本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及一种锌转运体8抗体检测试剂盒。
背景技术：
锌转运蛋白8(znt8，又名锌转运体8)为基因slc30a8(染色体8q24.11)所编码，属锌转蛋白(znt)/slc30家族的成员，仅在胰岛β细胞高表达，分布在胰岛细胞中含有胰岛素颗粒的囊泡膜上，在胰岛素的成熟、储存和分泌过程发挥重要作用。其主要功能是利用囊泡膜上的质子泵形成的h 浓度差将zn2 转运入囊泡内，使zn2 积聚在囊泡内参与胰岛素成熟和储存。
znt8参与糖尿病胰岛细胞功能障碍和胰岛素分泌不足的病理生理过程。锌是胰岛α细胞和β细胞分泌的胰高血糖素以及胰岛素旁分泌和自分泌的调节剂，而znt8可以通过影响锌离子浓度进而影响胰岛素的合成及分泌。znt8蛋白作为自身抗原引起以β细胞受损为特征的t淋巴细胞介导的自身免疫反应，进而引发自身免疫系统对胰岛β细胞特异性破坏，导致体内胰岛素绝对缺乏，最终引发1型糖尿病(t1dm)。
znt8a目前被国际公认是继iaa、ia-2a、gada之后的第四种主要胰岛自身抗体，在诊断t1dm及探讨其发病机制方面有重要应用。有研究表明，znt8a青春期1型糖尿病患儿阳性率最高，且随年龄增长阳性率降低。另有研究表明，在新发的t1dm患者中的阳性率高达60％～80％，且在ia-2a、iaa、gada均阴性的t1dm患者中尚存在26％的阳性率，表明znt8a联合ia-2a、iaa、gada抗体能提高t1dm的阳性检出率，亦可在ia-2a、iaa、gada阳性患者中区分出胰岛素缺乏更严重的人群，可使对病患诊断更准确，对病患的治疗更有针对性。
目前，临床上检测锌转运体8抗体的常见方法有酶联免疫吸附法(双抗原夹心法)、间接磁微粒化学发光法等，这些检测方法在临床应用上都存在一些不足。锌转运体8抗体酶联免疫吸附(双抗原夹心法)在临床运用上存在一些缺陷。首先，该方法将抗原固定到特种微孔板上，使用时仅能按照板孔的规格使用，无法实现独立的、单人份的检测。其次，该种试剂盒组分复杂，操作步骤繁琐，不利于临床检验操作者准确、快速地获得检验结果。此外，该方法的检测过程处于开放的空间，容易引起试剂的交叉污染而影响检测结果的准确性。间接磁微粒化学发光法采用酶标或者化学发光物质标记的抗人抗体，该抗体除了能和磁珠上锌转运体8和锌转运体8抗体的免疫复合物结合外，还可能与吸附在磁珠上的人igg等类型的抗体结合造成假阳性。此外，间接磁微粒化学法检测锌转运体8抗体检测的抗体类型有局限性，无法检测血液中所有类型锌转运体8抗体，不利于疾病的早筛查、早诊断、早治疗。
因此，亟需提供一种质量稳定，检测快速便捷，灵敏度高，特异性强的用于检测血液中锌转运体8抗体的试剂盒。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种锌转运体8抗体检测试剂盒，本发明的试剂盒组分简单，操作方便，检测快速便捷，灵敏度高，特异性强，质量稳定，且本发明制备的试剂盒还可以明显提升阳性血清和阴性血清的区分度，降低单一抗原对阳性血清的漏检现象。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种锌转运体8抗体检测试剂盒，包括锌转运体8抗原包被磁珠、生物素标记锌转运体8抗原、碱性磷酸酶标记链酶亲和素以及化学发光底物液。
在本发明的技术方案中，本发明人首次采用磁珠双抗原夹心法，将锌转运体8抗原包被磁珠、生物素标记锌转运体8抗原和血液样本中锌转运体8抗体形成抗原-抗体-抗原复合物，检测阳性血清样本与阴性血清样本，其阳性血清样本与阴性血清样本均有良好的区分度，且采用本发明的方法可以准确检测血清中多种类型的锌转运体8抗体，同时克服了间接法测定锌转运体8抗体的假阳性高的问题，大大减少相关疾病在早期诊断时出现的漏检和假阳性现象，从而有利于临床医生更加准确地制定临床方案。
作为本发明所述锌转运体8抗体检测试剂盒的优选实施方式，所述锌转运体8抗原包被磁珠的浓度为50-200mg/l，所述生物素标记锌转运体8抗原的浓度为20-100μg/l，所述碱性磷酸酶标记链酶亲和素的浓度为2-10μg/l。
