩增。此类预热可以避免在第二阶段pcr混合物中热启动组分（抗体、化学或其它）的需要。说明性的第二阶段pcr主混合物是不完整的，缺少引物对，并且102个第二阶段孔582中的每一个预加载有特异性pcr引物对（或有时多个引物对）。如果需要的话，第二阶段pcr主混合物可以缺少其它反应组分，并且这些组分也可以预加载在第二阶段孔582中。每个引物对可以与第一阶段pcr引物对相似或相同，或者可以嵌套在第一阶段引物对内。样品从泡罩564移动到第二阶段孔582完成pcr反应混合物。一旦填充了高密度阵列581，就通过任何数目的手段将个别第二阶段反应密封在它们各自的第二阶段泡罩中，如本领域已知的。在已经引入作为参考的美国专利号8,895,295中讨论了填充和密封高密度阵列581而无交叉污染的说明性方法。说明性地，高密度阵列581的孔582中的各种反应同时进行热循环，说明性地使用一个或多个peltier装置，尽管用于热循环的其它装置是本领域已知的。在某些实施方案中，第二阶段pcr主混合物含有dsdna结合染料lcgreen®plus（biofirediagnostics，llc），以生成指示扩增的信号。然而，应理解，该染料仅是说明性的，并且可以使用其它信号，包括其它dsdna结合染料和荧光、放射性、化学发光、酶促等等标记的探针，如本领域已知的。可替代地，阵列581的孔582可以无需信号而提供，其中结果通过后续处理报告。当气动压力用于移动小袋510内的材料时，在一个实施方案中，可以采用“气囊”。气囊组件810，其一部分在图2a-b和3中示出，包括容纳多个可充气气囊822、844、846、848、864和866的气囊板824，所述气囊各自可以（说明性地通过压缩气体源）个别地充气。因为气囊组件810可以经受压缩气体并且多次使用，所以气囊组件810可以由比小袋更坚韧或更厚的材料制成。可替代地，气囊822、844、846、848、864和866可以由用垫圈、密封件、阀和活塞紧固在一起的一系列板形成。其它布置也在本发明的范围内。次级pcr反应的成功取决于由多重第一阶段反应生成的模板。通常，使用高纯度的dna执行pcr。方法例如苯酚提取或商业dna提取试剂盒提供了高纯度的dna。通过小袋510处理的样品可能需要调整以补偿较不纯的制剂。pcr可以被生物样品的组分抑制，这是潜在的障碍。说明性地，热启动pcr、更高浓度的taq聚合酶、mgcl2浓度中的调节、引物浓度中的调节和佐剂（例如dmso、tmso或甘油）的添加任选地可以用于补偿较低的核酸纯度。虽然纯度问题可能更多是第一阶段扩增和单一阶段pcr的关注，但应理解，也可以在第二阶段扩增中提供类似的调节。当将小袋510放置在仪器800内时，将气囊组件810压靠在小袋510的一个面上，使得如果特定的气囊膨胀，则压力将迫使液体从小袋510中的相应泡罩中流出。除对应于小袋510的许多泡罩的气囊之外，气囊组件810可以具有另外的气动致动器，例如气囊或气动驱动的活塞，对应于小袋510的各种通道。图2和3显示了说明性的多个活塞或硬密封件838、843、852、853和865，其对应于小袋510的通道538、543、553和565，以及密封件871、872、873、874，其最小化进入配件590内的回流。当启动时，硬密封件838、843、852、853和865形成夹管阀，以夹断且关闭相应的通道。为了将液体约束在小袋510的特定泡罩内，硬密封件在来回泡罩的通道上被启动，使得致动器充当夹管阀以将通道关闭。说明性地，为了在不同的泡罩中混合两个体积的液体，密封连接通道的夹管阀致动器被启动，并且泡罩上方的气动气囊被交替加压，迫使液体来回通过连接泡罩的通道，以混合在其中的液体。夹管阀致动器可以具有各种形状和尺寸，并且可以配置成一次夹断多于一个通道。虽然本文讨论了气动致动器，但应理解，考虑了向小袋提供压力的其它方式，包括各种机电致动器，例如线性步进电动机，电动机驱动的凸轮，由气动、液压或电磁力驱动的刚性桨叶，辊，摇臂，以及在某些情况下，旋塞弹簧。另外，除施加垂直于通道轴线的压力之外，还存在可逆或不可逆地关闭通道的各种方法。这些包括将袋子扭转跨越通道，热封，轧制致动器以及密封在通道中的各种物理阀，例如蝶形阀和球阀。另外，小型peltier装置或其它温度调节器可以放置在通道附近，并且设定在足以冷冻流体的温度，有效地形成密封。另外，虽然图1的设计适于定位在每个泡罩和通道上的致动器元件特征性的自动化仪器，但也考虑了致动器可以保持静止，并且小袋510可以在一维或二维中过渡，使得少量致动器可以用于几个加工站，包括样品破坏、核酸捕获、第一和第二阶段pcr、以及小袋510的其它应用例如免疫测定和免疫pcr。作用于通道和泡罩的辊可以证明在其中小袋510在工位之间平移的配置中特别有用。因此，尽管在当前公开的实施方案中使用气动致动器，但当术语“气动致动器”在本文中使用时，应理解，可以使用其它致动器和提供压力的其它方式，取决于小袋和仪器的配置。其它现有技术仪器教导了在密封的柔性容器内的pcr。参见例如，美国专利号6,645,758、6,780,617和9,586,208，其引入本文作为参考。然而，包括在密封的pcr容器内的细胞裂解可以改善易用性和安全性，特别是如果待测试的样品可能含有生物危害。在本文所示的实施方案中，来自细胞裂解以及所有其它步骤的废物保留在密封的小袋内。然而，应理解，可以取出小袋内容物用于进一步测试。图2显示了可以与小袋510一起使用的说明性仪器800。仪器800包括支撑构件802，其可以形成壳体的壁或安装在壳体内。仪器800还可以包括第二支撑构件（未示出），其任选地可相对于支撑构件802移动，以允许小袋510的插入和撤回。说明性地，一旦小袋510已插入到仪器800内，盖子可以覆盖小袋510。在另一个实施方案中，两个支撑构件可以是固定的，其中小袋510通过其它机械手段或通过气动压力固定就位。在说明性实施例中，加热器886和888安装在支撑构件802上。然而，应理解，这种布置仅是说明性的，并且其它布置也是可能的。具有气囊822、844、846、848、864、866的气囊板810，硬密封件838、843、852、853，形成气囊组件808的密封件871、872、873、874可以说明性地安装在可移动支撑结构上，所述可移动支撑结构可以朝向小袋510移动，使得气动致动器与小袋510接触放置。当小袋510插入仪器800内并且可移动支撑构件朝向支撑构件802移动时，小袋510的各种泡罩处于与气囊组件810的各个气囊和组件808的各种密封件相邻的位置，使得气动致动器的启动可以迫使来自小袋510的一个或多个泡罩的液体，或者可以形成具有小袋510的一个或多个通道的夹管阀。在图3中更详细地示出了小袋510的泡罩和通道与组件808的气囊和密封件之间的关系。每个气动致动器经由阀899连接到压缩空气源895。虽然图2中仅显示了几个软管878，但应理解，每个气动配件经由软管878连接到压缩气体源895。压缩气体源895可以是压缩机，或者可替代地，压缩气体源895可以是压缩气体气筒，例如二氧化碳筒。如果需要便携性，则压缩气筒是特别有用的。其它压缩气体源也在本发明的范围内。组件808说明性地安装在可移动支撑构件上，尽管应理解其它配置也是可能的。仪器810的几个其它部件也连接到压缩气体源895。安装在支撑构件802的第二侧814上的磁体850说明性地使用经由软管878来自压缩气体源895的气体展开和缩回，尽管移动磁铁850的其它方法是本领域已知的。磁体850位于支撑构件802中的凹部851中。应理解，凹部851可以是穿过支撑构件802的通道，使得磁体850可以接触小袋510的泡罩546。然而，取决于支撑构件802的材料，应理解，凹部851不需要一直延伸穿过支撑构件802，只要当磁体850展开时，磁体850足够接近以在泡罩546处提供足够的磁场，并且当磁体850缩回时，磁体850不显著影响泡罩546中存在的任何磁珠533。虽然提及了缩回磁体850，但应理解，可以使用电磁体，并且可以通过控制通过电磁体的电流来启动和停用电磁体。因此，虽然本说明书讨论了撤回或缩回磁体，但应理解这些术语足够宽泛，以掺入撤回磁场的其它方式。应理解，气动连接可以是气动软管或气动空气歧管，因此减少了所需的软管或阀数目。气动活塞阵列869的各种气动活塞868也经由软管878连接到压缩气体源895。虽然仅显示了将气动活塞868连接到压缩气体源895的两个软管878，但应理解气动活塞868各自连接到压缩气体源895。显示了十二个气动活塞868。一对加热/冷却装置，说明性地珀尔帖加热器，安装在支撑件802的第二侧814上。第一阶段加热器886定位于加热且冷却泡罩564的内容物，用于第一阶段pcr。第二阶段加热器888定位于加热且冷却小袋510的第二阶段泡罩582的内容物，用于第二阶段pcr。