本发明涉及cp4epsps和btcry1ab/ac双蛋白速测试纸卡及其制备和使用方法，属于转基因蛋白试纸领域。
背景技术：
转基因技术的原理是将人工分离和修饰过的优质基因，导入到生物体基因组中，从而达到改造生物的目的。即将基因片段转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现的遗传性状个体，该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。
epsp合成酶(5-enolpyruvyll-shikimate-3-phosphatesthase,epsps)是广泛存在于微生物和高等植物中重要酶类，是生物体内芳香族氨基酸——色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的关键性酶，能为植物生长所需的芳香族氨基酸的合成提供前提物质。草甘磷能通过抑制epsps的活性而阻断芳香族氨基酸的合成最终导致受试植物死亡。但是来自根癌农杆菌cp4的epsps的活性不被草甘膦所抑制，该细菌epsps基因的表达可以使植物免受除草剂的伤害，使得cp4epsps基因被广泛用于多种转基因作物中，如玉米、大豆等以提高作物生产中的田间除草效果，降低生产成本。
苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis，bt)是一种广泛存在于土壤中的革兰氏阳性菌，在芽抱形成时能产生一种具有特异性杀虫活性的杀虫晶体蛋白(lnsecticidalcrystalprotein，icps)，该蛋白能特异性的杀死鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等昆虫，以及动植物线虫、蜱螨等节肢动物。icp常以内毒素形式存在，当昆虫摄食icp后，在昆虫消化道中肠消化酶的作用下，内毒素被降解成有毒的多肽，多肽分子与昆虫中肠上皮细胞上的特异受体结合，致使细胞膜产生穿孔，引起细胞肿胀裂解，使昆虫幼虫停止取食，最终导致死亡。bt杀虫蛋白基因现已被广泛应用在植物基因工程及转基因育种中。cry杀虫蛋白是bt蛋白的一种，对鳞翅目等多种害虫具有较好毒杀作用，cry1ab/ac基因已被应用于抗虫棉花、玉米等转基因作物。
免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(haucl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、柠檬三钠等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可通过静电结合与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合。胶体金标记技术是免疫层析快速诊断的核心技术，它以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体反应。根据胶体金的高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应等特性，加上结合物的免疫和生物学特性，使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
日前转基因蛋白的常规检测方法是pcr和elisa检测，但是该类方法对场地、仪器、技术人员的要求比较高，样本处理复杂，不适合大量的筛选检测及田间快检。有部分转基因蛋白已经可以通过速测试纸进行检测，但是一次只能检测一种转基因蛋白，对于同时检测双转基因蛋白的方法和产品，目前仍为市场空白。
技术实现要素：
为解决现有技术中转基因蛋白的检测方法对场地、仪器、技术人员的要求较高，样本处理复杂，不适合大量筛选检测及田间快检，且一次只能检测一种转基因蛋白的问题，本发明提供cp4epsps和btcry1ab/ac双蛋白速测试纸卡及其制备方法和应用，具体技术方案如下：
cp4epsps和btcry1ab/ac双蛋白速测试纸卡，所述测试纸卡包括卡壳和试纸条，所述试纸条主体为底板，所述底板上依次设置粘贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上设置t1线、t2线和c线。
所述金标垫上固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体。
所述t1线处固定有2mg/ml鼠抗cp4epsps单克隆抗体，所述t2线处固定有2mg/ml鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体；c线处固定有1mg/ml的羊抗鼠igg二抗。
cp4epsps和btcry1ab/ac双蛋白速测试纸卡的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备40nm胶体金