作为本发明所述锌转运体8抗体检测试剂盒的优选实施方式，所述锌转运体8包括锌转运体8(r325)和锌转运体8(w325)。
作为本发明所述锌转运体8抗体检测试剂盒的优选实施方式，所述锌转运体8抗原包被磁珠的制备方法包括以下步骤：取羧基化的磁珠，磁分离后去上清，加入缓冲液洗涤，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液和含有n-羟基琥珀酰亚胺的2-(n-吗啡林)乙磺酸水溶液，室温活化磁珠表面羧基，洗涤重悬，然后加入锌转运体8，磁分离去除上清液，加入含牛血清白蛋白的缓冲液，得锌转运体8抗原包被磁珠。
本发明制备得锌转运体8抗原包被磁珠，可以结合所有种类的锌转运体8抗体，避免了以往试剂的漏检现象。
作为本发明所述锌转运体8抗体检测试剂盒的优选实施方式，所述羧基化的纳米磁珠粒径为0.5-1.5μm。
作为本发明所述锌转运体8抗体检测试剂盒的优选实施方式，所述生物素标记锌转运体8抗原的制备方法包括以下步骤：取锌转运体8水溶液加入缓冲液混匀，再加入含有生物素标记的二甲基甲酰胺溶液混匀，加入乙醇胺得反应液，使用g-25脱盐柱对反应液进行纯化，即得。
作为本发明所述锌转运体8抗体检测试剂盒的优选实施方式，所述碱性磷酸酶标记链酶亲和素的制备方法包括以下步骤：
s1.碱性磷酸酶的活化：取碱性磷酸酶和缓冲液混合制备得到碱性磷酸酶溶液，加入sata溶液反应后脱盐，再加入盐酸羟胺溶液，室温反应后脱盐；
s2.链霉亲和素的活化：取链霉亲和素溶液加入4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸-n-琥珀酰亚胺酯，室温反应1-2h；
s3.碱性磷酸酶标记链霉亲和素：将活化后的碱性磷酸酶与链霉亲和素混合，室温反应1-3h后取出纯化，即得。
作为本发明所述锌转运体8抗体检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括处理剂。
作为本发明所述锌转运体8抗体检测试剂盒的优选实施方式，所述处理剂包括表面活性剂、proclin300、氯化盐和含有2％bsa的tris-hcl缓冲液。
另外，本发明的另一目的在于提供一种利用上述试剂盒检测锌转运体8抗体的方法。
为实现此目的，本发明采取的技术方案为：采用锌转运体8抗原包被磁珠、生物素标记锌转运体8抗原和血液样本中锌转运体8抗体在室温下孵育，磁分离洗涤后，加入碱性磷酸酶标记链酶亲和素，再次磁分离洗涤，最后加入化学发光底物液，检测发光值。
通过采用上述方法测定发光值，与标准曲线对比，可推算出样品中锌转运体8抗体的含量，发现锌转运体8抗体的含量与发光值成正相关；本发明采用复合锌转运体8抗原，该种复合抗原可以与血液样本中的绝大部分抗体结合，避免了以往试剂的漏检现象，同时该种方法采用双抗原夹心可以检测血液样本中的所有种类的抗体，能更准确的反映疾病的发展情况。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明提供了一种锌转运体8抗体检测试剂盒，该试剂盒组分简单，操作方便，检测快速便捷，灵敏度高，特异性强及质量稳定；
2)本发明提供了一种锌转运体8抗体检测试剂盒，将锌转运体8抗原包被磁珠、生物素标记锌转运体8抗原和血液样本中锌转运体8抗体形成抗原-抗体-抗原复合物，检测阳性血清样本与阴性血清样本，使得阳性血清样本与阴性血清样本具有良好的区分度。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例或对比例中，纳米磁珠是由纳米级的fe2o3或fe3o4磁性粒子和有机高分子材料进行复合，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的纳米级的固相微球，具有在外加磁场作用下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性。
实施例1、一种锌转运体8抗体检测试剂盒
一种锌转运体8抗体检测试剂盒，包括锌转运体8抗原包被磁珠、生物素标记锌转运体8抗原、碱性磷酸酶标记链酶亲和素以及化学发光底物液。
