本实用新型属于生物技术领域，尤其涉及鸡alkbh5基因表达荧光定量rt-pcr试剂盒及检测方法，主要用于鸡alkbh5基因在肌肉和肝脏代谢、生长、分化中的作用机理研究。
背景技术：
表观遗传学是指在基因序列不发生变化的情况下，基因的表达水平发生改变，如dna、rna和蛋白质的化学修饰都是表观遗传学重要的研究内容，近年来，随着科学技术的快速发展，基于dna和蛋白质修饰研究基础，rna甲基化研究在表观遗传领域已成为前沿的研究热点。在众多的rna化学修饰中，rna甲基化修饰约占所有rna修饰的60％以上，其中n-甲基腺嘌呤(n6－methyladenosine，m6a)是真核生物mrna和lncrnas最常见转录后修饰，近年来以m6a为主的rna甲基化修饰研究表明，m6a与基因表达调控以及rna的转录、翻译、剪切、降解、核转运等方面密切相关。m6a甲基化的形成需借助甲基化转移酶的作用将甲基供体sam提供的－ch3转移到rna分子特定的腺嘌呤上，去甲基化需要去甲基化酶和结合蛋白质的作用脱去－ch3而实现。m6a甲基化修饰在细胞内是动态的可逆的修饰过程。
alkbh5基因主要参与m6a甲基化修饰的去甲基化过程。研究发现，alkbh5基因在小鼠睾丸中的表达水平最高，敲除后会导致m6a水平上升，导致精子形态发生异常，睾丸体积变小以及一系列的生殖功能障。在小鼠小脑发育过程中，alkbh5基因的缺失会导致不同细胞中的关键基因m6a修饰发生紊乱，导致小脑细胞增殖和分化异常。在胶质母细胞瘤干样细胞(gscs)中，沉默alkbh5的表达可抑制gscs的增殖。在人上皮性卵巢癌组织中alkbh5的表达与正常卵巢组织相比，显著增加。以上的这些研究，大多数是以人或小鼠为模型，共同揭示了alkbh5在调控动物繁殖、组织生长发育中具有重要作用，在一些重要的经济动物，如鸡上的研究均相对较少。在现代规模化养殖生产中，提高动物的生产性能和繁殖性能对于提高经济效益极为重要，因此就可以从rna甲基化修饰的分子调控机制研究入手，进而通过有效的改变rna分子甲基化修饰的水平来影响鸡的生产性能，产生更多的经济效益。
技术实现要素：
为了解决以上技术问题，本实用新型提供一种鸡alkbh5基因表达荧光定量rt-pcr检测试剂盒，本实用新型试剂盒通过实时荧光定量rt-pcr技术检测鸡alkbh5基因表达，为研究鸡alkbh5表达调控以及生长发育调控奠定基础，为优质鸡育种提供理论依据，具有潜在的应用价值。
本实用新型的目的是通过以下技术方案实现的，鸡alkbh5基因荧光定量rt-pcr试剂盒，包括盒体和盖体，盒体内设有衬垫，衬垫上设有容纳腔，其特征是，所述容纳腔中分别设置sybrgreenmaster热启动荧光pcr混合物、鸡alkbh5基因表达的特异性正反向引物、鸡内参基因gapdh表达的特异性正反向引物、rox染料、灭菌depc水、稀释缓冲液dilutionbuffer。
其中，鸡alkbh5基因正反向引物序列为：
f:5，—tcgttcttcagcgattcggc—3，
r:5，—tcggctgcgtatccactgag—3；
以及鸡内参基因gapdh表达的特异性正反向引物序列为:
f:5，—cgatctgaactacatggtttac—3，
r:5,—tctgcccatttgatgttgc—3。
优选的，所述盒体和盖体活动连接，盖体侧壁上设有卡扣件，卡扣件与盖体顶板平行设置；盒体侧壁上设有卡槽，卡扣件与卡槽相配合，实现盒体和盖体的锁紧。
优选的，所述盒体侧壁为台阶结构，包括自外至内设置的第三侧壁、第四侧壁，第三侧壁的高度小于第四侧壁的高度；第四侧壁上设有突出部，突出部上设置卡槽；
