本发明属于生物检测
技术领域：
，具体涉及一种定量检测gfap的试剂盒及其应用。
背景技术：
：创伤性脑损伤(tbi)是由外力引起的大脑损伤，会破坏大脑正常功能，导致人的认知能力或身体机能受损。在所有类型tbi中，最常见的后遗症为头痛(47.9％)和记忆异常(42％)，约三成患者需要心理辅导或神经病学治疗。tbi是神经外科中最常见疾病，也是世界范围内主要的死亡原因及致残因素之一，其后遗症对患者健康有永久性影响。有研究表明，全球范围内tbi发生率为790-979人/10万/年，全球每年估计有5400-6000万人新患tbi。以此估算，中国每年新增tbi患者1100-1370万人。疑似tbi的医疗护理流程分为三步，首先使用15分格拉斯哥昏迷量表(gcs)对神经进行评估，以评定脑损伤严重度，然后进行结构性神经影像学检查，最常见的是通过头部ct扫描来可视化骨折和颅内病变，最后根据ct结果制定治疗方案、留院观察或出院。目前，ct扫描是广泛用于帮助临床医师评估tbi的唯一客观、简单且可靠的选择。然而，ct结果的正确性与ct设备的准确性及医师的阅片水平直接相关，和其他检测方法相比，是一种相对主观的判断方法。约90％轻度tbi(有时被称为“脑震荡”)的ct扫描结果呈阴性。这些患者中只有不到1％的人需进行神经外科干预。鉴于这些患者的ct扫描阳性百分比非常低且不必要影像学检测可能会增加辐射诱发癌变的风险，寻找开发其他的脑损伤诊断方法来准确判断颅脑损伤程度和评估预后，具有巨大的临床意义和战略意义。胶质纤维酸性蛋白(gfap)是一种ⅲ型中间纤丝蛋白。人的gfap由432个氨基酸组成，主要分布于中枢神经系统的星形胶质细胞，参与细胞骨架的构成并维持其张力强度。gfap是一种神经系统特异性蛋白，其在脑损伤中对神经系统功能的恢复有重要影响。在tbi中，gfap在1小时内会通过血脑屏障进入血液，导致血清gfap显著升高。对tbi的早期诊断，鉴别诊断和判断预后有重要的意义，临床上主要用于脑外伤的辅助诊断。cn109521004a公开了一种用于检测胶质纤维酸性蛋白(gfap)的磁微粒分离化学发光免疫测定法，试剂盒组成包括：校准品、质控品试剂a、试剂b、清洗液浓缩液、发光底物液，其中，校准品为含一系列浓度的胶质纤维酸性蛋白(gfap)抗原，用于建立标准曲线；质控品为含一定浓度胶质纤维酸性蛋白(gfap)抗原的缓冲液配制而成；试剂a为含一定浓度磁微粒标记的胶质纤维酸性蛋白(gfap)抗体溶液；试剂b为含一定浓度碱性磷酸酶标记的胶质纤维酸性蛋白(gfap)抗体溶液；清洗液浓缩液用于配制清洗液；发光底物液为碱性磷酸酶(alp)催化的发光底物溶液。该发明提高了免疫反应的信号强度和灵敏度，使低含量物质在进行免疫结合时也能产生很强的化学发光信号，为人体胶质纤维酸性蛋白(gfap)的检测提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法，但是，该发明采用的磁微粒标记的胶质纤维酸性蛋白(gfap)抗体易聚沉淀，流动性差，使用时易出现挂壁残留，从而使检测过程中发挥作用的颗粒减少，导致测试结果的准确性和稳定性差。cn105300966a公开了一种保存液，包括0.1-10g/l缓冲盐、100-300g/l抗体稳定剂、0.1-1g/l防腐抑菌剂、2-12g/l卡拉胶与水，该发明保存液中缓冲盐、抗体稳定剂与防腐抑菌剂共同作用，保证了整个体系中的磁性微粒子或磁性纳米颗粒与抗体的稳定，但该体系导致试剂盒检测的线性变差，且检测结果的准确性和稳定性差，不能满足行业标准。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种定量检测gfap的试剂盒，通过改进磁微粒发光法中的磁微粒载体的缓冲体系，改善了磁微粒抗体偶联物的流动性和沉降性能，提高了试剂盒检测结果的准确性和重复性，稳定性好，同时，检出限低，线性关系好，符合行业标准。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：本发明提供了一种磁微粒标记的gfap抗体溶液，由gfap抗体磁微粒偶联物和缓冲液9组成；所述缓冲液9，由以下组分组成：na2hpo4·12h2o5.6-5.9g/l、nah2po40.55-0.60g/l、nacl9.0g/l、牛血清白蛋白1.0-50g/l、蔗糖80.0-140g/l、纤维素盐或纤维素衍生物1.0-5.0g/l、明胶5.0-50g/l；ph为6.2-8.0。