其中，锌转运体8抗原包被磁珠的浓度为50-200mg/l；
生物素标记锌转运体8抗原的浓度为20-100μg/l；
碱性磷酸酶标记链酶亲和素的浓度为2-10μg/l；
本实施例的检测锌转运体8抗体的试剂盒的制备方法中，除以下试剂外，其余均按照常规方法制备。
一、锌转运体8抗原包被磁珠的制备
取3mg羧基化的纳米磁珠(粒径为0.5μm)，磁分离后，加入100μl25mm2-(n-吗啡林)乙磺酸缓冲液(ph5.0)洗涤5次，磁分离后，分别加入50μl新配制的、冷的50mg/mledc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)水溶液和含有50μl50mg/mln-羟基琥珀酰亚胺的25mm2-(n-吗啡林)乙磺酸(ph5.0)水溶液；室温活化30min后，用100μl25mm的2-(n-吗啡林)乙磺酸缓冲液(ph5.0)洗涤两次活化磁珠后，加入100μl25mm的2-(n-吗啡林)乙磺酸缓冲液(ph5.0)重悬；分别取锌转运体8(r325)和锌转运体8(w325)各120μg加入到活化磁珠中，室温反应2小时；磁分离，去除上清液后，加入200μl含质量浓度为2％的bsa的100mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)，得到锌转运体8抗原包被磁珠母液。
将锌转运体8抗原包被磁珠母液用含0.1％吐温-20、0.05％proclin300、0.15m氯化钠和2％bsa的25mmtris-hcl(ph8.0)稀释到50-200mg/l，制备得到锌转运体8抗原包被磁珠。
二、生物素标记锌转运体8抗原
分别取4μl10mg/ml锌转运体8(r325)和4μl10mg/ml锌转运体8(w325)水溶液，加入到200μl50mm硼酸盐缓冲液(ph8.5)中，混匀，再加入8-10μl20mg/mlnhs-lc-lc-biotin的二甲基甲酰胺溶液混匀。室温反应1小时后加入1.2μl乙醇胺，室温反应30分钟终止反应，反应液使用g-25脱盐柱进行纯化，然后用含0.1％吐温-20、0.05％proclin300、0.15m氯化钠和2％bsa的25mmtris-hcl(ph8.0)稀释到20-100μg/l，得生物素标记锌转运体8抗原。
三、碱性磷酸酶标记链酶亲和素
碱性磷酸酶的活化：分别取7μl碱性磷酸酶和133μl100mmpbs缓冲液(ph7.2)混合制备得到1mg/ml碱性磷酸酶溶液，加入1μl质量浓度为10mg/ml的sata(n-succinimidyl-s-acetylthioacetate)(溶于dmso)反应30min，30min后脱盐(离心除盐柱除盐，1000g2min)；在液体中加入7μl1m盐酸羟胺溶液(溶于100mmpbs含有25mmedta)，室温反应2h后脱盐。
链霉亲和素的活化：分别取30μl链霉亲和素溶液(0.97mg/ml)加入2.2μl10mg/mlsmcc(4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸-n-琥珀酰亚胺酯)，室温反应1小时。
碱性磷酸酶标记链霉亲和素：将活化后的碱性磷酸酶与链霉亲和素混合，室温反应2h后取出，用6ml的交联葡聚糖g75层析柱纯化，然后用含0.1％吐温-20、0.05％proclin300、0.15m氯化钠和2％bsa的25mmtris-hcl(ph8.0)稀释到2-10μg/l即得。
在其他实施例中，羧基化的纳米磁微粒的粒径可为1.0μm或1.2μm或1.5μm，不仅仅限制于本实施例中。
四、采用本实施例的试剂盒检测锌转运体8抗体浓度的方法，包括以下步骤：
取25μl血液样本中、50μl锌转运体8抗原包被磁珠和50μl生物素标记锌转运体8抗原于37℃孵育30min，磁分离洗涤3次后，加入50μl试剂碱性磷酸酶标记链酶亲和素于37℃孵育10min，磁分离洗涤3次后，加入100μl化学发光底物液，检测发光值。测定后以标准品的锌转运体8抗体浓度的值作为x坐标，以信号值作为y坐标，作出标准曲线，根据标准曲线计算出样品中锌转运体8抗体的浓度。
实施例2、一种锌转运体8抗体检测试剂盒
