本发明涉及实验测试技术领域，具体涉及一种蜂胶抑瘤效果测试方法。
背景技术：
蜂胶是蜜蜂从植物幼芽或树干破伤部位采集的树脂，混入上颚腺分泌物和蜂蜡等加工而成的一种具有芳香味的胶状固体物，具有收敛、止泻、消炎、止痛、止血、抗病毒、增进机体免疫功能及促进机体组织再生等多种生物学功能，已被广泛应用于医学、植物保护、食品防腐和日用化工等方面。蜂胶具有多方面的生理和药理活性；不同产地的蜂胶的性能不同，蜂胶具备抑瘤效果，目前针对蜂胶的抑瘤效果的测试方法很多，但是仍未有统一的测试标准。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种蜂胶抑瘤效果测试方法。
本发明解决上述问题的技术方案为：一种蜂胶抑瘤效果测试方法，具体包括以下步骤：
s1，细胞培养，从液氮中取出冻存的sgc及hepg-2细胞，立即置入37℃的恒温水浴箱中，不停的摇晃直至融化，从冻存管中吸取细胞悬液注入离心管并加入5-15倍的培养液，混合后进行离心混合，吸弃上清液，再用pbs洗涤2次，接种于培养瓶，加入体积分数为10％小牛血清的培养基5ml，置于体积分数5％co2、37℃培养箱中常规培养，每3～4天传代一次；
s2，mtt法测定抑瘤效果，用丙酮做溶剂，试验前用dmem培养液将蜂胶提取物配置成质量浓度为200，100，50，25和12.5μg/ml的溶液进行试验，取对数生长期的hepg-2，sgc配置成2×104个/ml的单细胞悬液，分装于96孔培养板中，每孔100μl，培养液中丙酮的质量分数不超过0.5％，细胞的阴性对照组用含0.5％丙酮的细胞悬液，空白对照为dmem细胞悬液，阳性对照为氟尿嘧啶，每个稀释度设3个平行孔，置于二氧化塘培养箱中分别培养24，48h，72hr，每孔加入20μl5mg/ml的mtt生理盐水溶液，继续培养4h，离心后弃上清液,每孔加入100μl的dmso，充分振荡待孔内结晶溶解后,用空白调零，置于570nm波长的酶标仪测定a570的吸光值，按下列公式求出抑瘤抑制率(ic)：
公式中a570为用药组的吸光值；a570对照为阴性对照组的吸光值；
s3，计算半数抑制浓度ic50，以浓度的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，用curverexpert1.3作图得到对数方程，计算ic50值。
进一步的，在步骤s1中，离心混合的速度为1000-2000r/min，时间为5-10min；
进一步的，在步骤s1中，传代时吸弃瓶中培养液，加细胞消化液1ml，消化贴壁细胞，吸取培养液轻轻吹打瓶壁，使其脱离瓶壁形成单个细胞悬液，取对数生长期的细胞用于实验。
本发明具有有益效果：
本发明提供了一种蜂胶抑瘤效果测试方法，采用统一的测试标准对蜂胶的抑瘤效果进行测试，mtt分析法以活细胞代谢物还原剂为基础，mtt为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比。还原生成的formazan结晶可在二甲亚砜溶液中溶解，利用酶标仪测定570nm处的吸光值，以反映出活细胞数目。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以通过具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
一种蜂胶抑瘤效果测试方法，具体包括以下步骤：
s1，细胞培养从液氮中取出冻存的sgc及hepg-2细胞，立即置入37℃的恒温水浴箱中，不停的摇晃令其尽快融化后，从冻存管中吸取细胞悬液注入离心管并加入10倍的培养液，混合后以1500r/min速度离心5min，吸弃上清液，再用pbs洗涤2次，接种于培养瓶，加入体积分数为10％小牛血清的培养基5ml，置于体积分数5％co2、37℃培养箱中常规培养。每3～4天传代一次。传代时，吸弃瓶中培养液，加细胞消化液1ml，消化贴壁细胞，吸取培养液轻轻吹打瓶壁，使其脱离瓶壁形成单个细胞悬液，取对数生长期的细胞用于实验；