优选地，上述gfap抗体磁微粒偶联物的制备方法，包括以下步骤：a1、将磁微粒用缓冲液4清洗后，重悬至5mg/ml，得到磁微粒溶液；按磁微粒与抗体质量比100:1-10的比例，向磁微粒溶液中加入gfap抗体，得到混合液1；a2、按缓冲液4与磁微粒体积质量比100:1-10的比例，向混合液1中加入缓冲液4，室温反应10min，得到混合液2，按缓冲液5与磁微粒体积质量比100:1-10的比例，向混合物2中加入缓冲液5，37℃反应16-24小时，得到磁微粒偶联物；a3、用缓冲液6清洗磁微粒偶联物，重悬至5mg/ml，37℃反应16-24小时，用缓冲液8清洗磁微粒偶联物，重悬至10mg/ml，即得所述gfap抗体磁微粒偶联物。优选地，步骤a1中所述磁微粒为甲苯磺酰基磁珠。优选地，步骤a1中所述缓冲液4，由以下组分组成：na2b4o7·10h2o7-10g/l，ph为9.0-11.0。优选地，步骤a2中所述缓冲液5，由以下组分组成：k2hpo4470-530g/l；ph为9.0-11.0。优选地，步骤a3中所述缓冲液6，由以下组分组成：tris7.5-8.0g/l、nacl9.0g/l、牛血清白蛋白3.0-10.0g/l和吐温205-20ml；ph为7.3-7.8。优选地，步骤a3中所述缓冲液8，由以下组分组成：na2hpo4·12h2o5.6-5.9g/l、nah2po40.55-0.60g/l、nacl9.0g/l和牛血清白蛋白1.0-50g/l；ph为7.0-7.6。本发明还提供了一种检测试剂条，包括上述磁微粒标记的gfap抗体溶液。本发明还提供了一种定量检测gfap的试剂盒，包括上述检测试剂条。一种定量检测gfap的试剂盒由检测试剂条、校准品、质控品和二维码组成，其中，检测试剂条由一系列溶液和附件组成一个整体，可以独立检测一个样本；校准品由两个浓度的gfap抗原和缓冲液配制而成，用于校准标准曲线；质控品由gfap抗原和缓冲液配制而成；二维码中录入了当批次的标准曲线。优选地，所述检测试剂条包括试剂a、试剂b、清洗液和发光底物，其中，试剂a为含一定浓度碱性磷酸酶标记的gfap抗体溶液；试剂b为含一定浓度磁微粒标记的gfap抗体溶液；清洗液用于反应过程的清洗；所述发光底物为alp催化的发光底物。优选地，所述碱性磷酸酶标记的gfap抗体溶液，由酶标gfap抗体偶联物和缓冲液8组成。优选地，所述酶标gfap抗体偶联物的制备方法，包括以下步骤：b1、抗体的活化：b1.1活化步骤：称取4-8mg2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-it)，用缓冲液1溶解至13.76mg/ml，按2-it与抗体摩尔比15-30:1的比例将2it溶液加入抗体溶液中进行活化(即：1mg抗体加入10-20μl的2it溶液)，震荡混匀后在室温下反应30分钟，得到活化抗体预产物；b1.2终止活化步骤：按1mg抗体加入5-20μl缓冲液2的比例将缓冲液2加入活化抗体预产物溶液中，室温反应10min，使用pd10脱盐柱除去过量的2it，收集活化后的抗体，得到活化抗体，将活化抗体加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1-4mg/ml之间，得到浓缩的活化抗体。b2、碱性磷酸酶(alp)的活化b2.1活化步骤：称取2-4mg(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)，用二甲基甲酰胺(dmf)溶解至6.69mg/ml，按smcc与alp摩尔比15-60:1的比例，在alp溶液中加入smcc溶液(即：1mgalp加入8.5-34.5μlsmcc溶液),震荡混匀后室温下反应30分钟，得到碱性磷酸酶(alp)活化预产物；b2.2终止活化步骤：按1mgalp加入10-50μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入alp溶液中，室温反应10min，使用pd10脱盐柱除去过量的smcc，收集活化后的alp，得到活化alp，将活化后的alp加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1-4mg/ml之间，得到浓缩的活化alp；b3、活化抗体和活化alp的连接将步骤b1.2中得到的浓缩的活化抗体与步骤b2.2中得到的浓缩的活化alp按质量比1:2-1的比例混合(即：1.0mg抗体加入1.0-2.0mgalp)，震荡混匀后，将混合物在2℃-8℃环境中反应12-18小时，即得到抗体偶联物预产物；b4、抗体偶联物的终止和纯化称取1-10mg马来酰亚胺，用dmf溶解至9.7mg/ml，按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/ml