一种锌转运体8抗体检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：
其中，锌转运体8抗原包被磁珠的浓度为50-200mg/l；
生物素标记锌转运体8抗原的浓度为20-100μg/l；
碱性磷酸酶标记链酶亲和素的浓度为2-10μg/l；
本实施例的检测锌转运体8抗体的试剂盒的制备方法中，参照实施例1中的制备方法，除以下步骤外，其余均按照常规方法制备。
一、锌转运体8抗原包被磁珠的制备
取3mg羧基化的纳米磁珠(粒径为0.5μm)，磁分离后，加入100μl25mm2-(n-吗啡林)乙磺酸缓冲液(ph5.0)洗涤5次，磁分离后，分别加入50μl新配制的、冷的50mg/mledc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)水溶液和含有50μl50mg/mln-羟基琥珀酰亚胺的25mm2-(n-吗啡林)乙磺酸(ph5.0)水溶液；室温活化30min后，用100μl25mm的2-(n-吗啡林)乙磺酸缓冲液(ph5.0)洗涤两次活化磁珠后，加入100μl25mm的2-(n-吗啡林)乙磺酸缓冲液(ph5.0)重悬；取锌转运体8(r325)120μg加入到活化磁珠中，室温反应2小时；磁分离，去除上清液后，加入200μl含质量浓度为2％的bsa的100mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)，得到锌转运体8抗原包被磁珠母液。
将锌转运体8抗原包被磁珠母液用含0.1％吐温-20、0.05％proclin300、0.15m氯化钠和2％bsa的25mmtris-hcl(ph8.0)稀释到50-200mg/l，制备得到锌转运体8抗原包被磁珠。
本实施例的步骤一与实施例1步骤一的区别在于，将锌转运体8(r325)单独包被，其余步骤与实施例1相同。
实施例3、一种锌转运体8抗体检测试剂盒
一种锌转运体8抗体检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：
其中，锌转运体8抗原包被磁珠的浓度为50-200mg/l；
生物素标记锌转运体8抗原的浓度为20-100μg/l；
碱性磷酸酶标记链酶亲和素的浓度为2-10μg/l；
本实施例的检测锌转运体8抗体的试剂盒的制备方法中，参照实施例1中的制备方法，除以下步骤外，其余均按照常规方法制备。
一、锌转运体8抗原包被磁珠的制备
取3mg羧基化的纳米磁珠(粒径为0.5μm)，磁分离后，加入100μl25mm2-(n-吗啡林)乙磺酸缓冲液(ph5.0)洗涤5次，磁分离后，分别加入50μl新配制的、冷的50mg/mledc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)水溶液和含有50μl50mg/mln-羟基琥珀酰亚胺的25mm2-(n-吗啡林)乙磺酸(ph5.0)水溶液；室温活化30min后，用100μl25mm的2-(n-吗啡林)乙磺酸缓冲液(ph5.0)洗涤两次活化磁珠后，加入100μl25mm的2-(n-吗啡林)乙磺酸缓冲液(ph5.0)重悬；取锌转运体8(w325)120μg加入到活化磁珠中，室温反应2小时；磁分离，去除上清液后，加入200μl含质量浓度为2％的bsa的100mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)，得到锌转运体8抗原包被磁珠母液。
将锌转运体8抗原包被磁珠母液用含0.1％吐温-20、0.05％proclin300、0.15m氯化钠和2％bsa的25mmtris-hcl(ph8.0)稀释到50-200mg/l，制备得到锌转运体8抗原包被磁珠。
本实施例的步骤一与实施例1步骤一的区别在于，将锌转运体8(w325)单独包被，其余步骤与实施例1相同。
实施例4、一种锌转运体8抗体检测试剂盒(间接法)
一种锌转运体8抗体检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：
其中，锌转运体8抗原包被磁珠的浓度为50-200mg/l；