然而，应理解，这些加热器也可以用于其它加热目的，并且如对于特定应用适当的，可以使用其它加热器。其它配置也是可能的。当需要荧光检测时，可以提供光学阵列890。如图2中所示，光学阵列890包括光源898，说明性地经过滤的led光源、经过滤的白光或激光照射以及照相机896。照相机896说明性地具有多个光电探测器，其各自对应于小袋510中的第二阶段孔582。可替代地，照相机896可以拍摄含有所有第二阶段孔582的图像，并且图像可以被分成对应于每个第二阶段孔582的分开视野。取决于配置，光学阵列890可以是固定的，或者光学阵列890可以放置在附接到一个或多个电动机的移动器上，并且移动以从每个个别第二阶段孔582获得信号。应理解，其它布置也是可能的。如所示的，计算机894控制压缩空气源895的阀899，并且因此控制仪器800的所有气动装置。计算机894还控制加热器886和888，以及光学阵列890。这些部件中的每一个都是电连接的，说明性地经由电缆891，尽管其它物理或无线连接也在本发明的范围内。应理解，计算机894可以容纳在仪器800内或者可以在仪器800外部。此外，计算机894可以包括控制一些或所有组件的内置电路板，可以计算扩增曲线、解链曲线、cps、cts、标准曲线和其它相关数据，并且还可以包括外部计算机，例如台式或膝上型pc，以接收且展示来自光学阵列的数据。可以提供界面，说明性地键盘界面，包括用于输入信息和变量例如温度、循环时间等的键。说明性地，还提供了显示器892。例如，显示器892可以是led、lcd或其它此类显示器。实施例1–高密度pcr在一个实施例中，已知用于常见呼吸道病毒的标准商业免疫荧光测定可以检测七种病毒：腺病毒、piv1、piv2、piv3、rsv、甲型流感和乙型流感。更完整的实验对象组说明性地包括用于其它病毒的测定，所述其他病毒包括：冠状病毒、人偏肺病毒、鼻病毒和非hrv肠道病毒。对于高度可变的病毒，例如腺病毒或hrv，期望使用多个引物以靶向病毒谱系的所有分支（说明性地分别为4个外部和4个内部引物组）。对于其它病毒如冠状病毒，存在4个不同的谱系（229e、nl63、oc43、hku1），所述谱系从一个季节到另一个季节不改变，但它们已充分分歧，使得需要分开的引物组。filmarray®respiratorypanel（biofirediagnostics，llcofsaltlakecity，ut）包括腺病毒、冠状病毒hku1、冠状病毒nl63、冠状病毒229e、冠状病毒oc43、人偏肺病毒、人鼻病毒/肠病毒、甲型流感、甲型/h1型流感、甲型/h3型流感、甲型/h1-2009型流感、乙型流感、1型副流感病毒、2型副流感病毒、3型副流感病毒、4型副流感病毒和呼吸道合胞病毒。除这些病毒之外，filmarray®respiratorypanel还包括三种细菌：百日咳博德特氏菌（bordetellapertussis）、肺炎衣原体（chlamydophilapneumoniae）和肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae）。高密度阵列581能够将此类实验对象组容纳在单个小袋510中。其它实验对象组可用于filmarray®，各自测定至少20种病原体。说明性第二阶段pcr主混合物含有dsdna结合染料lcgreen®plus，以生成指示扩增的信号。然而，应理解，该染料仅是说明性的，并且可以使用其它信号，包括其它dsdna结合染料，以及荧光、放射性、化学发光、酶促等等标记的探针，如本领域已知的。将说明性filmarray仪器编程，以基于pcr后解链对于每个第二阶段反应进行正或负调用。解链曲线必须在预定温度范围内产生解链峰（一阶导数最大值或负一阶导数最大值），用于调用为正的。应理解，这种调用每个第二阶段反应的方法仅是说明性的，并且可以使用实时扩增数据或通过其它手段进行调用，如本领域已知的。实施例2-设计用于多重pcr的定量标准品在系统例如filmarray中，其中在一个反应室中执行单一多重pcr，使用10倍稀释的单一参考模板生成标准曲线是不方便的，因为不能容易地区别各个水平。例如，如果将单一参考模板以10个拷贝、100个拷贝和1000个拷贝的浓度加入单个第一阶段反应室中，则该室中参考模板的最终浓度将为1110个拷贝，并且缺乏一些其它标签，个别稀释度是无法区别的。此外，在两步多重pcr系统中，仅在嵌套的第二阶段pcr中生成的标准曲线可能具有用于定量的有限价值，因为单重标准模板扩增反应可能无法准确反映样品经历的所有上游操作，或可能不以相似的效率扩增，并且因此，可能不反映整个过程。在该说明性实施例中，不同的核酸模板（说明性地在序列和/或长度上变化），说明性地合成的定量标准品，用于表示不同水平的稀释系列。在一个说明性实施方案中，用于所有合成的定量标准品的测定具有相似的扩增效率，并且在多重设置中的每个给定稀释点产生相同或相似的cp值。说明性地，所有靶测定都针对相同的性能特征（包括效率）进行优化，尽管可以应用校正来调节效率中的测定特异性变化。在一个说明性实施例中，用于定量标准品的外部和内部扩增子大小可以代表用于定量靶测定的扩增子大小。此外，序列或gc含量在引发区域之间可以是相同或相似的。说明性地，序列可以是相同的，除了至少一个内部引发区域之外，其应该足够不同以避免内部测定之间的交叉反应性。如果序列仅通过内部引物结合区而不同，则相同的pcr1引物可以用于扩增所有定量标准品，因此最小化pcr1测定性能中的潜在差异。此外，如果使用标签，则序列可以是相同的，并且如果不使用标签，即使序列中的轻微差异也可以提供用于检测，说明性地在第二阶段单重反应中。然而，应理解，这些参数仅是说明性的，并且用于检测和控制扩增效率的其它手段也是可能的。应理解，多重反应中存在的定量标准品应该设计成匹配反应参数，例如mg2 、引物浓度、tm和循环条件。还应理解，期望最小化多重pcr反应中合成模板的非特异性扩增。图5显示了四种预期内部定量标准品的cp相对于浓度。在该说明性实施方案中，内部定量标准品具有合成序列。在该说明性实施方案中，对于第二阶段内部反应，四种定量标准品均共享一种共同引物，并且各自具有一种独特的特异性引物。它们还被设计为共享两种外部引物用于第一阶段pcr。因此，用于检测定量标准品的每个第二阶段孔将用共同引物和用于该定量标准品的引物点样，使得在每个此类的孔中应该仅扩增一种定量标准品。然而，应理解，这仅是说明性实施例，并且其它配置是可能的。syn2、syn3和syn4各自具有相似的扩增效率，并且选择用于另外的研究。syn1表现不同，并且从进一步的工作中省略。因此，在一个实施方案中，期望具有多种定量标准品，其具有相似的扩增效率。在该说明性实施例中，使用dsdna结合染料lcgreenplus检测扩增。然而，这仅是说明性的，并且其它dsdna结合染料、探针、信号或检测扩增的其它方式在本发明的范围内。应理解，存在设计具有类似扩增效率的定量标准品的各种方法。在一个实施方案中，定量标准品具有在内部引物之间相同的序列，并且仅在内部引物结合序列上不同。在另一个实施方案中，定量标准品全部具有基本上相同的长度和基本上相同的gc含量。在另外一个实施方案中，序列具有不同的长度，但也有不同的gc含量以进行补偿。设计具有相似扩增效率的核酸的其它方法是本领域已知的。在一个实施方案中，说明性地当定量标准品用于两步嵌套多重pcr反应时，定量标准品可以在第一阶段pcr反应中全部使用相同的外部引物，潜在地甚至共享引物周围的相同区域，以避免由于二级结构形成的差异。然后可以通过在各个第二阶段pcr反应中使用不同的内部引物来区别定量标准品，或者每种校准物具有独特的内部引物对，或者如上文，共享一种内部引物并具有一种独特的内部引物。此类实施方案的优点在于定量标准品各自以相同的动力学结合其第一阶段引物，并且可以最小化第一阶段多重pcr反应的复杂性。虽然提及了两步pcr，但相同的原理可以用于单步多重pcr中。在这种情况下，定量标准品可以具有不同的正向或反向引物或者相同的正向和反向引物，并且说明性地各自具有特定的荧光探针或其它可鉴定的标签，本文考虑了例如化学发光、生物发光、辐射发光、电致发光、电化学发光、机械发光、结晶发光、热致发光、声致发光、磷光和其它形式的光致发光、酶促、放射性等等。该应用仅受限于用于区别标签的任何系统或其它方法中可用的检测通道的数目，如本领域中已知的。一些标签可能需要扩增后处理。此外，应理解，标记的定量标准品可以用于两步pcr中，其中可以使用相同或不同的引物序列，并且标签用于在第二阶段pcr中检测。在此类实施方案中，标记的定量标准品任选地可以在第二阶段pcr中多重化并且通过标签区别。虽然在该实施例中使用合成定量标准品，但应理解用于定量标准品的序列可以是天然存在的。