马来酰亚胺溶液；按1mg抗体加入10μl0.97mg/ml马来酰亚胺溶液比例加入马来酰亚胺溶液，在室温下反应15分钟；取6μl乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mm，即在6μl乙醇胺加入994μl缓冲液1，按1mg抗体加入10-50μl100mm乙醇胺溶液的比例加入乙醇胺溶液，震荡混匀；使用超滤浓缩管将待纯化的抗体偶联物浓缩至0.5-2mg/ml；使用纯化蛋白分析仪和superdex200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2，纯化后得到酶标抗体偶联物。本发明还提供了上述试剂盒在在检测人外周血和/或血清gfap含量中的应用。本发明还提供了一种上述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：s1、免疫反应：将30ul样本、50ul试剂b、50ul试剂a依次加入反应孔位中，在37℃条件下反应20min；s2、磁分离及清洗：在清洗孔位m1加入300μl清洗液，将含磁微粒的混合物用磁力吸出反应孔位，在清洗孔位m1脱磁；清洗2min后，在清洗孔位m2、清洗孔位m3分别进行1次磁分离及清洗；s3、读值：在测读孔加入150ul发光底物，将含磁微粒的混合物用磁力吸出清洗孔位m3，在测读孔脱磁，碱性磷酸酶催化的发光底物发光后检测相对发光强度(rlu)；s4、根据检测的校准品数值，获得一条gfap浓度-发光值标准曲线，所述标准曲线使用四参数logistic方程拟合；s5、样本的检测值与标准曲线上的浓度值对应，从而实现对样本的浓度检测。本发明的有益效果为：(1)本发明使用免疫学检测手段对创伤性脑损伤进行血液检测，与影像学检测手段(主要为ct)相比，本专利更能客观的反映样本的真实情况，减少了因主观判断造成的误判和漏判；(2)本发明使用的磁微粒化学发光法，并控制校准品、质控品，以及试剂盒a和试剂盒b的具体组分，使用特定的缓冲溶液进行稀释，可以使检测灵敏度达到皮克级别(10-12g/ml)，即便在ct为阴性的情况下，也可以对正常人和轻度tbi患者进行有效区分；(3)本发明使用全自动仪器进行检测，只需加入血清样本，30分钟即可得到准确结果。而ct检测时间较长，至少需要等待4小时才可能取得检测结果；(4)本发明使用浓度数值进行判断，取得结果即可得知患者是否患病，客观性较强，不容易造成漏判、误判；(5)磁微粒是有一定质量的颗粒，成分主要为feo及fe2o3，其直径在1-4微米之间且不溶于水，磁微粒抗体偶联物由于连接了蛋白有一定的亲水性，在重力作用下，磁微粒抗体偶联物会在水介质中快速下沉，并且在一定时间后会出现板结，板结后再次混匀的难度很大。本发明通过改进磁微粒发光法中的磁微粒载体的缓冲体系，改善了磁微粒抗体偶连物的流动性和沉降性能，提高了检测结果的稳定性，重复性好，同时检出限较低，线性关系良好。附图说明图1为免疫反应流程图。图2gfap检测试剂条示意图。其中：a-反应孔位、m1-清洗孔位、m2-清洗孔位、m3-清洗孔位、b-测读孔。具体实施方式以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同意义。如无特殊说明，本发明所采用的水为纯化水，采用的缓冲液均经0.22μm的滤膜进行过滤处理。基础实施例如附图1和2所示，本发明提供了一种定量检测gfap的试剂盒由检测试剂条、校准品、质控品和二维码组成，其中，检测试剂条由一系列溶液和附件组成一个整体，可以独立检测一个样本；校准品由两个浓度的gfap抗原和缓冲液配制而成，用于校准标准曲线；质控品由gfap抗原和缓冲液配制而成；二维码中录入了当批次的标准曲线。所述检测试剂条包括试剂a、试剂b、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套和吸头组成，其中，试剂a为含一定浓度碱性磷酸酶标记的gfap抗体溶液；试剂b为含一定浓度磁微粒标记的gfap抗体溶液；清洗液用于反应过程的清洗；发光底物为alp催化的发光底物；测读孔用于最终的检测读值；所述试剂a的制备方法为：将酶标gfap抗体偶联物溶解于缓冲液8中，混合均匀；所述缓冲液8，由以下组分组成：na2hpo4·12h2o5.6-5.9g/l、nacl9.0g/l和牛血清白蛋白1.0-50g/l，ph为7.0-7.6。