①将500ml烧杯、20ml小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒等洗净后放入酸缸中浸泡24小时，取出先用自来水冲洗3-4次，再用超纯水冲洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干备用；
②用塑料称量匙称取0.5-2.0g氯金酸粉末于棕色瓶中，加入100ml超纯水溶解，4℃避光保存；称取0.1g柠檬酸三钠溶解于10ml超纯水中，混合均匀备用；
③量取100ml超纯水于烧杯中，加入1.0-2.0ml1％haucl4水溶液，置于恒温磁力搅拌器上搅拌均匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入1.0-1.5ml新制备的1％柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续煮沸出现透明的酒红色，继续煮沸5-10min，自然冷却至室温，加超纯水至100ml，4℃避光保存，即为40nm胶体金；
(2)制备胶体金标记的鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)
①取1ml制取好的胶体金，用0.02m的k2co3调节ph到8.0，先加入50μgcp4epsps鼠抗单克隆抗体(标签抗体1)，再加入50μgbtcry1ab/ac鼠抗单克隆抗体(标签抗体2)，混合均匀，室温反应40min，加入bsa至终浓度为1％，静置30min；
②取0.01-0.05mtris、1-10％海藻糖、1-10％蔗糖在ph为8.5的环境下配制金标抗体稀释液。将①中液体在4℃、12000rpm条件下，离心30min，仔细吸出上层清液，沉淀物用0.05-0.5ml标签抗体稀释液复溶，4℃保存，得到胶体金标记的鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)；
(3)双转基因蛋白cp4epsps和btcry1ab/ac的快速检测试纸卡的制作
①取0.01-0.05mtris、1-10％pvp、1-10％bsa、1-10％蔗糖在ph8.5的环境下配制金标垫处理液；
②取0.1-0.5mtris、1-10％pvp、1-5％tween-20、1-10％蔗糖在ph8.5的环境下配制玻纤处理液；
③将玻纤用玻纤处理液处理2h，烘干备用,即为样品垫；将金标垫用金标垫处理液处理2h，烘干备用；
④在底板上按照常规的方式依次并排粘贴样品垫和固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；在金标垫上固定鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)，在硝酸纤维素膜上的检测区t1处固定1-2mg/ml鼠抗cp4epsps单克隆抗体(包被抗体1)、t2处固定1-2mg/ml鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(包被抗体2)，在c处固定羊抗鼠igg二抗0.5-1mg/ml，然后静置在37℃真空干燥1h；
⑤将上述试纸条裁剪成4mm宽度的条子，然后装在特制卡壳中，做成试纸卡。
进一步的，所述方法包括以下步骤：
(1)制备40nm胶体金
①将500ml烧杯、20ml小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒等洗净后放入酸缸中浸泡24小时，取出先用自来水冲洗3-4次，再用超纯水冲洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干备用；
②用塑料称量匙称取1g氯金酸粉末于棕色瓶中，加入100ml超纯水溶解，4℃避光保存；称取0.1g柠檬酸三钠溶解于10ml超纯水中，混合均匀备用；
③量取100ml超纯水于烧杯中，加入1.5ml1％haucl4水溶液，置于恒温磁力搅拌器上搅拌均匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入1.2ml新制备的1％柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续煮沸出现透明的酒红色，继续煮沸5-10min，自然冷却至室温，加超纯水至100ml，4℃避光保存，即为40nm胶体金；
(2)制备胶体金标记的鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)
①取1ml制取好的胶体金，用0.02m的k2co3调节ph到8.0，先加入50μgcp4epsps鼠抗单克隆抗体(标签抗体1)，再加入50μgbtcry1ab/ac鼠抗单克隆抗体(标签抗体2)，混合均匀，室温反应40min，加入bsa至终浓度为1％，静置30min；
②取0.02mtris、5％海藻糖、10％蔗糖在ph为8.5的环境下配制金标抗体稀释液，将①中液体在4℃、12000rpm条件下，离心30min，仔细吸出上层清液，沉淀物用0.1，l标签抗体稀释液复溶，4℃保存，得到胶体金标记的鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)；