例如，如果酵母用作spc，则酵母序列可以用于一种或多种定量标准品序列。对于裂殖酵母栗酒裂殖酵母，tf2型逆转录转座子元件/转座子以13个拷贝存在，而核糖体rna基因重复47次。在另一个实施例中，可以使用以不同拷贝数存在的基因序列。说明性地，真菌病原体具有50至200个拷贝的核糖体rna基因/核基因组。这些病原体还具有5至20个拷贝不等的转座子/基因组。细菌病原体具有1至15个拷贝/基因组，但大多数具有多于5个拷贝。可以使用其它天然存在的或合成的模板，例如用于病毒的细菌噬菌体和能够模拟膜和/或衣壳和/或包膜结构的合成颗粒。此外，尽管在本文的许多实施例中使用了三种定量标准品，但应理解，仅需要两种定量标准品来定义线性标准曲线，并且在其中预期具有广泛范围的靶浓度、或者预期非线性标准曲线的实施方案中可能需要更多的定量标准品。说明性地，可以基于系统的动态范围和测定的要求来选择定量标准品的数目。可替代地，如实施例5中所示，在每次实验运行中还能够仅使用一种定量标准品（参见实施例5中讨论的样品处理对照（spc））并且依赖输入的标准曲线用于定量，标准曲线所述先前用定量标准品范围生成，说明性地用可以包括在用于该分析的软件中的至少3个定量标准品（在实施例5中命名为qs）。实施例3-多重校准图6a类似于图5，但仅显示了来自三种所选校准物序列的数据。图6a证实了关于三种说明性定量标准品的线性和几乎相同的扩增效率。图6b显示了在总共五个稀释度中，由三种定量标准品各自的三个点的组合生成的复合标准曲线。现在已生成了说明性校准曲线，可以生成使用关于每种靶测定的测定特异性参考模板的标准曲线。图7比较了使用鲍氏不动杆菌的良好定量的合成参考模板外部生成的标准曲线与使用定量标准品生成的复合内部标准曲线。此处将三个“syn”模板在加入反应管之前预混合；syn4以103个拷贝添加，syn2以104个拷贝添加，并且syn3以105个拷贝/反应添加。来自这些模板的cp值用于生成关于每个反应的复合内部标准曲线。使用合成参考模板生成外部标准曲线。鲍氏不动杆菌参考模板也在与“syn”模板相同的浓度下测试。复合内部标准曲线和鲍氏不动杆菌标准曲线非常相似。相似的斜率显示效率是相似的。预期使用内部标准曲线可以预测鲍氏不动杆菌样品的未知起始浓度。然而，因为y-截距在两条曲线之间转变，所以当使用该内部标准曲线时，鲍氏不动杆菌的定量可以受益于校正因子。因此，可以使用复合内部标准曲线计算靶生物的浓度。注意，内部标准品各自处于不同的已知浓度，并且在与靶生物相同的过程中被扩增。该方法说明性地采用循环阈值（ct）（或可替代地cp值或其它类似方法），其是对于靶和内部标准品获得高于背景荧光的荧光信号所需的pcr循环数，如实验确定的。也可以使用其它点，例如使用第一、第二或第n阶导数，说明性地如美国专利号6,303,305中教导的，所述专利以引用的方式整体并入本文。如本领域中已知的，也可以使用其它点，并且在本文讨论的任何方法中，任何此类点都可以取代cp或ct。说明性地，在两步多重系统中，在嵌套的第二阶段反应中确定cp值。然而，在其它实施方案中，应理解如对于扩增系统适当的，可以确定cp。例如，可以通过使用寡核苷酸探针在单个多重反应或随后的第二阶段反应中测定cp，所述寡核苷酸探针各自对于定量标准品序列是特异性的并且具有可区别的荧光信号。在其中使用单一内部标准品的说明性实施例中，根据下式，可以使用靶生物的cp（）、内部标准品的浓度和cp（浓度s，）、以及靶生物的效率（效率t）来计算靶生物的浓度。浓度t=浓度s*效率t（cps-cpt）[等式1]，其中下标s和t分别表示内部定量标准品和靶生物，和效率t=1 作为百分比的效率/100[等式2]。例如，关于每个pcr循环具有100%扩增的靶的效率变量将等于2。注意，假定效率跨越动态范围是预定和恒定的。如上文讨论的，内部校准物的效率应该都是相似的，说明性地在彼此1%、2%、5%或10%内。类似地，靶的效率应该各自与校准物的效率相似，说明性地在校准物的2%、5%、10%或12%内。应理解，对于精确定量，期望在较窄范围内，例如在1%、2%或5%内的效率。然而，对于半定量或“建仓”结果（参见下文），可以容忍效率中的更大变化。当使用两种或更多种定量标准品时，可以生成标准定量曲线，说明性地使用对关于部定量标准品的数据的最小二乘回归线拟合（ct，log10（浓度）），如图6a-6b所示。说明性地，回归拟合具有以下形式：log10（浓度）=（cp-b）/a[等式3]，其中b是截距并且表示当log10（浓度）为零时的cp值，并且a是斜率，其表示cp随着模板浓度中的单个单位变化而变化的程度（效率的函数）。给定关于未知靶的计算cp值，该式给出以log10单位的靶浓度。根据需要，可以应用其它算法或等式，以改善定量的精度和准确度。这些可以包括在提取和/或扩增中关于平台特异性、基质特异性或测定特异性偏差所需的调节。这些还可以包括可以解释任何多步扩增过程的分开步骤中的测定效率差异的算法。在一些实施方案中，定量标准品曲线可以是非线性的，或者可以仅在某个动态范围内是线性的。说明性地，如果存在浓度依赖性可变斜率，则可以使用s形剂量-响应曲线。其它非线性曲线也在本发明的范围内。基于对于靶观察到的cp值和对于使用内部定量标准品生成的标准曲线的回归方程，上述方法可以用于具有未知浓度的靶生物。理想地，使用该方法定量的所有靶都应该具有测定，所述测定与内部定量标准品测定具有等价或相似的pcr效率。然而，靶测定标准曲线的斜率或截距中可能存在一些变化。鉴于靶测定可能具有与内部标准品不同的扩增特征，测定特异性校正因子可以用于调节系统测定特异性偏差，以改善未知靶的计算浓度的准确度。说明性地，当使用线性定量曲线时，a可以用指示不同测定特异性效率的校正因子（其改变斜率）进行校正，或者b可以由于缺乏促使靶cp延迟的关于特定靶的最佳pcr条件进行校正。适当时，可以使用这两种校正。在另一个实施例中，说明性地，当使用嵌套pcr时，由于pcr1效率中的变化，pcr2中观察到的b中的差异可能是pcr1测定的总结果的结果。在这种情况下，校正因子可以作为cp值的函数来计算，或者是取决于所需定量准确度的常数。例如，可以用已知的靶生物浓度运行一组对照实验。如果使用以单一浓度的多次重复，则可以将测定特异性校正因子计算为以log10单位表示的已知浓度和计算浓度的平均差异。说明性地，为了获得靶生物的校正对数浓度，可以将测定特异性校正因子添加到靶生物的log浓度（如上文通过内部定量标准品方法计算的）。多重测定中的每种靶序列说明性地将具有其自身的校正（或者如果非常类似于复合标准曲线，则根本不校正）。建立实验以比较通过测定特异性标准曲线计算的靶生物的定量与通过复合内部标准曲线计算的定量。在该实验中，已知量的鲍氏不动杆菌基因组核酸的10倍连续稀释与台式反应中的内部定量标准品多重化。还如上文参考图7所述的建立外部测定特异性标准曲线。图8a显示了使用来自定量标准品的复合标准曲线和对于鲍氏不动杆菌特异性的外部标准曲线的结果。如果复合标准曲线无需校正而使用，则存在靶生物（鲍氏不动杆菌）的明显系统过定量（~0.5log拷贝单位），而当应用0.5log拷贝单位校正时，校正的测定特异性标准曲线给出了样品中的鲍氏不动杆菌滴度的相当准确的估计。图8b显示了如何通过将如上所述生成的平均测定特异性校正因子应用于通过内部标准曲线方法计算的量，来校正该系统的定量偏差。可以对于多重反应中的每个测定进行类似的校正。在许多实施方案中，绝对定量不是必需的，并且半定量结果可以是足够的。结果可以报告为绝对浓度（伴随或不伴随系统误差（说明性地95%预测间隔）），或者可以建仓到多个范围之一内，说明性地报告“高”、“中”或“低”浓度，各自覆盖一个或多个数量级。应理解，仓的数目可以变化，如使用特定测定适当的，并且可以使用任何数目的仓。另外，可以调节关于半定量结果的建仓范围（数量级或其它度量），如对于特定实施例适当的。实施例4–用于对测序数据进行归一化和定量的方法除了或代替实施例1-3中所述的测定方法和系统，下一代测序（ngs）方法。ngs可以例如用于样品中的潜在病原性生物的检测、鉴定和定量。在另一个实施例中，ngs可以用作所谓的‘比较物’，以确认另一种测定例如实施例1-3中所述的测定方法和系统之一的性能。在具体实施例中，ngs包括pcr，随后为下一代测序。现代测序仪器（例如，ngs仪器）可以生成大量的数据，所述数据在计算上可以是分析繁琐的。另外，测序过程（例如，样品类型、样品制备、扩增和测序）和获得的数据可能包括许多混杂因素，所述混杂因素可以使得数据难以分析和/或比较来自实验与实验之间、实验室与实验室之间的数据等。例如，由于人为（即，随机）和系统错误，可能无法一致地制备样品用于测序。在另一种情况下，由于核酸的存在或来自以各种浓度的多重生物的多重长度范围，样品无法一致地进行测序。