所述酶标gfap抗体偶联物的制备方法为：包括以下步骤：b1、抗体的活化：b1.1活化步骤：称取4-8mg2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-it)，用缓冲液1溶解至13.76mg/ml，按2-it与抗体摩尔比15-30:1的比例将2it溶液加入抗体溶液中进行活化(即：1mg抗体加入10-20μl的2it溶液)，震荡混匀后在室温下反应30分钟，得到活化抗体预产物；b1.2终止活化步骤：按1mg抗体加入5-20μl缓冲液2的比例将缓冲液2加入活化抗体预产物溶液中，室温反应10min，使用pd10脱盐柱除去过量的2it，收集活化后的抗体，得到活化抗体，将活化抗体加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1-4mg/ml之间，得到浓缩的活化抗体；b2、碱性磷酸酶(alp)的活化b2.1活化步骤：称取2-4mg(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)，用二甲基甲酰胺(dmf)溶解至6.69mg/ml，按smcc与alp摩尔比15-60:1的比例，在alp溶液中加入smcc溶液(即：1mgalp加入8.5-34.5μlsmcc溶液)，震荡混匀后室温下反应30分钟，得到碱性磷酸酶(alp)活化预产物；b2.2终止活化步骤：按1mgalp加入10-50μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入alp溶液中，室温反应10min，使用pd10脱盐柱除去过量的smcc，收集活化后的alp，得到活化alp，将活化后的alp加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1-4mg/ml之间，得到浓缩的活化alp；b3、活化抗体和活化alp的连接将步骤b1.2中得到的浓缩的活化抗体与步骤b2.2中得到的浓缩的活化alp按质量比1:2-1的比例混合(即：1.0mg抗体加入1.0-2.0mgalp)，震荡混匀后，将混合物在2℃-8℃环境中反应12-18小时，即得到抗体偶联物预产物；b4、抗体偶联物的终止和纯化称取1-10mg马来酰亚胺，用dmf溶解至9.7mg/ml，按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/ml马来酰亚胺溶液；按1mg抗体加入10μl0.97mg/ml马来酰亚胺溶液比例加入马来酰亚胺溶液，在室温下反应15分钟；取6μl乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mm，即在6μl乙醇胺加入994μl缓冲液1，按1mg抗体加入10-50μl100mm乙醇胺溶液的比例加入乙醇胺溶液，震荡混匀；使用超滤浓缩管将待纯化的抗体偶联物浓缩至0.5-2mg/ml；使用纯化蛋白分析仪和superdex200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2，纯化后得到酶标抗体偶联物；所述缓冲液1，由以下组分组成：乙醇胺14.8-15.1g/l和nacl5.8-6.0g/l，ph为7.3-7.6；所述缓冲液2，由以下组分组成：甘氨酸75g/l；所述试剂b的制备方法为：将gfap抗体磁微粒偶联物溶解于缓冲液9中，混合均匀；所述缓冲液9，由以下组分组成：na2hpo4·12h2o5.6-5.9g/l、nah2po40.55-0.60g/l、nacl9.0g/l、牛血清白蛋白1.0-50g/l、蔗糖80.0-140g/l、纤维素盐或纤维素衍生物1.0-5.0g/l、明胶5.0-50g/l；ph为6.2-8.0。所述gfap抗体磁微粒偶联物的制备方法，包括以下步骤：a1、将磁微粒用缓冲液4清洗后，重悬至5mg/ml，得到磁微粒溶液；按磁微粒与抗体质量比100:1-10的比例，向磁微粒溶液中加入gfap抗体，得到混合液1；a2、按缓冲液4与磁微粒体积质量比100:1-10的比例，向混合液1中加入缓冲液4，室温反应10min，得到混合液2，按缓冲液5与磁微粒体积质量比100:1-10的比例，向混合物2中加入缓冲液5，37℃反应16-24小时，得到磁微粒偶联物；a3、用缓冲液6清洗磁微粒偶联物，重悬至5mg/ml，37℃反应16-24小时，用缓冲液8清洗磁微粒偶联物，重悬至10mg/ml，即得所述gfap抗体磁微粒偶联物；所述缓冲液4，由以下组分组成：na2b4o7·10h2o7.0-10.0g/l；ph为9.0-11.0；所述缓冲液5，由以下组分组成：k2hpo4470-530g/l；ph为9.0-11.0；所述缓冲液6，由以下组分组成：tris7.5-8.0g/l、nacl9.0g/l、牛血清白蛋白3.0-10g/l、吐温205-20ml；ph为7.3-7.8。