(3)双转基因蛋白cp4epsps和btcry1ab/ac的快速检测试纸卡的制作
①取0.02mtris、1％pvp、1％bsa、10％蔗糖在ph8.5的环境下配制金标垫处理液；
②取0.1mtris、1％pvp、5％tween-20、10％蔗糖在ph8.5的环境下配制玻纤处理液；
③将玻纤用玻纤处理液处理2h，烘干备用，即为样品垫；将金标垫用金标垫处理液处理2h，烘干备用；
④在底板上按照常规的方式依次并排粘贴样品垫和固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；在金标垫上固定鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)，在硝酸纤维素膜上的检测区t1处固定2mg/ml鼠抗cp4epsps单克隆抗体(包被抗体1)、t2处固定2mg/ml鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(包被抗体2)，在c处固定羊抗鼠igg二抗1mg/ml，然后静置在37℃真空干燥1h；
⑤将上述试纸条裁剪成4mm宽度的条子，然后装在特制卡壳中，做成试纸卡。
cp4epsps和btcry1ab/ac双蛋白速测试纸卡的使用，包括以下步骤，
(1)若待检测样品为水和植物组织提取液等液体物质时，直接取100μl样品检测；若待检测样品为植物叶片、茎干、种子等样品时，将样品磨碎，加入样品处理液(10mmpbs、ph7.4)摇匀，静置后取上清液100μl检测，若长时间无上层清液出现，壳用低速离心处理，然后收集上层清液；
(2)将所取样品滴加2-3滴于加样孔内，室温下作用5-10min，然后观察结果；
(3)检测结果分析：
阴性：只出现c线，判断样品为阴性；
阳性：同时出现t1线和c线，判断样品为转基因cp4epsps阳性；
同时出现t2线和c线，判断样品为转基因btcry1ab/ac阳性；
同时出现t1、t2和c线，判断样品为转基因cp4epsps和btcry1ab/ac双阳性；
无效：c线不出现，判断检测结果无效。
本发明的有益效果在于：
(1)操作简单，不需要专门的仪器设备，可方便的于田间等现场直接进行检测。
(2)检测时间短(5-10min)，结果判定标准统一：即阴性结果(-)，只出现1条c线；阳性( )：出现t1线和c线，t2线和c线，或者同时出现t1线、t2线和c线。
(3)本发明可同时检测转基因蛋白cp4epsps和btcry1ab/ac，避免单个转基因蛋白逐个检测的繁琐操作。
(4)本发明能同时检测转基因蛋白cp4epsps和btcry1ab/ac，材料成本大幅缩减，节约了检测成本。
(5)本发明的cp4epsps和btcry1ab/ac双蛋白速测试纸卡，均为独立包装，避免了多个产品包装反复开封受潮的风险，更方便存储和携带。
本发明的cp4epsps和btcry1ab/ac双蛋白速测试纸卡可针对转基因农作物的叶片、种子及其初级加工产品等样品中转基因蛋白cp4epsps和btcry1ab/ac的快速、现场和灵敏的检测。
附图说明
图1为本发明所述快速检测试纸卡的示意图；
图2为本发明所述快速检测试纸的主视图；
图3为本发明所述快速检测试纸的侧视图；
图4为本发明测试阳性结果1示意图；
图5为本发明测试阳性结果2示意图；
图6为本发明测试阳性结果3示意图；
图7为本发明测试阴性结果示意图；
图8为本发明测试无效结果1示意图；
图9为本发明测试无效结果2示意图；
图10为本发明测试无效结果3示意图；
图11为本发明测试无效结果4示意图。
图中：1，卡壳；2，试纸条；3，底板；4，样品垫；5，金标垫；6，硝酸纤维素膜；7，吸水纸；6-1，c线；6-2，t1线；6-3，t2线。
具体实施方式
下面参照附图来描述本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是，这些实施方式仅仅用于解释本发明的技术原理，并非旨在限制本发明的保护范围。
如图1-3所示，cp4epsps和btcry1ab/ac双蛋白速测试纸卡，所述测试纸卡包括卡壳1和试纸条2，所述试纸条2主体为底板3，所述底板3上依次设置样品垫4、金标垫5、硝酸纤维素膜6和吸水纸7，所述硝酸纤维素膜6上设置t1线6-2、t2线6-3和c线6-1。
①所述金标垫5上固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体。
②所述t1线6-2处固定有2mg/ml鼠抗cp4epsps单克隆抗体，所述t2线6-3处固定有2mg/ml鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体；c线6-1处固定有1mg/ml的羊抗鼠igg二抗。
制备步骤如下：
(1)制备40nm胶体金