例如，痰是一种特别丰富的样品类型，其可以具有范围为大约0-1013个生物/ml样品的生物负荷，其中大约103-109个生物/ml是相当典型的。其它临床样品（如粪便或血液培养基）可能具有相似的生物负荷。同样地，临床样品可以包括大量的宿主dna（例如人dna）。另外，可以在测序之前将来自多重样品的测序文库合并在一起，这可以缩短测序所需的时间，因为可以同时分析多重样品，但它可以急剧增加单个测序运行中收集的数据量。另外，由于上述因素，样品库中的各个样品无法一致地制备。来自各个合并样品的数据通常在数据集中分开，用于个别比对和分析。为了解决这些和其它类似问题，发现可以在样品制备之前（例如，在核酸提取和扩增之前）和在测序之前，将已知数量的参考dna序列（在本文中称为定量标准品材料（qsm）或内部定量标准品）加入预期用于测序的样品中；然后，内部定量标准品贯穿所有样品加工和测序步骤。由于内部定量标准品在样品加工开始时添加，因此关于测序标准的测序读取数（即，测序标准的分子数）准确地反映样品可以经历的步骤的所有操作和系统损失，所述步骤例如但不限于样品制备、扩增、核酸回收、纯化和测序。同样地，由于内部定量标准品在提取、文库制备和合并之前分开地加入每个样品中，因此加入每个样品中的标准可以准确地反映每个样品经受的所有加工步骤。在一个实施方案中，分开地加入样品库中的每个样品中的内部定量标准品是相同的。在一个实施方案中，库中的每个扩增序列具有其自身的样品特异性鉴定序列（例如dna条形码），其允许来自每个样品的核酸被样品追踪、分开和归一化。内部定量标准品（即，参考dna序列）可以是基本上任何天然或合成的核酸序列，条件是它可与可以进行测序的样品中的其它核酸区别开。例如，内部定量标准品可以是天然存在或改造的质粒、天然存在或合成的线性dna片段等等。由于样品制备、dna扩增、纯化和测序的效率都受dna大小的影响，因此内部定量标准品应该在与样品中的未知序列接近的大小范围内。例如，如果待测序的dna片段具有在200-500个碱基对的范围内的大小，则内部定量标准品也应该具有在200-500个碱基对的范围内的大小。另外，内部定量标准品的组成（例如，相对g-c含量）也应该与待测序的dna的组成相对相似。在一个实施方案中，可以将已知数量的内部定量标准品加入待测序的样品中。如果待对多重样品进行测序，则可以将内部定量标准品分开地加入每个样品中。在一个实施方案中，基于测定来确定内部定量标准品的已知数量。例如，对于测定足够的内部定量标准品的数量可以取决于因素，例如但不限于所需的测定分辨率、核酸提取效率、待测序核酸的浓度范围、待检测的遗传突变的流行率或所需的测序读取深度。在一个实施方案中，已知数量的内部定量标准品可以以在测定的线性范围内的量添加，所述量例如高于检测下限（lod）且低于对于测定预计的最大浓度。例如，在本文讨论的具体实施例中，可以在测序测定中测序且区别的dna拷贝/ml的线性范围为约102至约107-108个拷贝/ml，并且在这种情况下，内部定量标准品可以以约104-106个拷贝/ml的量添加。如下文更详细地说明的，内部定量标准品的添加量和测序读取深度与测定的lod相关。为了对样品中的核酸进行测序，从样品组织/细胞中提取rna或dna并进行片段化。rna通过逆转录转换为cdna。制备用于测序的包含内部定量标准品的样品包括生成dna片段，所述dna片段通过对测序衔接子退火或连接而转换成‘文库’，所述测序衔接子包括设计为与测序平台相互作用的特异性序列和样品特异性鉴定序列（例如，dna‘条形码’），其可以用于鉴定源于特异性样品的测序数据。如果两个或多个样品待合并且平行测序，则每个样品具有其自身的样品特异性鉴定序列或‘条形码’，其可以用于分开源于每个样品的数据。这个程序主要与illumina测序技术兼容。然而，应该注意的是，本文讨论的几乎所有原理都可以伴随最低限度的修改而应用于由lifetechnologies、roche、pacificbiosciences及其它开发的ngs平台。下一步涉及对dna进行测序。精确的测序方法取决于测序平台，但所有现代大规模平行测序技术都是略微相似的，并且生成相似的数据。在测序之后，然后在每个样品中计数源于内部定量标准品的读数，并且可以对每个样品的ngs数据集进行归一化。作为初步检查，加入样品中的内部定量标准品的数量与对于内部定量标准品观察到的测序读取数之间应该存在线性关系。另外，应该记录内部定量标准品测序读数的最小数目（‘f’）。归一化（1）基于关于样品的内部定量标准品的测序读数的最小数目的存在，将数据接受/拒绝标准应用于测序数据集，并且（2）确保将基本上相同的检测限（lod）应用于测序测定中的所有未知核酸。如果将样品合并，则归一化确保所有样品读取至足够的深度，所有样品都保留相同数目的qsm读数对，并且确保将基本上相同的检测限（lod）应用于测序测定中的所有样品中的所有未知核酸。假定存在线性关系并且记录了‘f’内部定量标准品/qsm读数，则可以根据等式4加工测序数据，以保留归一化的测序读取数：norm=测序读取数*（f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数）[等式4]‘f’是固定的、用户设定的内部定量标准品测序读数的最小预计数目，其对于测定是特异性的。例如，‘f’是设定为确保足够的测序读取深度的测序读取数值，以便检测处于或接近测序测定的检测限（lod）的核酸。norm可能代表测序数据的子集，并且是保存用于进一步分析和定量的测序读取数。如从等式4可以看出的，如果‘f’和观察到的源于内部定量标准品的测序读取数相同，则括号中的数量减少为‘1’，并且norm然后等于记录的测序读取数。另一方面，如果数据集中的内部定量标准品测序读取数大于‘f’，则括号中的数量<1，并且norm等式缩减数据规模以解决过度读取的问题，并且确保跨越所有样品应用相同的lod。如果数据集中的内部定量标准品测序读取数小于‘f’，则来自该样品的数据可能被拒绝，并且样品可以提交用于进一步测序，直到记录到‘f’内部定量标准品读数。保留的qsm读取数‘f’是在测定开发过程中选择的参数，并且与读取深度和测定的检测限（lod）相关。下表1中示出了这种效应。例如，如果内部定量标准品以5x105个拷贝/ml的浓度加入样品中，则需要记录不同的qsm读取数，以便确保处于或高于lod的所有未知核酸都进行充分测序和检测。这被称为测序读取深度。例如，如果内部定量标准品/qsm以5x105个拷贝/ml加入样品中，并且‘f’为500，则用于检测未知核酸的测定的lod不小于103个拷贝/ml（通常在103-104个拷贝/ml的范围内）；如果‘f为5000，则测定的lod不小于102个拷贝/ml（通常在102-103个拷贝/ml的范围内）；或者如果‘f为50,000，则测定的lod不小于10个拷贝/ml（通常在10-102个拷贝/ml的范围内）。因此可以看出，可以通过增加检测的读取深度（即，增加‘f’）来降低测定的lod。然而，将‘f’设定为任意高没有意义，因为测序负担也增加。例如，如果测定的lod不小于10个拷贝/ml（（‘f’=50,000），并且最普遍的物种以109个拷贝/ml存在（这并不罕见），则以109个拷贝/ml进入的最普遍的靶被测序1亿次，以便实现以101至102拷贝/ml的范围存在的靶的仅1-10个（例如4个）读数。这可能是不切实际的。在本文所述的实施例中，‘f’通常设为5000个qsm读数，因为这足以可再现地确保以103-107个拷贝/ml或更大范围存在的核酸的检测。对于更严格或更不严格的检测，‘f’可以不同地设定。因此，在一个实施方案中，测序读取深度（即‘f’）可以低至100-1000个qsm读数，或在约1000个内部定量标准品测序读数至约100,000个内部定量标准品测序读数，优选约2000个内部定量标准品测序读数至约75,000个内部定量标准品测序读数，更优选约5000个内部定量标准品测序读数至约50,000个内部定量标准品测序读数的范围内，或者最优选至少5000个内部定量标准品测序读数。参考图9进一步示出了内部标准品的效力和‘f’的值。图9示出了关于三个样品a、b和c的测序数据集的假设情况。每个样品掺入10个qsm拷贝，并且每个样品含有未知量的核酸x和y。在每个样品中，收集了20,000个测序读数。在样品a中，样品显然不含x或y，并且所有20,000个读数都归于qsm。在样品b的20,000个读数中，18182个归于qsm，并且1818个归于x，而没有读数归于y。样品c示出了不同情况。在样品c的20,000个读数中，20个归于qsm，2个归于x，而19978个归于y。根据最初的读数归因，可以看出，样品c具有极高浓度的y和相对很少的x。