所述校准品为浓度为20pg/ml和160pg/ml的gfap重组蛋白溶液，其制备方法为：将gfap重组蛋白溶解于缓冲液7中，混合均匀；所述质控品为浓度为40pg/ml的gfap重组蛋白溶液，其制备方法为：将gfap重组蛋白溶解于缓冲液7中，混合均匀；所述缓冲液7，由以下组分组成：tris12.0-15.0g/l、牛血清白蛋白5.0-50g/l、甘氨酸1.0-30g/l；ph为7.6-8.8。本发明还提供了上述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：s1、免疫反应：将30ul样本、50ul试剂b、50ul试剂a依次加入反应孔位中，在37℃条件下反应20min；s2、磁分离及清洗：在清洗孔位m1加入300μl清洗液，将含磁微粒的混合物用磁力吸出反应孔位，在清洗孔位m1脱磁；清洗2min后，在清洗孔位m2、清洗孔位m3分别进行1次磁分离及清洗；s3、读值：在测读孔加入150ul发光底物，将含磁微粒的混合物用磁力吸出清洗孔位m3，在测读孔脱磁，碱性磷酸酶催化的发光底物发光后检测相对发光强度(rlu)；s4、根据检测的校准品数值，获得一条gfap浓度-发光值标准曲线，所述标准曲线使用四参数logistic方程拟合；s5、样本的检测值与标准曲线上的浓度值对应，从而实现对样本的浓度检测。为了方便本领域技术人员对本发明的理解，下面结合具体实施例对发明的技术方案和技术效果进行进一步阐述。实施例1一种定量检测gfap的试剂盒由检测试剂条、校准品、质控品和二维码组成(如表1所示)，其中，检测试剂条由一系列溶液和附件组成一个整体，可以独立检测一个样本；校准品由两个浓度的gfap抗原和缓冲液配制而成，用于校准标准曲线；质控品由gfap抗原和缓冲液配制而成；二维码中录入了当批次的标准曲线。表1试剂盒的组分表所述检测试剂条包括试剂a、试剂b、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套和吸头组成，其中，试剂a为含一定浓度碱性磷酸酶标记的gfap抗体溶液；试剂b为含一定浓度磁微粒标记的gfap抗体溶液；清洗液用于反应过程的清洗；发光底物为alp催化的发光底物；测读孔用于最终的检测读值；所述试剂a的制备方法为：将酶标gfap抗体偶联物溶解于缓冲液8中，混合均匀；所述缓冲液8，由以下组分组成：na2hpo4·12h2o5.6g/l、nacl9.0g/l和牛血清白蛋白1.0g/l，ph为7.0-7.6。所述酶标gfap抗体偶联物的制备方法为：包括以下步骤：b1、抗体的活化：b1.1活化步骤：称取4-8mg2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-it)，用缓冲液1溶解至13.76mg/ml，按2-it与抗体摩尔比15:1的比例将2it溶液加入抗体溶液中进行活化(即：1mg抗体加入10μl的2it溶液)，震荡混匀后在室温下反应30分钟，得到活化抗体预产物；b1.2终止活化步骤：按1mg抗体加入5μl缓冲液2的比例将缓冲液2加入活化抗体预产物溶液中，室温反应10min，使用pd10脱盐柱除去过量的2it，收集活化后的抗体，得到活化抗体，将活化抗体加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1-4mg/ml之间，得到浓缩的活化抗体；b2、碱性磷酸酶(alp)的活化b2.1活化步骤：称取2-4mg(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)，用二甲基甲酰胺(dmf)溶解至6.69mg/ml，按smcc与alp摩尔比15:1的比例，在alp溶液中加入smcc溶液(即：1mgalp加入8.5μlsmcc溶液)，震荡混匀后室温下反应30分钟，得到碱性磷酸酶(alp)活化预产物；b2.2终止活化步骤：按1mgalp加入10μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入alp溶液中，室温反应10min，使用pd10脱盐柱除去过量的smcc，收集活化后的alp，得到活化alp，将活化后的alp加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1-4mg/ml之间，得到浓缩的活化alp；b3、活化抗体和活化alp的连接将步骤b1.2中得到的浓缩的活化抗体与步骤b2.2中得到的浓缩的活化alp按质量比1:2的比例混合(即：1.0mg抗体加入2.0mgalp)，震荡混匀后，将混合物