所述盖体侧壁为台阶结构，包括自外至内设置的第一侧壁、第二侧壁，第二侧壁的高度小于第一侧壁的高度；第二侧壁端部内侧设置卡扣件；盖体顶板上设置锁紧件，锁紧件与盖体侧壁平行设置，锁紧件件位于卡扣件侧部，用于锁紧卡扣件；第二侧壁上设有突出部容纳槽。
优选的，所述卡扣件上方的盖体顶板形成第一按压部，第一按压部的厚度大于盖体顶板的厚度，对第一按压部向卡槽方向施力，锁紧盖体和盒体。
优选的，所述卡槽下方的盒体侧壁形成第二按压部，第二按压部的厚度大于盖体顶板的厚度，对第二按压部向盒体内部方向施力，开启盖体。
优选的，所述卡扣件端部为楔块结构。
优选的，所述锁紧件端部楔块结构。
与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果：
第一，本实用新型alkbh5基因荧光定量rt-pcr试剂盒，准确性可靠、快速、特异性强、价格低廉，具有灵敏度高、污染少，操作方便等优点。
第二，本实用新型将盖体和盒体的连接结构改进为活动连接，将其锁紧结构改进为卡扣结构，按压盖体，使得卡扣件伸入卡槽内，实现两者的锁紧；按压卡槽所在的盒体侧壁，使得卡扣从卡槽内脱离，实现盒盖的打卡。
第三，本实用新型在卡扣件的两侧设置锁紧件，如需打开盖体，需对盖体侧壁施力，客服锁紧件对盖体侧壁向外的力，防止卡扣件从卡槽内脱落，进一步保证盒体盖体的锁紧效果。
第四，本实用新型将卡扣件、锁紧件端部设计为楔形结构，便于卡扣件相对于卡槽旋转运动的顺畅，便于锁紧件相对于盒体侧壁内壁上下运动的省力。
附图说明
图1是本实用新型鸡alkbh5基因荧光定量rt-pcr试剂盒的结构示意图；
图2是本实用新型试剂盒的盖体的剖视图；
图3是本实用新型试剂盒的盖体的主视图；
图4是本实用新型试剂盒的盖体与盒体卡扣件与卡槽部位的剖视图；
图5是本实用新型试剂盒的盖体与盒体的剖视图(无卡扣件与卡槽)；
图6是本实用新型alkbh5基因在鸡不同类型肌肉组织中的差异表达量图；
图6中，不同小写字母表示alkbh5基因在不同类型肌肉组织中的表达量差异显著(p＜0.05)。
具体实施方式
结合具体实施例和附图对本实用新型作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。
如图1-5所示，鸡alkbh5基因荧光定量rt-pcr试剂盒，包括盒体1和盖体2，盒体1内设有衬垫5，衬垫5上设有容纳腔6。容纳腔6中分别设置sybrgreenmaster热启动荧光pcr混合物7、鸡alkbh5基因表达的特异性正反向引物8、鸡内参基因gapdh表达的特异性正反向引物9、rox染料10、灭菌depc水11、稀释缓冲液dilutionbuffer12。
其中，鸡alkbh5基因正反向引物序列为：
f:5，—tcgttcttcagcgattcggc—3，
r:5，—tcggctgcgtatccactgag—3；
鸡内参基因gapdh表达的特异性正反向引物序列为：
f:5，—cgatctgaactacatggtttac—3，
r:5,—tctgcccatttgatgttgc—3。
盒体1和盖体2活动连接，盖体2侧壁上设有卡扣件13，卡扣件13与盖体顶板15平行设置；盒体1侧壁上设有卡槽25，卡扣件13与卡槽25相配合，实现盒体1和盖体2的锁紧。
本实用新型将盖体和盒体的连接结构改进为活动连接，将其锁紧结构改进为卡扣结构，按压盖体，使得卡扣件伸入卡槽内，实现两者的锁紧；按压卡槽所在的盒体侧壁，使得卡扣从卡槽内脱离，实现盒盖的打卡。
盒体侧壁为台阶结构，包括自外至内设置的第三侧壁22、第四侧壁23，第三侧壁22的高度小于第四侧壁23的高度；第四侧壁23上设有突出部24，突出部24上设置卡槽25。