尽管如此，样品c具有少于5000个qsm读数，因此必须提交样品用于另外的测序，直到记录到至少5000个qsm读数。然而，在样品c的情况下，这确实意味着y将被测序几乎500万次，以便实现最低限度的qsm覆盖。与行业标准相比，这可能看起来很麻烦，所述行业标准可能对于每个样品设定最低限度的总读数值（例如20,000个读数或200,000个读数或200万个读数），然后假定如果达到这个总数，则所有可检测的核酸都进行测序，但本文所述的方法确保跨越所有三个样品a、b和c达到相同的读取深度，并且确保测序具有检测到每个样品中的稀有核酸的平等机会。在样品c的情况下，即使记录到200万个总读数，样品仍处于‘读取不足’，这看起来应该是足够的数目，但在这种情况下，200万个读数仍产生不足的qsm读取数，并且样品对于测定的lod仍处于读取不足。然而，当对具有未知量的核酸的实际临床样本进行测序时，如果没有内部定量标准品，则可能无法知道在哪个点时达到足够的读取深度。即，直到qsm读数足够之前，样品中的未知核酸（例如，样品c中的x和y）并未给予在lod处检测到的平等机会。另外，具有200万甚至200,000个读数，应该能够检测x和y，但如果没有qsm，则可能无法定量x和y，并且也可能无法确定何时达到检测到样品中的所有稀有核酸的足够的读取深度。在样品a和b中，多于5000个读数归于qsm，因此满足‘f’要求，并且样品a和b通过。因此，根据前述假设情况可以看出，本文讨论的内部定量标准品是有力的工具。进一步返回图9，‘f’是固定的、测定设定的内部定量标准品测序读数的最小预计数目，而norm[等式4]可以产生保存用于进一步分析和定量的测序读数子集。如果‘f’和观察到的源于内部定量标准品的测序读取数相同，则norm等于记录的测序读取数。相比之下，如果样品是‘过度读取’（如图9中的样品a和b），则norm缩减数据规模以解决过度读取的问题，并且确保跨越所有样品应用相同的lod。例如，在样品a中，有20,000个读数归于qsm；该样品对于qsm为‘过度读取’，并且norm=20,000*（5000/20,000）=5000。即，样品a中只有四分之一的数据被保存用于进一步分析。类似地，在样品b中，norm=20,000*（5000/18182）=5500。样品c对于qsm为‘读取不足’，因此它未进行归一化或进一步分析，而是提交用于另外的测序。现在参考图10和11，示出了关于一组临床样品的原始读取数和qsm读数。图10和图11中示出的样品是在用qsm掺入后合并用于测序的样品；然后用测序文库制备和测序数据收集进行分析。图10和11示出了合并用于测序的32个样品。每个样品掺入其自身的qsm，并且每个样品具有其自身独特的跟踪序列（例如dna条形码），其在样品制备过程中对样品中的所有未知核酸以及每个样品的qsm退火、连接或以其它方式结合。这些独特的跟踪序列与每个不同样品中的所有核酸结合，并且贯穿样品制备和测序的所有步骤，并且独特的跟踪序列允许将源于每个样品中的核酸的数据与用于数据分析的合并的测序数据集分开。虽然在图10和11中所示的实施例中，将32个样品合并且一起测序，但实际上可以合并更多或更少的样品。例如，假定存在条形码的足够区别能力和对于所有样品足够的读取深度，则可以合并1000个或更多个样品用于一次测序。在一个实施方案中，可以在制备样品之后和在测序之前合并2-1000个样品，优选地可以在制备样品之后和在测序之前合并2-500个样品，更优选地可以在制备样品之后和在测序之前合并2-100个样品，更优选地可以在制备样品之后和在测序之前合并2-50个样品，或者最优选地可以在制备样品之后和在测序之前合并2-32个样品。在图10和11中，将32个样品合并且同时测序。加入每个样品中的qsm以及与每个样品相关的独特跟踪序列允许源于每个个别样品的序列隔离且分开地分析。在图10中，有趣的是注意到与每个样品相关的广泛范围的测序读数。例如，样品15占数据集中的所有测序读数的1/3以上，而一些样品（例如样品13）具有样品15的读数的小于十分之一。图11显示了qsm读数。三个样品12、27和29具有少于5000个qsm读数，并且未通过初始qsm检查。样品23几乎没有足够的qsm读数来通过，而样品如6、9、10和14对于qsm基本上过度读取。有趣的是，即使样品15具有显著的原始读取数，其qsm读数水平也不是异常高。然而，由于本文所述的归一化，所有通过的样品都给予相等的权重。即，具有仅~5000个qsm读数的样品如23在归一化过程中不进行显著修整，但来自样品如6、9、10和14的数据可能进行修整，因为这些样品中的大量qsm读数指示来自这些样品的数据在数据集中显著过度呈现。因此，可以看出，此处描述的归一化过程确保所有样品都给予相等的权重，并且将相同的lod应用于所有样品。在一个实施方案中，未知核酸读数和内部定量标准品读数可以各自根据等式5通过相同比率alpha分开地进行归一化：alpha=f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数[等式5]这在图12中以图形方式示出。关于样品的数据包括qsm读数和非qsm读数。当这些一起进行归一化（并且一起向下读取）时，归一化的数据集中的qsm读数的最终数目可能并不确切地是‘f’（例如5000）–相反，例如，在建仓的数据集中可能有~4970-5030个qsm读数。这是因为用于制备norm数据集的采样过程是随机化的，并且关于随机采样事件的潜在概率模型预测，当制备norm数据集时，随机种子可能并非确切地从整个数据集中提取出‘f’个qsm读数。可替代地，也可以将qsm和非qsm数据分开且建仓，并且用alpha进行归一化，其在qsm仓中确切地产生‘f’个qsm读数（例如5000），并且在非qsm仓中产生适当数目的读数。具体地，伪随机分层二次采样可以用于在每个样品的数据集中保留源于qsm的适当数目的读数。这种归一化确保了测序深度和lod跨越样品是一致的，并且减少了后续分析步骤的计算负担。为了执行qsm比对和归一化，根据本领域已知的充分建立的程序，通过比对将qsm读数与非qsm读数分开。这将读数对分开成源于qsm的集合和并非源于qsm的集合。qsm读数对的计数用于计算关于每个样品的二次采样分数，其二次采样分数由等式5给出。二次采样分数和非qsm读数对的计数用于计算非qsm读数对的数目，以用于每个样品的二次采样。伪随机读取二次采样根据种子随机选择指定数目的非qsm读数对。种子确保虽然二次采样是随机的，但它也是可再现的。在一个实施方案中，加入样品中的已知数量的内部定量标准品可以用于计算在通过等式6归一化之后，样品中的未知核酸的输入数量（iqt）。iqt=归于未知核酸的归一化的未知核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）[等式6]例如，返回参考图9的样品b，等式6可以用于如下计算未知核酸x的iqt：在归一化之后有500个读数归于x，且‘f’设为5000，因此iqt=500*（10/5000）=1。许多样品具有多于一种未知核酸。因此，样品中的多个未知核酸的输入数量（iqti，iqtj，iqtk…iqtn）可以在通过等式7归一化之后进行计算。iqtn=归于“第n”未知核酸的归一化的未知“n”个核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）[等式7]在计数归于不同未知核酸各自的归一化的读取数（例如，通过比对、伪比对或组装方法）之后，这些归一化的读取数可以用于确定未知核酸各自的输入浓度。相同的原理也应用于合并的样品。每个合并的样品具有其自身的qsm及其自身的一组独特的样品特异性鉴定序列，使得可以区别且分开来自该库中的每个样品的测序数据。因此，可以将归一化分开地应用于源于该库中的每个样品的测序数据。因此，样品库中的每个样品具有其自身的（1）数据接受/拒绝标准，并且（2）将基本上相同的检测限（lod）应用于每个样品中的所有未知核酸。这是重要的，因为如图10和11中所示，一些样品可能是很高浓度的，并且一些可能仅具有处于或接近lod的核酸，并且一些样品可能对于qsm是过度读取或读取不足的，而一些样品可能对于qsm处于或接近接受标准进行读取。例如，如关于样品6、9、10和14所示的，一些样品的qsm可能在合并的数据集中过度呈现，而其它样品如15、17、26和32具有处于或接近接受标准的qsm值。分开地评价qsm并将归一化应用于每个样品是有力的，因为（1）它确保每个样品具有足够的读取深度（可以拒绝一些个别样品，而不必拒绝整个数据集），（2）它确保很高浓度的样品并不淹没低浓度样品，（3）它确保将相同的lod应用于所有样品，并且（4）它确保从每个样品中客观地评价相当量的数据，用于归一化和定量。