在2℃℃环境中反应18小时，即得到抗体偶联物预产物；b4、抗体偶联物的终止和纯化称取1-10mg马来酰亚胺，用dmf溶解至9.7mg/ml，按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/ml马来酰亚胺溶液；按1mg抗体加入10μl0.97mg/ml马来酰亚胺溶液比例加入马来酰亚胺溶液，在室温下反应15分钟；取6μl乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mm，即在6μl乙醇胺加入994μl缓冲液1，按1mg抗体加入10μl100mm乙醇胺溶液的比例加入乙醇胺溶液，震荡混匀；使用超滤浓缩管将待纯化的抗体偶联物浓缩至0.5-2mg/ml；使用纯化蛋白分析仪和superdex200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2，纯化后得到酶标抗体偶联物；所述缓冲液1，由以下组分组成：乙醇胺14.8g/l和nacl5.8g/l，ph为7.3-7.6；所述缓冲液2，由以下组分组成：甘氨酸75g/l；所述试剂b的制备方法为：将gfap抗体磁微粒偶联物溶解于缓冲液9中，混合均匀；所述缓冲液9，由以下组分组成：na2hpo4·12h2o5.6g/l、nah2po40.55g/l、nacl9.0g/l、牛血清白蛋白1.0g/l、蔗糖80.0g/l、纤维素盐或纤维素衍生物1.0g/l、明胶50g/l；ph为6.2-8.0。所述gfap抗体磁微粒偶联物的制备方法，包括以下步骤：a1、将磁微粒用缓冲液4清洗后，重悬至5mg/ml，得到磁微粒溶液；按磁微粒与抗体质量比100:1的比例，向磁微粒溶液中加入gfap抗体，得到混合液1；a2、按缓冲液4与磁微粒体积质量比100:1的比例，向混合液1中加入缓冲液4，室温反应10min，得到混合液2，按缓冲液5与磁微粒体积质量比100:1的比例，向混合物2中加入缓冲液5，37℃反应16小时，得到磁微粒偶联物；a3、用缓冲液6清洗磁微粒偶联物，重悬至5mg/ml，37℃反应16小时，用缓冲液8清洗磁微粒偶联物，重悬至10mg/ml，即得所述gfap抗体磁微粒偶联物；所述缓冲液4，由以下组分组成：na2b4o7·10h2o7.0g/l；ph为9.0-11.0；所述缓冲液5，由以下组分组成：k2hpo4470g/l；ph为9.0-11.0；所述缓冲液6，由以下组分组成：tris7.5g/l、nacl9.0g/l、牛血清白蛋白3.0g/l、吐温205ml；ph为7.3-7.8。所述校准品1为20pg/ml的gfap重组蛋白溶液，所示标准品2为160pg/ml的gfap重组蛋白溶液，其制备方法为：将gfap重组蛋白溶解于缓冲液7中，混合均匀。所述质控品为浓度为40pg/ml的gfap重组蛋白溶液，其制备方法为：将gfap重组蛋白溶解于缓冲液7中，混合均匀。所述缓冲液7，由以下组分组成：tris12.0g/l、牛血清白蛋白5.0g/l、甘氨酸1.0g/l；ph为7.6-8.8。实施例2一种定量检测gfap的试剂盒由检测试剂条、校准品、质控品和二维码组成(如表2所示)，其中，检测试剂条由一系列溶液和附件组成一个整体，可以独立检测一个样本；校准品由两个浓度的gfap抗原和缓冲液配制而成，用于校准标准曲线；质控品由gfap抗原和缓冲液配制而成；二维码中录入了当批次的标准曲线。表2试剂盒的组分表试剂盒主要组分装量检测试剂条10条质控品200μl×1校准品1200μl×1校准品2200μl×1盒签二维码1个所述检测试剂条包括试剂a、试剂b、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套和吸头组成，其中，试剂a为含一定浓度碱性磷酸酶标记的gfap抗体溶液；试剂b为含一定浓度磁微粒标记的gfap抗体溶液；清洗液用于反应过程的清洗；发光底物为alp催化的发光底物；测读孔用于最终的检测读值；所述试剂a的制备方法为：将酶标gfap抗体偶联物溶解于缓冲液8中，混合均匀；所述缓冲液8，由以下组分组成：na2hpo4·12h2o5.9g/l、nacl9.0g/l和牛血清白蛋白50g/l，ph为7.0-7.6。