③将500ml烧杯、20ml小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒等洗净后放入酸缸中浸泡24小时，取出先用自来水冲洗3-4次，再用超纯水冲洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干备用；
④用塑料称量匙称取1g氯金酸粉末于棕色瓶中，加入100ml超纯水溶解，4℃避光保存；称取0.1g柠檬酸三钠溶解于10ml超纯水中，混合均匀备用；
⑤量取100ml超纯水于烧杯中，加入1.5ml1％haucl4水溶液，置于恒温磁力搅拌器上搅拌均匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入1.2ml新制备的1％柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续煮沸出现透明的酒红色，继续煮沸5-10min，自然冷却至室温，加超纯水至100ml，4℃避光保存，即为40nm胶体金；
(2)制备胶体金标记的鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)
①取1ml制取好的胶体金，用0.02m的k2co3调节ph到8.0，先加入50μgcp4epsps鼠抗单克隆抗体(标签抗体1)，再加入50μgbtcry1ab/ac鼠抗单克隆抗体(标签抗体2)，混合均匀，室温反应40min，加入bsa至终浓度为1％，静置30min；
②取0.02mtris、5％海藻糖、10％蔗糖在ph为8.5的环境下配制金标抗体稀释液。将①中液体在4℃、12000rpm条件下，离心30min，仔细吸出上层清液，沉淀物用0.1ml标签抗体稀释液复溶，4℃保存，得到胶体金标记的鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)；
(3)双转基因蛋白cp4epsps和btcry1ab/ac的快速检测试纸卡的制作
①取0.02mtris、1％pvp、1％bsa、10％蔗糖在ph8.5的环境下配制金标垫处理液；
②取0.1mtris、1％pvp、5％tween-20、10％蔗糖在ph8.5的环境下配制玻纤处理液；
③将玻纤用玻纤处理液处理2h，烘干备用，即为样品垫；将金标垫用金标垫处理液处理2h，烘干备用；
④在底板上按照常规的方式依次并排粘贴样品垫和固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；在金标垫上固定鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)，在硝酸纤维素膜上的检测区t1处固定2mg/ml鼠抗cp4epsps单克隆抗体(包被抗体1)、t2处固定2mg/ml鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(包被抗体2)，在c处固定羊抗鼠igg二抗1mg/ml，然后静置在37℃真空干燥1h；
⑤将上述试纸条裁剪成4mm宽度的条子，然后装在特制卡壳中，做成试纸卡。
检测过程如下：首先将无气泡待测液加入试纸卡s孔，样品溶液沿样品垫渗透至涂覆有胶体金标记的鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)的金标垫上，如果样品溶液中含转基因蛋白cp4epsps或者btcry1ab/ac，那么cp4epsps蛋白将与金标垫上的鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)结合，形成cp4epsps抗原-抗体复合物，继续向前涌动，并与nc膜上的鼠抗cp4epsps单克隆抗体(包被抗体1)结合；btcry1ab/ac蛋白将与金标垫上的鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)结合，形成btcry1ab/ac抗原-抗体复合物，继续向前涌动，并与nc膜上的鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(包被抗体2)结合。其余未结合的金标抗体与nc膜上的羊抗鼠igg二抗结合，5-10min后，可于观察区中观察到检测线t和质控线c线的颜色变化。
如图4-11所示，检测结果判断规则如下：
阴性：只出现c线，判断样品为阴性；
阳性：同时出现t1线和c线，判断样品为转基因cp4epsps阳性；
同时出现t2线和c线，判断样品为转基因btcry1ab/ac阳性；
同时出现t1、t2和c线，判断样品为转基因cp4epsps和btcry1ab/ac双阳性；
无效：c线不出现，判断检测结果无效。虽然已经参考优选实施例对本发明进行了描述，但在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件，尤其是，只要不存在结构冲突，各个实施例中所提到的各项技术特征均可以任意方式组合起来。本发明并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。