因此，等式7可以用于计算库中的多重样品中的多重核酸的输入数量。在一些实施方案中，制备用于测序的样品可以包括特异性程序。在一个实施方案中，制备用于测序的样品可以包括样品裂解，从裂解产物中回收核酸，并且任选地纯化回收的核酸，并且将测序衔接子位点和样品特异性鉴定序列引入待测序的核酸区域内。在一个实施方案中，测序衔接子位点可以包含这样的区域，其用于将核酸附接至用于测序的平台（例如，流动池），并且对引物结合位点进行测序。在图13中示出了样品制备工作流的实施例。在一些实施方案中，内部定量标准品/qsm可以在裂解之前或之后添加，例如，取决于裂解可能被裂解方案损坏或片段化的可能性。例如，如果样品裂解涉及珠击打或超声处理，则可以在裂解之后但在核酸的回收和纯化之前添加qsm。如果采用化学裂解或温和的机械裂解，则可以在裂解之前添加qsm。在一个说明性实施例中，认为内部定量标准品可以通过考虑在样品制备和测序期间的损失，用于估计原始样品中的未知核酸的真实输入浓度。即，内部定量标准品贯穿分析的所有步骤。因此，任何损失都是系统性的，并且通过在过程自始至终对于每个样品制备相同的由于样品提取、测序等的损失，可以将测序浓度用于反算真实输入浓度。在一个实施方案中，引入测序衔接子位点和样品特异性鉴定序列可以包括以下之一：（1）使用包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列的靶特异性引物，在扩增反应中扩增待测序的核酸，或（2）使待测序的核酸片段化，并且连接至片段化的核酸测序特异性衔接子，所述衔接子包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列。在一个实施方案中，扩增待测序的核酸可以包括：使用具有定制突出端的靶特异性引物执行第一多重pcr反应，执行第一次核酸纯化，使用测序衔接子引物执行第二pcr反应，所述引物对第一pcr中引入的定制突出端退火或连接，并且执行第二次核酸纯化。在一个实施方案中，测序衔接子引物是靶不依赖性的，并且包含测序引物衔接子位点和样品特异性鉴定序列。如图14中所示，典型样品中的总生物负荷可以广泛地变化–在约0至1013个生物/ml之间（通常为约102-107）。这可以导致在测序反应内非常宽泛范围的核酸拷贝/ml输入。在一个实施方案中，扩增反应可以用于压制反应的上限，使得提交用于测序的样品有效地具有在更窄的相对动态范围内的核酸数，例如约102–107。在一个实施方案中，本文所述的方法可以包括将第一多重pcr反应中的靶特异性引物浓度或循环数中的一个或多个限制于以大于约107个拷贝/ml的浓度存在的核酸的平台扩增，并且保存在指数扩增期小于约107个拷贝/ml的核酸。这在图15中示出。例如，测序测定的上lod在每种核酸约102–107个拷贝的范围内可能是线性的。高于约107个核酸拷贝/ml，期望避免不必对超出测定的线性范围的此类浓度的核酸过度测序，并且此类核酸可以被报告为具有报告为>107个核酸拷贝/ml的输入浓度，而约102–107的所有核酸都保存在测定的线性范围内，并且通过相应的归一化测序读取数以其真实输入数量报告。在一些实施方案中，可能期望通过限制扩增循环数来压制动态浓度范围的下端。在一个实施方案中，测定的lod可以指示较低的报告范围，并且低于lod的核酸可以被报告为‘未检测到’。在一个实施方案中，样品中的核酸的输入数量可以相反地半定量地或以‘建仓’范围报告。在许多实施方案中，绝对定量不是必需的，并且半定量结果可能是足够的。此外，报告建仓范围可能更简单，并且可以允许报告考虑数据中的靶特异性错误。结果可以报告为绝对浓度（连同或不连同系统错误（说明性地，95%的预测间隔）），或可以建仓成多个范围之一，说明性地，报告各自覆盖一个或多个数量级的“高”、“中”或“低”浓度。同样地，样品中的核酸的输入数量可以以数字仓报告。下表2中显示了实施例。仓半定量报告水平10^3<10^3.510^410^3.5-≤10^4.510^510^4.5-≤10^5.510^610^5.5-≤10^6.5>10^7≥10^6.5表2。每个仓涵盖跨越一个log的值；仓定义为在仓标签的任一侧上具有0.5log的范围（即10^5仓含有10^4.5至10^5.5等的数量）。在仓范围的任一侧上的额外0.5log是考虑到仓边界附近可见的测量变化性。表2中所示的例外情况是最低的仓，其中低于10^3.5的任何值可以报告为“未检测到”，以及最高的仓，其中等于或大于10^6.5的任何值可以报告为>10^7。然而，应理解，这些下报告值和上报告值仅是说明性的，并且根据因素例如但不限于给定测定的lod和动态范围，可以使用不同的下报告值和上报告值范围。距离仓边界的两个标准差或0.5log是捕获不集中于仓边界的95%数据点的理论范围。应理解，仓的数目可以变化，如对于特异性测定适当的，并且可以使用任何数目的仓。另外，可以调整关于半定量结果的建仓范围（数量级或其它测量），如对于具体实施例适当的。实施例5：用于执行比较物研究的方法当诊断测试提供者（例如，biofirediagnostics）开发了新的商业诊断测试时，测试提供者经常被fda要求执行比较物研究，以提供新商业测试递交了供应者声称它做到的结果的确认。通常，比较物测定使用独立且公认的金标准技术（例如护理标准（soc）培养方法），以检查新测定的结果。然而，当前的soc培养方法可能无法提供临床样品中的细菌靶的高度准确或一致的检测和定量。这是由于许多因素，包括分子测定对培养物经常提高的灵敏度，培养物只能检测活生物的事实，以及从复杂的、富含生物的样本类型建立独特的菌落形态的挑战。对于分子测定如本文所述的filmarray系统，其使用pcr和荧光检测来检测样品中生物的存在，桑格测序是公认的soc培养方法的替代比较物。然而，随着分子测定变得更加复杂，关于传统桑格测序的测序负担变得更大。同样地，在由商业测试要求定量的情况下，比较物测序测定也可能需要提供定量或半定量结果。本文描述的是先前已在本领域中使用的常规pcr和双向测序比较物方法的高流通量替代方案。优选地，在比较物研究中采用的测序方法是下一代测序（ngs）或类似的大规模平行测序技术。对于需要半定量生物负荷报告的诊断实验对象组上的靶（例如细菌、病毒、真菌等）、或与一些细菌相关的抗生素抗性标记物，作为优选的实施方案开发了在临床试验期间用作比较物的定量或半定量分子参考方法。本文所述的新型分子参考方法利用了ngs固有的数字和大规模平行特性。尽管illuminangs用于本文讨论的具体实施方案中，但本文描述的原理可以伴随最低限度的修改而适用于其它测序平台。在一个实施方案中，描述了用于执行比较物研究的方法。用于执行比较物研究的方法可以包括：提供包含一种或多种靶核酸的多重扩增和检测的第一测定，该第一测定具有检测限（lod），并且提供不同于第一测定的第二测定，用于确认检测和第一测定的lod。第二测定可以包括：制备用于测序的包含至少一种内部定量标准品的样品，测序以生成样品的测序数据集，其中所述测序数据集包括从靶核酸和内部定量标准品观察到的测序读数，计数测序数据集中源于靶核酸和内部定量标准品的测序读取数，并且对测序数据集进行归一化，其中所述归一化（1）基于关于样品的内部定量标准品的测序读数的最小数目的存在，将数据接受/拒绝标准应用于测序数据集，并且（2）确保将基本上相同的检测限（lod）应用于测序测定中的所有未知核酸。第二测定的lod优选与第一测定的lod基本上相同。可以将第二测定的结果与第一测定的结果进行比较。优选地，在第一测定中检测到的生物和生物数量应该与通过第二测定报告的检测和数量一致。在一个实施方案中，第一测定可以包括向样品中添加一种或多种内部定量标准品，并且对样品执行定量两步扩增。在一个实施方案中，在第一测定中的定量两步扩增包括：在第一阶段多重扩增混合物中扩增样品，该扩增混合物包含多个靶引物，每个靶引物配置为扩增可能存在于样品中的不同靶，以及至少一个定量标准品引物，该定量标准品引物配置为扩增内部定量标准品核酸，将第一阶段扩增混合物分成多个第二阶段个别反应，各自包含至少一个引物的第一组多个第二阶段个别反应，所述引物配置为进一步扩增可能存在于样品中的不同靶之一，以及各自包含至少一个引物的第二组多个第二阶段个别反应，所述引物配置为进一步扩增内部定量标准品核酸之一，并且使多个第二阶段个别反应经受扩增条件，以生成一个或多个靶扩增子和多个定量标准品扩增子，每个定量标准品扩增子具有相关的定量标准品cp。每种靶核酸具有交叉点（cp），并且每个内部标准品在第一测定中具有已知浓度和已知定量标准品cp。在一个实施方案中，可能能够通过与已知输入浓度的定量标准品的比较，来确定第一测定中的未知核酸的输入浓度。