盖体侧壁为台阶结构，包括自外至内设置的第一侧壁17、第二侧壁16，第二侧壁16的高度小于第一侧壁17的高度；第二侧壁16端部内侧设置卡扣件13；盖体顶板15上设置锁紧件19，锁紧件19与盖体侧壁平行设置，锁紧件19位于卡扣件13侧部，用于锁紧卡扣件13；第二侧壁16上设有突出部容纳槽18。
本实用新型在卡扣件的两侧设置锁紧件，如需打开盖体，需对盖体侧壁施力，客服锁紧件对盖体侧壁向外的力，防止卡扣件从卡槽内脱落，进一步保证盒体盖体的锁紧效果。
卡扣件13上方的盖体顶板15形成第一按压部26，第一按压部26的厚度大于盖体顶板15的厚度，第一按压部26用于锁紧盖体和盒体。对第一按压部26向卡槽25方向施力，锁紧盖体和盒体。
卡槽25下方的盒体侧壁形成第二按压部27，第二按压部27的厚度大于盖体顶板15的厚度，第二按压部27用于开启盖体。对第二按压部27向盒体内部方向施力，开启盖体。
卡扣件13端部为楔块结构。锁紧件19端部楔块结构。本实用新型将卡扣件、锁紧件端部设计为楔形结构，便于卡扣件相对于卡槽旋转运动的顺畅，便于锁紧件相对于盒体侧壁内壁上下运动的省力。
本实用新型alkbh5基因荧光定量rt-pcr试剂盒，准确性可靠、快速、特异性强、价格低廉，具有灵敏度高、污染少，操作方便等优点。
上述鸡alkbh5基因荧光定量rt-pcr试剂盒的使用方法如下：
(1)组织rna的抽提与纯化：从鸡不同类型肌肉提取总rna并纯化，用dilutionbuffer将rna稀释为同一浓度；
(2)cdna第一链的合成：以步骤(1)中稀释后的rna为模板，反转录合成cdna第一链；
(3)荧光定量realtimepcr扩增反应：采用sybrgreen染料法，以上述(1)设计的alkbh5正反向引物和gapdh基因正反向引物和(2)合成的cdna第一链为模板，在荧光定量pcr仪上进行；
本实用新型所述步骤(3)中realtimepcr扩增的反应条件设置如下：
95℃预变性15min；然后40个循环的95℃变性10s,退火60℃30s。
鸡组织样本经反转录成cdna第一链后，对alkbh5和gapdh基因基因按照设定好的条件同时进行realtimepcr反应，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(ntc)。以gapdh基因为内参照，对alkbh5基因mrna表达水平进行校正，并采用2-δδct法对数据进行处理，计算alkbh5基因相对表达量。
实施例：alkbh5基因在鸡类型肌肉组织中的差异表达量分析
以地方品种鸡文昌鸡为素材，运用本实用新型对文昌鸡不同类型肌肉组织的alkbh5基因进行定量检测。
采集150日龄文昌鸡的不同类型肌肉组织样品，置于液氮速冻后转入-80℃冰箱保存；采用trizol裂解法，从采集到的肌肉样本中提取总rna。将各个样品的总rna浓度用试剂盒中的dilutionbuffer稀释，所有样品最终稀释的浓度为500ng/ul。以稀释后的总rna为模板，按照rt-pcr试剂盒(takara,dalian,china)说明书反转录合成cdna第一链。
荧光定量realtimepcr扩增反应：采用sybrgreeni染料法，以上述稀释后的cdna第一链为模板，设计的alkbh5正反向引物8和gapdh基因正反向引物9，在max3000p荧光定量pcr仪(爱普拜斯)上进行。即各组织样本总rna反转录成cdna第一链后，分别配置alkbh5和gapdh基因各自进行real-timepcr扩增所需的反应体系，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(ntc)。
荧光定量pcr扩增体系配制如表1所示：
表1荧光定量pcr扩增体系配制体系
将每个样本的2个基因的扩增体系同时放入荧光定量pcr仪，进行pcr反应，realtimepcr扩增的反应条件设置如下：