在本发明的描述中，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示方向或位置关系的术语是基于附图所示的方向或位置关系，这仅仅是为了便于描述，而不是指示或暗示所述装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
此外，还需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域技术人员而言，可根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
术语“包括”或者任何其它类似用语旨在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、物品或者设备/装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其它要素，或者还包括这些过程、物品或者设备/装置所固有的要素。
至此，已经结合附图所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征作出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。
1.cp4epsps和btcry1ab/ac双蛋白速测试纸卡，其特征在于：所述测试纸卡包括卡壳(1)和试纸条(2)，所述试纸条(2)主体为底板(3)，所述底板(3)上依次设置样品垫(4)、金标垫(5)、硝酸纤维素膜(6)和吸水纸(7)，所述硝酸纤维素膜(6)上设置t1线(6-2)、t2线(6-3)和c线(6-1)。
2.根据权利要求1所述的cp4epsps和btcry1ab/ac双蛋白速测试纸卡，其特征在于：所述金标垫(5)上固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的cp4epsps和btcry1ab/ac双蛋白速测试纸卡，其特征在于：所述t1线(6-2)处固定有1-2mg/ml鼠抗cp4epsps单克隆抗体，所述t2线(6-3)处固定有1-2mg/ml鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体；c线(6-1)处固定有0.5-1mg/ml的羊抗鼠igg二抗。
4.cp4epsps和btcry1ab/ac双蛋白速测试纸卡的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(1)制备40nm胶体金
①将500ml烧杯、20ml小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒等洗净后放入酸缸中浸泡24小时，取出先用自来水冲洗3-4次，再用超纯水冲洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干备用；
②用塑料称量匙称取0.5-2g氯金酸粉末于棕色瓶中，加入100ml超纯水溶解，4℃避光保存；称取0.1g柠檬酸三钠溶解于10ml超纯水中，混合均匀备用；
③量取100ml超纯水于烧杯中，加入1.0-2.0ml1％haucl4水溶液，置于恒温磁力搅拌器上搅拌均匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入1.0-1.5ml新制备的1％柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续煮沸出现透明的酒红色，继续煮沸5-10min，自然冷却至室温，加超纯水至100ml，4℃避光保存，即为40nm胶体金；
(2)制备胶体金标记的鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)
①取1ml制取好的胶体金，用0.02m的k2co3调节ph到8.0，先加入50μgcp4epsps鼠抗单克隆抗体(标签抗体1)，再加入50μgbtcry1ab/ac鼠抗单克隆抗体(标签抗体2)，混合均匀，室温反应40min，加入bsa至终浓度为1％，静置30min；
②取0.01-0.05mtris、1-10％海藻糖、1-10％蔗糖在ph为8.5的环境下配制金标抗体稀释液。将①中液体在4℃、12000rpm条件下，离心30min，仔细吸出上层清液，沉淀物用0.05-0.5ml标签抗体稀释液复溶，4℃保存，得到胶体金标记的鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)；
(3)双转基因蛋白cp4epsps和btcry1ab/ac的快速检测试纸卡的制作
①取0.01-0.05mtris、1-10％pvp、1-10％bsa、1-10％蔗糖在ph8.5的环境下配制金标垫处理液；
②取0.1-0.5mtris、1-10％pvp、1-5％tween-20、1-10％蔗糖在ph8.5的环境下配制玻纤处理液；
③将玻纤用玻纤处理液处理2h，烘干备用，即为样品垫；将金标垫用金标垫处理液处理2h，烘干备用；