在一个实施方案中，该方法可以进一步包括由定量标准品cp生成标准曲线，并且使用该标准曲线来定量一种或多种靶核酸中的每种。在一个实施方案中，使用标准曲线来定量每种靶核酸，所述标准曲线使用与等式3的最小二乘回归线拟合生成。log10（浓度）=（cp-b）/a[等式3]在等式3中，cp是对于每个靶测量的交叉点，b，截距，代表当靶的log10（浓度）为零时的cp值，并且a是代表cp随着浓度中的单个单位改变而改变的程度的斜率。再次参考第二测定，可以如上文实施例4中所述，对来自第二测定的数据进行归一化，并且可以确定未知核酸的输入数量。重要的是，基于预定的qsm读数的预计数目的读取深度阈值检查点在靶特异性分析之前。标记具有不足读取深度的样品用于另外的测序，同时对具有足够读取深度的样品进行归一化。这确保读数的定量值跨越每一个样品是相同的，并且靶检测不依赖于总靶负荷。对于不同的检测限可以选择预定的qsm读数的预计数目，即‘f’，以匹配第一测定。例如，如果qsm以5x105个拷贝/ml掺入到样品内，并且‘f’为5x103，则第二测定中用于检测靶核酸的lod在约102–103个拷贝/ml的范围内。类似地，如果‘f’为5x104，则第二测定中用于检测靶核酸的lod在约101–102个拷贝/ml的范围内。一般而言，‘f’的量级越大，测序测定的lod越低。这是因为，如实施例4中详细说明的，‘f’的量级越大，测定的测序深度越大。在表3中示出了qsm掺入水平（例如5x105个拷贝/ml）、‘f’（例如‘f’=5000），读取计数、与在每个报告水平下关于代表性归一化后读取计数的半定量建仓靶报告之间的关系。半定量报告水平读取计数<10^3.5<3210^3.5-10^4.532-≤42010^4.5-10^5.5420-≤520010^5.5-10^6.55200-≤62,000>10^6.5≥62,000表3。同样地，如上文所述，可以合并多重样品用于测序测定。合并虽然不是必需的，却是大规模平行dna测序显示其真正力量之处。例如，合并和平行测序的能力显著减少了执行比较物研究所需的时间和人员。如上文实施例4中所述，可以将样品合并、归一化和定量。实施例6：测定特异性校正因子理想地，下一代测序（ngs）应该报告与任何其它定量分子方法（例如数字pcr）确切地相同的靶定量。然而，现实是各个参考方法中仍可能存在采样和测量中的变化性，并且此类随机性经常妨碍这种理想的一致情形的实现。一种可能的解决方案是报告具有适当错误范围的数据，或将数据建仓。然而，如果误差是测定特异性的，并且跨越所有样品类型并非一致/系统性的，则误差范围或建仓可能无法解释数据中的所有误差。另一方面，能够使用测定特异性校正因子来进一步解释可重复和系统的因素，如核酸扩增效率中的差异、核酸纯化效率中的差异、测序文库制备中的差异、以及测序效率中的差异。由于此类差异对于给定的样品、分析物和/或测定是可重复的和系统的，因此可以测量该差异，并且将其用于生成测定特异性校正因子，以校正靶定量。本文所述的ngs方法可以使用测定特异性校正因子，以去除跨越许多（例如超过50个）实验测量观察到的关于许多靶的靶定量性能中的系统差异。通过分析超过五十个分批的阳性对照中的测定特异性阳性对照（pc）序列，得出本实施例中描述的测定特异性校正因子。pc序列可以加入测试样品中，或者它们可以作为分开的样品包括在每次运行中。在扩增之前，分批阳性对照可以掺入以已知浓度（例如50个拷贝的每种pcgblock/反应）的pc序列（例如，改造的gblock）、以及定量标准品材料（例如500个拷贝的qsm/反应）的混合物。如果pcr扩增的效率不够理想，或者如果靶和内部标准品的效率不同，则校正因子可以取决于反应内输入的阳性对照的数量。因此，在一个实施方案中，阳性对照的数量应该在相应靶的靶动态范围的中间。在一个实施方案中，可以将pc序列设计为用测试测定中使用的具有突出端的相同靶特异性引物进行扩增，使得样品特异性测序衔接子引物可以以与测试测定相同的方式对扩增的pc序列退火。天然地，将阳性对照设计为在保守的引物结合位点区域之间具有其自身独特的鉴定序列区域。以这种方式，可以鉴定并且分开地分析衍生自阳性对照的测序数据。pc序列可以含有测定特异性靶，并且当每种测定具有相同的性能（例如104.7个拷贝/ml）时，预计以等价水平进行定量。然而，图16显示了观察到两个测定群体。为了本实施例的目的，这两个测定群体被称为良好表现者和不良表现者。在图表的左侧可见被称为良好表现者的测定（a-m），而在图表的右侧可见被称为不良表现者的测定（o-x）。样品n是中间表现者。良好表现者的平均log10定量始终接近预计定量，而不良表现者的平均log10定量则并非如此。即，可以假定‘良好表现者’在测试测定中始终接近于其预计性能定量，而可以假定‘不良表现者’在测试测定中始终以明显低于其预计性能的值定量。更具体而言，将良好表现者定义为平均log10定量在预计定量的0.5log10内的测定，而将不良表现者定义为平均log10定量比预计定量低≥0.5log10的测定。良好表现者的平均log10定量比预计定量低0.23log10，而不良表现者的平均log10定量比预计定量低1.0log10。观察到具有中等性能的一种测定（显示为n）。本实施例中描述的测定特异性校正因子定义为每个测定的平均log10定量与良好表现者的平均log10定量（104.47拷贝/ml）之间的差异，允许高达1.0log10校正因子。在本实施例中，对于特异性的一组测定得出了测定特异性校正因子。然而，普通技术人员应了解，本实施例中描述的原理可以适用于并应用于具有仅最小限度的测定特异性修饰的其它测定。实施例7：用于对下一代测序（ngs）测定中的未知核酸进行归一化和定量的试剂盒在一个实施方案中，公开了用于对下一代测序（ngs）测定中的未知核酸进行归一化和定量的试剂盒。试剂盒可以包括内部定量标准品，其中所述内部定量标准品是配置为待以已知量加入样品中的核酸，所述样品包括待测序的未知核酸，以及关于使用内部定量标准品用于对测序数据集进行归一化和定量、以及用于计算未知核酸的输入数量的说明书。在一个实施方案中，试剂盒可以包括待以不同的已知浓度添加的一组内部定量标准品，用于生成用于定量未知核酸的标准曲线。在一个实施方案中，内部定量标准品可以被配置为待以约104-106个拷贝/ml的范围加入样品中。在一个实施方案中，使用内部定量标准品，可以通过等式5对测序数据进行归一化norm=测序读取数*（f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数）[等式5]其中‘f’是固定的内部定量标准品测序读数的最小预计数目。在一个实施方案中，使用内部定量标准品，可以通过等式6来计算未知核酸的输入数量（iqt）：iqt=归于未知核酸的归一化的未知核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）[等式6]在一个实施方案中，试剂盒可以进一步包括用于至少内部定量标准品的测序特异性衔接子，其包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列。在一个实施方案中，试剂盒可以进一步包括具有定制突出端的靶特异性引物，其配置用于扩增内部定量标准品，并且用于对测序特异性衔接子退火或连接。本发明可以以其它特定形式实施，而不脱离其精神或基本特征。所述实施方案在所有方面都视为仅是说明性的而非限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是前文说明书指示。虽然某些实施方案和细节已在本文和所附发明公开内容中包括用于说明本发明的目的，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本文公开的方法和仪器进行各种改变，而不脱离在所附权利要求中限定的本发明的范围。在权利要求的含义和等价范围内的所有变化都包含在其范围内。当前第1页1 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技术特征：1.一种用于测序测定的读数值归一化的方法，其包括：
提供包含待测序的一种或多种未知核酸的样品；
向样品中添加已知数量的内部定量标准品；
制备用于测序的包含内部定量标准品的样品，其中所述制备包括将测序特异性衔接子位点和样品特异性鉴定序列引入样品中的未知核酸和内部定量标准品内；
测序以生成样品的测序数据集，其中所述测序数据集包括从未知核酸和内部定量标准品观察到的测序读数；
计数测序数据集中源于未知核酸和内部定量标准品的测序读取数；和
对测序数据集进行归一化，其中所述归一化（1）基于关于样品的内部定量标准品的测序读数的最小数目的存在，将数据接受/拒绝标准应用于测序数据集，并且（2）确保将基本上相同的检测限（lod）应用于测序测定中的所有未知核酸。