所述酶标gfap抗体偶联物的制备方法为：包括以下步骤：b1、抗体的活化：b1.1活化步骤：称取4-8mg2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-it)，用缓冲液1溶解至13.76mg/ml，按2-it与抗体摩尔比30:1的比例将2it溶液加入抗体溶液中进行活化(即：1mg抗体加入20μl的2it溶液)，震荡混匀后在室温下反应30分钟，得到活化抗体预产物；b1.2终止活化步骤：按1mg抗体加入20μl缓冲液2的比例将缓冲液2加入活化抗体预产物溶液中，室温反应10min，使用pd10脱盐柱除去过量的2it，收集活化后的抗体，得到活化抗体，将活化抗体加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1-4mg/ml之间，得到浓缩的活化抗体；b2、碱性磷酸酶(alp)的活化b2.1活化步骤：称取2-4mg(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)，用二甲基甲酰胺(dmf)溶解至6.69mg/ml，按smcc与alp摩尔比60:1的比例，在alp溶液中加入smcc溶液(即：1mgalp加入34.5μlsmcc溶液)，震荡混匀后室温下反应30分钟，得到碱性磷酸酶(alp)活化预产物；b2.2终止活化步骤：按1mgalp加入50μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入alp溶液中，室温反应10min，使用pd10脱盐柱除去过量的smcc，收集活化后的alp，得到活化alp，将活化后的alp加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1-4mg/ml之间，得到浓缩的活化alp；b3、活化抗体和活化alp的连接将步骤b1.2中得到的浓缩的活化抗体与步骤b2.2中得到的浓缩的活化alp按质量比1:1的比例混合(即：1.0mg抗体加入1.0mgalp)，震荡混匀后，将混合物在8℃环境中反应12小时，即得到抗体偶联物预产物；b4、抗体偶联物的终止和纯化称取1-10mg马来酰亚胺，用dmf溶解至9.7mg/ml，按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/ml马来酰亚胺溶液；按1mg抗体加入10μl0.97mg/ml马来酰亚胺溶液比例加入马来酰亚胺溶液，在室温下反应15分钟；取6μl乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mm，即在6μl乙醇胺加入994μl缓冲液1，按1mg抗体加入50μl100mm乙醇胺溶液的比例加入乙醇胺溶液，震荡混匀；使用超滤浓缩管将待纯化的抗体偶联物浓缩至0.5-2mg/ml；使用纯化蛋白分析仪和superdex200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2，纯化后得到酶标抗体偶联物；所述缓冲液1，由以下组分组成：乙醇胺15.1g/l和nacl6.0g/l，ph为7.3-7.6；所述缓冲液2，由以下组分组成：甘氨酸75g/l；所述试剂b的制备方法为：将gfap抗体磁微粒偶联物溶解于缓冲液9中，混合均匀；所述缓冲液9，由以下组分组成：na2hpo4·12h2o5.9g/l、nah2po40.60g/l、nacl9.0g/l、牛血清白蛋白50g/l、蔗糖140g/l、纤维素盐或纤维素衍生物5.0g/l、明胶5.0g/l；ph为6.2-8.0。所述gfap抗体磁微粒偶联物的制备方法，包括以下步骤：a1、将磁微粒用缓冲液4清洗后，重悬至5mg/ml，得到磁微粒溶液；按磁微粒与抗体质量比100:10的比例，向磁微粒溶液中加入gfap抗体，得到混合液1；a2、按缓冲液4与磁微粒体积质量比100:10的比例，向混合液1中加入缓冲液4，室温反应10min，得到混合液2，按缓冲液5与磁微粒体积质量比100:10的比例，向混合物2中加入缓冲液5，37℃反应24小时，得到磁微粒偶联物；a3、用缓冲液6清洗磁微粒偶联物，重悬至5mg/ml，37℃反应24小时，用缓冲液8清洗磁微粒偶联物，重悬至10mg/ml，即得所述gfap抗体磁微粒偶联物；所述缓冲液4，由以下组分组成：na2b4o7·10h2o10.0g/l；ph为9.0-11.0；所述缓冲液5，由以下组分组成：k2hpo4530g/l；ph为9.0-11.0；所述缓冲液6，由以下组分组成：tris8.0g/l、nacl9.0g/l、牛血清白蛋白10g/l、吐温2020ml；ph为7.3-7.8。所述校准品1为20pg/ml的gfap重组蛋白溶液，所示标准品2为160pg/ml的gfap重组蛋白溶液，其制备方法为：将gfap重组蛋白溶解于缓冲液7中，混合均匀。所述质控品为浓度为40pg/ml的gfap重组蛋白溶液，其制备方法为：将gfap重组蛋白溶解于缓冲液7中，混合均匀。