④在底板上按照常规的方式依次并排粘贴样品垫和固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；在金标垫上固定鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)，在硝酸纤维素膜上的检测区t1处固定1-2mg/ml鼠抗cp4epsps单克隆抗体(包被抗体1)、t2处固定1-2mg/ml鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(包被抗体2)，在c处固定羊抗鼠igg二抗0.5-1mg/ml，然后静置在37℃真空干燥1h；
⑤将上述试纸条裁剪成4mm宽度的条子，然后装在特制卡壳中，做成试纸卡。
5.根据权利要求4所述的cp4epsps和btcry1ab/ac双蛋白速测试纸卡的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(1)制备40nm胶体金
①将500ml烧杯、20ml小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒等洗净后放入酸缸中浸泡24小时，取出先用自来水冲洗3-4次，再用超纯水冲洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干备用；
②用塑料称量匙称取1g氯金酸粉末于棕色瓶中，加入100ml超纯水溶解，4℃避光保存；称取0.1g柠檬酸三钠溶解于10ml超纯水中，混合均匀备用；
③量取100ml超纯水于烧杯中，加入1.5ml1％haucl4水溶液，置于恒温磁力搅拌器上搅拌均匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入1.2ml新制备的1％柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续煮沸出现透明的酒红色，继续煮沸5-10min，自然冷却至室温，加超纯水至100ml，4℃避光保存，即为40nm胶体金；
(2)制备胶体金标记的鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)
①取1ml制取好的胶体金，用0.02m的k2co3调节ph到8.0，先加入50μgcp4epsps鼠抗单克隆抗体(标签抗体1)，再加入50μgbtcry1ab/ac鼠抗单克隆抗体(标签抗体2)，混合均匀，室温反应40min，加入bsa至终浓度为1％，静置30min；
②取0.02mtris、5％海藻糖、10％蔗糖在ph为8.5的环境下配制金标抗体稀释液。将①中液体在4℃、12000rpm条件下，离心30min，仔细吸出上层清液，沉淀物用0.1ml标签抗体稀释液复溶，4℃保存，得到胶体金标记的鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)；
(4)双转基因蛋白cp4epsps和btcry1ab/ac的快速检测试纸卡的制作
①取0.02mtris、1％pvp、1％bsa、10％蔗糖在ph8.5的环境下配制金标垫处理液；
②取0.1mtris、1％pvp、5％tween-20、10％蔗糖在ph8.5的环境下配制玻纤处理液；
③将玻纤用玻纤处理液处理2h，烘干备用，即为样品垫；将金标垫用金标垫处理液处理2h，烘干备用；
④在底板上按照常规的方式依次并排粘贴样品垫和固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；在金标垫上固定鼠抗cp4epsps单克隆抗体(标签抗体1)和鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(标签抗体2)，在硝酸纤维素膜上的检测区t1处固定2mg/ml鼠抗cp4epsps单克隆抗体(包被抗体1)、t2处固定2mg/ml鼠抗btcry1ab/ac单克隆抗体(包被抗体2)，在c处固定羊抗鼠igg二抗1mg/ml，然后静置在37℃真空干燥1h；
将上述试纸条裁剪成4mm宽度的条子，然后装在特制卡壳中，做成试纸卡。
6.cp4epsps和btcry1ab/ac双蛋白速测试纸卡的使用，其特征在于：包括以下步骤，
(1)若待检测样品为水和植物组织提取液等液体物质时，直接取100μl样品检测；若待检测样品为植物叶片、茎干、种子等样品时，将样品磨碎，加入样品处理液(10mmpbs、ph7.4)摇匀，静置后取上清液100μl检测，若长时间无上层清液出现，可用低速离心处理，然后收集上层清液；
(2)将所取样品滴加2-3滴于加样孔内，室温下作用5-10min，然后观察结果；
(3)检测结果分析：
阴性：只出现c线，判断样品为阴性；
阳性：同时出现t1线和c线，判断样品为转基因cp4epsps阳性；
同时出现t2线和c线，判断样品为转基因btcry1ab/ac阳性；
同时出现t1、t2和c线，判断样品为转基因cp4epsps和btcry1ab/ac双阳性；
无效：c线不出现，判断检测结果无效。
技术总结