2.权利要求1的方法，其中所述样品中的每种未知核酸具有约102-107个拷贝/ml的浓度。
3.权利要求1的方法，其中加入所述样品中的内部定量标准品的已知数量在约104-106个拷贝/ml的范围内。
4.权利要求1的方法，其中对所述测序数据集进行归一化保留norm测序读数，其中norm=测序读取数*（f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数），并且其中‘f’是固定的内部定量标准品测序读数的最小预计数目。
5.权利要求4的方法，其中未知核酸读数和内部定量标准品读数各自通过相同比率alpha分别进行归一化，其中alpha=f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数。
6.权利要求1的方法，其进一步包括在归一化之后，计算样品中的未知核酸的输入数量（iqt），其中由于内部定量标准品的输入数量是已知的，因此可以通过iqt=归于未知核酸的归一化的未知核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f），来计算未知核酸的输入数量（iqt）。
7.权利要求1的方法，其中制备样品包括样品裂解，从裂解产物中回收核酸，并且任选地纯化回收的核酸，并且将引物结合位点和样品特异性鉴定序列引入待测序核酸的区域内。
8.权利要求7的方法，其中所述附接包括以下之一：
使用具有双重索引测序突出端的靶特异性引物，在扩增反应中扩增待测序的核酸，所述靶特异性引物包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列，或
使待测序的核酸片段化，并且连接至片段化的核酸测序特异性衔接子，所述衔接子包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列。
9.权利要求8的方法，其中扩增待测序的核酸包括：
使用具有定制突出端的靶特异性引物执行第一多重pcr反应，
执行第一次核酸纯化，
使用双重索引测序衔接子引物执行第二pcr反应，所述引物对第一pcr中引入的突出端退火或连接，其中所述双重索引测序衔接子引物是靶不依赖性的，并且包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列，
执行第二次核酸纯化。
10.权利要求1的方法，其进一步包括合并两个或更多个样品，并且使其同时经受测序，其中所述两个或更多个样品在制备之后和在测序之前进行合并。
11.权利要求1的方法，其中所述测序测定是下一代测序测定。
12.权利要求1的方法，其中所述测序测定并不包括执行相对定量，在与所述测序测定分开的反应中执行定量，使用测定或模板特异性定量标准品，或使用竞争性模板作为定量标准品。
13.一种用于执行定量下一代测序（ngs）测定的方法，其包括：
提供包含待测序的一种或多种未知核酸的样品；
向样品中添加已知数量的内部定量标准品；
制备用于测序的包含内部定量标准品的样品；
对样品中的未知核酸和内部定量标准品进行测序，以生成测序数据；
计数测序数据集中源于未知核酸和内部定量标准品的测序读取数；和
对测序数据集进行归一化，并且通过iqt=源于未知核酸的归一化的未知核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f），来计算未知核酸的输入数量（iqt），其中‘f’是固定的内部定量标准品测序读数的最小预计数目。
14.权利要求13的方法，其中所述样品中的每种未知核酸具有约102-107个拷贝/ml的浓度。
15.权利要求13的方法，其中加入所述样品中的内部定量标准品的已知数量在约104-106个拷贝/ml的范围内。
16.权利要求13的方法，其进一步包括通过norm=测序读取数*（f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数），对测序数据集进行归一化。
17.权利要求16的方法，其中所述归一化分开地（1）将数据接受/拒绝标准应用于测定中的每个样品，并且（2）确保将基本上相同的检测限（lod）应用于每个样品中的所有未知核酸。
18.权利要求13的方法，其进一步包括：将样品中的多个未知核酸（如果存在的话）的输入数量（iqti，iqtj，iqtk…iqtn）计算为iqtn=归于“第n”未知核酸的归一化的未知“n”个核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f）。
19.权利要求13的方法，其进一步包括合并两个或更多个样品，并且使其同时经受测序，其中所述两个或更多个样品在制备之后和在测序之前进行合并。
20.权利要求19的方法，其中每个合并的样品具有与之相关的一组独特的样品特异性鉴定序列，使得可以区别且分开来自该库中的每个样品的测序数据。
21.权利要求20的方法，其中每个合并的样品具有其自身的内部定量标准品，所述内部定量标准品与其自身的一组独特的样品特异性鉴定序列相关，并且其中将定量分开地应用于来自该库中的每个样品的每种核酸。
22.权利要求13的方法，其进一步包括提供待测序的一组测定特异性阳性对照，其中所述阳性对照包括对应于测定中测序的一种或多种未知核酸各自的阳性对照，并且其中所述方法进一步包括基于测定特异性阳性对照的测序读数，将测定特异性校正因子应用于一种或多种未知核酸中的每种。
23.一种用于对下一代测序（ngs）测定中的未知核酸进行归一化和定量的试剂盒，其包括：
内部定量标准品，其中所述内部定量标准品是配置为待以已知量加入样品中的核酸，所述样品包含待测序的未知核酸；和
关于使用内部定量标准品用于对测序数据集进行归一化、以及用于计算未知核酸的输入数量的说明书，
其中所述内部定量标准品被配置为待以约104-106个拷贝/ml的范围加入样品中，
其中使用所述内部定量标准品，通过norm=测序读取数*（f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数），对测序数据进行归一化，其中‘f’是固定的内部定量标准品测序读数的最小预计数目，和
其中使用所述内部定量标准品，通过iqt=源于未知核酸的归一化的未知核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f），来计算未知核酸的输入数量（iqt）。
24.权利要求23的试剂盒，其进一步包括两种或更多种内部定量标准品，其中所述两种或更多种内部定量标准品各自配置为以不同的已知浓度加入样品中，用于生成用于定量未知核酸的标准曲线。
25.权利要求23的试剂盒，其进一步包括用于至少内部定量标准品的测序特异性衔接子，其包含测序引物结合位点和样品特异性鉴定序列。
26.权利要求25的试剂盒，其进一步包括具有定制突出端的靶特异性引物，其配置用于扩增内部定量标准品，并且用于对测序特异性衔接子退火或连接。
27.一种用于执行比较物研究的方法，其包括：
提供包含一种或多种靶核酸的多重扩增和检测的第一测定，所述第一测定具有检测限（lod）；
提供不同于第一测定的第二测定，用于确认检测和第一测定的lod，其中所述第二测定包括：
制备用于测序的包含至少一种内部定量标准品的样品；
测序以生成样品的测序数据集，其中所述测序数据集包括从靶核酸和内部定量标准品观察到的测序读数；
计数测序数据集中源于靶核酸和内部定量标准品的测序读取数；和
对测序数据集进行归一化，其中所述归一化（1）基于关于样品的内部定量标准品的测序读数的最小数目的存在，将数据接受/拒绝标准应用于测序数据集，并且（2）确保将基本上相同的检测限（lod）应用于测序测定中的所有未知核酸，并且其中第二测定的lod与第一测定的lod基本上相同。
28.权利要求27的方法，其进一步包括通过norm=测序读取数*（f/观察到的源于内部定量标准品的测序读取数），对第二测定中的测序数据集进行归一化。
29.权利要求28的方法，其进一步包括通过iqt=源于靶核酸的归一化的靶核酸测序读取数*（内部定量标准品的输入数量/f），来计算样品中的每种靶核酸的输入数量（iqt），其中‘f’是固定的内部定量标准品测序读数的最小预计数目。
30.权利要求27的方法，其中所述第二测定是下一代测序测定。
技术总结用于测序数据的归一化和定量的方法和试剂盒。
技术研发人员：K·M·布罗亚德本特;R·J·克里斯普;A·M·德莫吉内斯;M·K·琼斯;M·罗加切瓦;U·K·斯波尔丁
受保护的技术使用者：拜奥法尔诊断有限责任公司
技术研发日：2019.04.18
技术公布日：2021.03.12