碱性磷酸酶标记羊抗人igg抗体的浓度为2-10μg/l；
本实施例的检测锌转运体8抗体的试剂盒的制备方法中，参照实施例1中的制备方法，除以下步骤外，其余均按照常规方法制备。
三、碱性磷酸酶标记羊抗人igg抗体
碱性磷酸酶的活化：分别取7μl碱性磷酸酶和133μl100mmpbs缓冲液(ph7.2)混合制备得到1mg/ml碱性磷酸酶溶液，加入1μl质量浓度为10mg/ml的sata(n-succinimidyl-s-acetylthioacetate)(溶于dmso)反应30min，30min后脱盐(离心除盐柱除盐，1000g2min)；在液体中加入7ul1m盐酸羟胺溶液(溶于100mmpbs含有25mmedta)，室温反应2h后脱盐。
碱性磷酸酶标记羊抗人igg：将活化后的碱性磷酸酶与羊抗人igg抗体混合，室温反应2h后取出，用6ml的交联葡聚糖g75层析柱纯化，然后用含0.1％吐温-20、0.05％proclin300、0.15m氯化钠和2％bsa的25mmtris-hcl(ph8.0)稀释到50-100ng/ml即得。
本实施例的步骤三与实施例1步骤三的区别仅在于将链酶亲和素替换为羊抗人igg抗体。
四、采用本实施例的试剂盒检测锌转运体8抗体浓度的方法，包括以下步骤：
取25μl血液样本稀释20倍后，取25μl稀释样本与100μl锌转运体8抗原包被磁珠，于37℃孵育30min。磁分离洗涤3次后，加入50μl碱性磷酸酶标记羊抗人igg于37℃孵育10min。磁分离洗涤3次后，加入100μl化学发光底物液，检测发光值。测定后以标准品的锌转运体8抗体浓度的值作为x坐标，以信号值作为y坐标，作出标准曲线，根据标准曲线计算出样品中锌转运体8抗体的浓度。
本实施例的步骤四与实施例1步骤四的区别在于采用间接法替换磁珠双抗原夹心法，其余步骤与实施例1相同。
试验例一、锌转运体8抗体检测试剂盒的性能评价
采用上述实施例中的检测锌转运体8抗体的试剂盒及其检测方法进行实验对比。
1.灵敏度
功能灵敏度又称临床灵敏度(clinicalsensitivity)，是基于低浓度的基础上用于区分从有到无的分析能力，该值的确定是通过标准品作梯度稀释，采用同一台仪器，同一批号试剂，同一标准曲线，每天1次，每次3遍进行测定，共测3周以上时间的数据，根据批间变异系数(cv)≤20％时的最大稀释管浓度作为功能灵敏度。
(1)标准样品的配制：配制浓度值分别为10u/ml、20u/ml、75u/ml、500u/ml、2000u/ml的锌转运体8抗体标准品做功能灵敏度实验，分别编号为1-5号。
(2)检测方法：在全自动化学发光分析仪smart6500上，分别采用实施例1-4的试剂盒及其检测方法测定这些标准样品，测定结果检测得到试剂盒的灵敏度为0.15u/ml。
2.线性范围
选取临床锌转运体8抗体的高值血清样本与阴性血清样本，混合配制线性样本，浓度分别为10u/ml、20u/ml、75u/ml、500u/ml、2000u/ml。用锌转运体8抗体检测试剂检测线性样本，计算线性样本浓度与对应的发光值的相关系数r，经结果显示相关系数r＝0.996。
3.干扰性试验
取混合高、中、低值血清分别添加干扰物：胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油酯，添加比例为1:20，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测值，计算二者之间的偏差，以±10％为可接受范围。结果表明，各干扰物质的对检测试剂的干扰，均符合相关临床标准。
试验例二、采用锌转运体8抗原包被磁珠与单一锌转运体8抗原包被磁珠的比较
取8例锌转运体8抗体血清样本，分别编号1-8，其中阴性血清和阳性血清分别4例，以上血清样本来自于志愿者经rsr公司生产的znt8自身抗体(znt8ab)elisa检测试剂盒测定为阴性、阳性的血清样本，采用实施例1-3制备的锌转运体8抗体检测试剂盒分别对锌转运体8抗体临床阴性、阳性样本进行检测，检测结果如表1。
表1
从表1的数据可知，采用锌转运体8抗原包被磁珠较单一锌转运体8抗原包被磁珠相比，阳性血清与阴性血清的区分度有了明显的提升，降低了单一抗原对阳性血清的漏检现象。