95℃预变性15min；然后40个循环的95℃变性10s,退火60℃30s。
每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(ntc)。以gapdh基因为内参对照，对alkbh5基因mrna表达水平进行校正，并采用2-δδct法对数据进行处理，其中δct＝(ct目的基因-ct内参基因)，以一个时间点为对照，计算不同类型肌肉组织中alkbh5基因的相对表达量。结果见图6。
由图6可以看出，耻坐骨肌内侧头，腓肠肌内侧头肌，背阔肌肌肉组织中alkbh5基因的表达量显著高于其他肌肉组织，说明alkbh5基因可能在调控不同类型肌肉发育中具有重要作用，参与了肌肉肌纤维类型的转化。
1.鸡alkbh5基因荧光定量rt-pcr试剂盒，包括盒体(1)和盖体(2)，盒体(1)内设有衬垫(5)，衬垫(5)上设有容纳腔(6)，其特征是，所述容纳腔(6)中分别设置sybrgreenmaster热启动荧光pcr混合物(7)、鸡alkbh5基因表达的特异性正反向引物(8)、鸡内参基因gapdh表达的特异性正反向引物(9)、rox染料(10)、灭菌depc水(11)、稀释缓冲液(12)；
所述盒体(1)和盖体(2)之间活动连接，盖体(2)侧壁上设有卡扣件(13)，卡扣件(13)与盖体顶板(15)平行设置；盒体(1)侧壁上设有卡槽(25)，卡扣件(13)与卡槽(25)相配合，实现盒体(1)和盖体(2)的锁紧。
2.根据权利要求1所述的鸡alkbh5基因荧光定量rt-pcr试剂盒，其特征是，所述鸡alkbh5基因正反向引物序列为：
f:5，—tcgttcttcagcgattcggc—3，
r:5，—tcggctgcgtatccactgag—3。
3.根据权利要求1所述的鸡alkbh5基因荧光定量rt-pcr试剂盒，其特征是，所述鸡内参基因gapdh表达的特异性正反向引物序列为：
f:5，—cgatctgaactacatggtttac—3，
r:5,—tctgcccatttgatgttgc—3。
4.根据权利要求1所述的鸡alkbh5基因荧光定量rt-pcr试剂盒，其特征是，所述盒体侧壁为台阶结构，包括自外至内设置的第三侧壁(22)、第四侧壁(23)，第三侧壁(22)的高度小于第四侧壁(23)的高度；第四侧壁(23)上设有突出部(24)，突出部(24)上设置卡槽(25)；
所述盖体侧壁为台阶结构，包括自外至内设置的第一侧壁(17)、第二侧壁(16)，第二侧壁(16)的高度小于第一侧壁(17)的高度；第二侧壁(16)端部内侧设置卡扣件(13)；盖体顶板(15)上设置锁紧件(19)，锁紧件(19)与盖体侧壁平行设置，锁紧件(19)位于卡扣件(13)侧部，用于锁紧卡扣件(13)；第二侧壁(16)上设有突出部容纳槽(18)。
5.根据权利要求1所述的鸡alkbh5基因荧光定量rt-pcr试剂盒，其特征是，所述卡扣件(13)上方的盖体顶板(15)形成第一按压部(26)，第一按压部(26)的厚度大于盖体顶板(15)的厚度，对第一按压部(26)向卡槽(25)方向施力，锁紧盖体和盒体。
6.根据权利要求1所述的鸡alkbh5基因荧光定量rt-pcr试剂盒，其特征是，所述卡槽(25)下方的盒体侧壁形成第二按压部(27)，第二按压部(27)的厚度大于盖体顶板(15)的厚度，对第二按压部(27)向盒体内部方向施力，开启盖体。
7.根据权利要求1所述的鸡alkbh5基因荧光定量rt-pcr试剂盒，其特征是，所述卡扣件(13)端部为楔块结构。
8.根据权利要求4所述的鸡alkbh5基因荧光定量rt-pcr试剂盒，其特征是，所述锁紧件(19)端部楔块结构。
技术总结