s2，mtt法测定抑瘤效果，用丙酮做溶剂，试验前用dmem培养液将蜂胶提取物配置成质量浓度为200，100，50，25和12.5μg/ml的溶液进行试验，取对数生长期的hepg-2，sgc配置成2×104个/ml的单细胞悬液，分装于96孔培养板中，每孔100μl，培养液中丙酮的质量分数不超过0.5％，细胞的阴性对照组用含0.5％丙酮的细胞悬液，空白对照为dmem细胞悬液，阳性对照为氟尿嘧啶，每个稀释度设3个平行孔，置于二氧化塘培养箱中分别培养24，48h，72hr，每孔加入20μl5mg/ml的mtt生理盐水溶液，继续培养4h，离心后弃上清液,每孔加入100μl的dmso，充分振荡待孔内结晶溶解后,用空白调零，置于570nm波长的酶标仪测定a570的吸光值，按下列公式求出抑瘤抑制率(ic)：
公式中a570为用药组的吸光值；a570对照为阴性对照组的吸光值；
s3，计算半数抑制浓度ic50，以浓度的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，用curverexpert1.3作图得到对数方程，计算ic50值。
在步骤s2中，分别采用11种蜂胶样品进行测试，11种蜂胶样品的sgc抑制率测试结果如表1所示，样品1-11号分别对应蜂胶样品1-11号，12号样品为对照药物；
表111种蜂胶提取物对sgc细胞生长抑制作用
11种蜂胶样品的hepg-2抑制率测试结果如表2所示，样品1-11号分别对应蜂胶样品1-11号，12号样品为对照药物；
表211种蜂胶提取物hepg-2细胞生长抑制作用
以样品浓度为横坐标，细胞抑制率为纵坐标用curveeepert1.3计算半数抑制浓度ic50，结果见表3，
表,311种蜂胶样品及对照作用sgc及hepg-2细胞72hr半数抑制率
根据表3，实验结果显示：对于胃癌细胞sgc，蜂胶抗肿瘤活性：样品10>样品4>样品5>样品3>样品9>样品2>样品11>样品6>样品7>样品1>样品8；对于肝癌细胞hepg-2，蜂胶抗肿瘤活性：样品10>样品4>样品8>样品11>样品5>样品3>样品9>样品6>样品2>样品1>样品7；在试验参数范围内，蜂胶样品4，10的对sgc细胞的半数抑制率分别为93.14μg/ml和57.49μg/ml；对hepg-2细胞的半数抑制率分别为111.22μg/ml和99.78μg/ml，抗肿瘤活性明显优于其他产地。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
1.一种蜂胶抑瘤效果测试方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
s1，细胞培养，从液氮中取出冻存的sgc及hepg-2细胞，立即置入37℃的恒温水浴箱中，不停的摇晃直至融化，从冻存管中吸取细胞悬液注入离心管并加入5-15倍的培养液，混合后进行离心混合，吸弃上清液，再用pbs洗涤2次，接种于培养瓶，加入体积分数为10％小牛血清的培养基5ml，置于体积分数5％co2、37℃培养箱中常规培养，每3～4天传代一次；
s2，mtt法测定抑瘤效果，用丙酮做溶剂，试验前用dmem培养液将蜂胶提取物配置成质量浓度为200，100，50，25和12.5μg/ml的溶液进行试验，取对数生长期的hepg-2，sgc配置成2×104个/ml的单细胞悬液，分装于96孔培养板中，每孔100μl，培养液中丙酮的质量分数不超过0.5％，细胞的阴性对照组用含0.5％丙酮的细胞悬液，空白对照为dmem细胞悬液，阳性对照为氟尿嘧啶，每个稀释度设3个平行孔，置于二氧化塘培养箱中分别培养24，48h，72hr，每孔加入20μl5mg/ml的mtt生理盐水溶液，继续培养4h，离心后弃上清液,每孔加入100μl的dmso，充分振荡待孔内结晶溶解后,用空白调零，置于570nm波长的酶标仪测定a570的吸光值，按下列公式求出抑瘤抑制率(ic)：
公式中a570为用药组的吸光值；a570对照为阴性对照组的吸光值；
s3，计算半数抑制浓度ic50，以浓度的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，用curverexpert1.3作图得到对数方程，计算ic50值。
可在二甲亚砜溶液中溶解，利用酶标仪测定570nm处的吸光值，以反映出活细胞数目。
2.如权利要求1所述的一种蜂胶抑瘤效果测试方法，其特征在于：在步骤s1中，离心混合的速度为1000-2000r/min，时间为5-10min。
3.如权利要求1所述的一种蜂胶抑瘤效果测试方法，其特征在于：在步骤s1中，传代时吸弃瓶中培养液，加细胞消化液1ml，消化贴壁细胞，吸取培养液轻轻吹打瓶壁，使其脱离瓶壁形成单个细胞悬液，取对数生长期的细胞用于实验。
技术总结