试验例三、磁珠双抗原夹心法和间接法检测阴性、阳性血清的比较
取10例锌转运体8抗体血清样本，分别编号1-10，以上血清样本来自于志愿者经rsr公司生产的znt8自身抗体(znt8ab)elisa检测试剂盒测定为阴性、阳性的血清样本，其中阴性血清和阳性血清分别5例，分别按照实施例1及实施例4的试剂盒检测锌转运体8抗体浓度的方法，结果见表2。
表2
从表2的数据可知，在检测锌转运体8抗体临床阴性血清样本方面，磁珠双抗原夹心法试剂检测5例锌转运体8抗体临床阴性样本，所有阴性样本的发光值均在1000左右均在控制的范围内；而实施例4采用间接法试剂检测5例锌转运体8抗体临床阴性样本，出现了两例假阳性样本和一例疑似阳性样本；
在检测锌转运体8抗体临床阳性样本方面，磁珠双抗原试剂检测5例锌转运体8抗体临床阳性样本，5例阳性血清样本与阴性血清样本有良好的区分度，其中有3例阳性样本检测发光值与间接法检测发光值相比有显著的提高，这表明本发明的磁珠双抗原夹心法试剂可以检测血清中多种类型的锌转运体8抗体，在实际临床检验中可以避免间接法阳性样本的漏检现象。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
1.一种锌转运体8抗体检测试剂盒，其特征在于，包括锌转运体8抗原包被磁珠、生物素标记锌转运体8抗原、碱性磷酸酶标记链酶亲和素以及化学发光底物液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述锌转运体8抗原包被磁珠的浓度为50-200mg/l，所述生物素标记锌转运体8抗原的浓度为20-100μg/l，所述碱性磷酸酶标记链酶亲和素的浓度为2-10μg/l。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述锌转运体8包括锌转运体8(r325)和锌转运体8(w325)。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述锌转运体8抗原包被磁珠的制备方法包括以下步骤：取羧基化的磁珠，磁分离后去上清，加入缓冲液洗涤，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液和含有n-羟基琥珀酰亚胺的2-(n-吗啡林)乙磺酸水溶液，室温活化磁珠表面羧基，洗涤重悬，然后加入锌转运体8，磁分离去除上清液，加入含牛血清白蛋白的缓冲液，得锌转运体8抗原包被磁珠。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述羧基化的磁珠粒径为0.5-1.5μm。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记锌转运体8抗原的制备方法包括以下步骤：取锌转运体8水溶液加入缓冲液混匀，再加入含有生物素标记的二甲基甲酰胺溶液混匀，加入乙醇胺得反应液，使用g-25脱盐柱对反应液进行纯化，即得。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记链酶亲和素的制备方法包括以下步骤：
s1.碱性磷酸酶的活化：取碱性磷酸酶和缓冲液混合制备得到碱性磷酸酶溶液，加入sata溶液反应后脱盐，再加入盐酸羟胺溶液，室温反应后脱盐；
s2.链霉亲和素的活化：取链霉亲和素溶液加入4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸-n-琥珀酰亚胺酯，室温反应1-2h；
s3.碱性磷酸酶标记链霉亲和素：将活化后的碱性磷酸酶与链霉亲和素混合，室温反应1-3h后取出纯化，即得。
8.如权利要求1-7任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括处理剂。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述处理剂包括表面活性剂、proclin300、氯化盐和含有2％bsa的tris-hcl缓冲液。
技术总结