所述缓冲液7，由以下组分组成：tris15.0g/l、牛血清白蛋白50g/l、甘氨酸30g/l；ph为7.6-8.8。实施例3一种定量检测gfap的试剂盒由检测试剂条、校准品、质控品和二维码组成(如表3所示)，其中，检测试剂条由一系列溶液和附件组成一个整体，可以独立检测一个样本；校准品由两个浓度的gfap抗原和缓冲液配制而成，用于校准标准曲线；质控品由gfap抗原和缓冲液配制而成；二维码中录入了当批次的标准曲线。表3试剂盒的组分表所述检测试剂条包括试剂a、试剂b、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套和吸头组成，其中，试剂a为含一定浓度碱性磷酸酶标记的gfap抗体溶液；试剂b为含一定浓度磁微粒标记的gfap抗体溶液；清洗液用于反应过程的清洗；发光底物为alp催化的发光底物；测读孔用于最终的检测读值；所述试剂a的制备方法为：将酶标gfap抗体偶联物溶解于缓冲液8中，混合均匀；所述缓冲液8，由以下组分组成：na2hpo4·12h2o5.7g/l、nacl9.0g/l和牛血清白蛋白25.5g/l，ph为7.0-7.6。所述酶标gfap抗体偶联物的制备方法为：包括以下步骤：b1、抗体的活化：b1.1活化步骤：称取4-8mg2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-it)，用缓冲液1溶解至13.76mg/ml，按2-it与抗体摩尔比22.5:1的比例将2it溶液加入抗体溶液中进行活化(即：1mg抗体加入15μl的2it溶液)，震荡混匀后在室温下反应30分钟，得到活化抗体预产物；b1.2终止活化步骤：按1mg抗体加入12.5μl缓冲液2的比例将缓冲液2加入活化抗体预产物溶液中，室温反应10min，使用pd10脱盐柱除去过量的2it，收集活化后的抗体，得到活化抗体，将活化抗体加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1-4mg/ml之间，得到浓缩的活化抗体；b2、碱性磷酸酶(alp)的活化b2.1活化步骤：称取2-4mg(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)，用二甲基甲酰胺(dmf)溶解至6.69mg/ml，按smcc与alp摩尔比37.5:1的比例，在alp溶液中加入smcc溶液(即：1mgalp加入21.5μlsmcc溶液)，震荡混匀后室温下反应30分钟，得到碱性磷酸酶(alp)活化预产物；b2.2终止活化步骤：按1mgalp加入30μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入alp溶液中，室温反应10min，使用pd10脱盐柱除去过量的smcc，收集活化后的alp，得到活化alp，将活化后的alp加入超滤浓缩管进行高速低温浓缩，使其终浓度在1-4mg/ml之间，得到浓缩的活化alp；b3、活化抗体和活化alp的连接将步骤b1.2中得到的浓缩的活化抗体与步骤b2.2中得到的浓缩的活化alp按质量比1:1.5的比例混合(即：1.0mg抗体加入1.50mgalp)，震荡混匀后，将混合物在6℃环境中反应15小时，即得到抗体偶联物预产物；b4、抗体偶联物的终止和纯化称取1-10mg马来酰亚胺，用dmf溶解至9.7mg/ml，按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/ml马来酰亚胺溶液；按1mg抗体加入10μl0.97mg/ml马来酰亚胺溶液比例加入马来酰亚胺溶液，在室温下反应15分钟；取6μl乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mm，即在6μl乙醇胺加入994μl缓冲液1，按1mg抗体加入30μl100mm乙醇胺溶液的比例加入乙醇胺溶液，震荡混匀；使用超滤浓缩管将待纯化的抗体偶联物浓缩至0.5-2mg/ml；使用纯化蛋白分析仪和superdex200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2，纯化后得到酶标抗体偶联物；所述缓冲液1，由以下组分组成：乙醇胺14.9g/l和nacl5.9g/l，ph为7.3-7.6；所述缓冲液2，由以下组分组成：甘氨酸75g/l；所述试剂b的制备方法为：将gfap抗体磁微粒偶联物溶解于缓冲液9中，混合均匀；所述缓冲液9，由以下组分组成：na2hpo4·12h2o5.8g/l、nah2po40.58g/l、nacl9.0g/l、牛血清白蛋白34.5g/l、蔗糖110g/l、纤维素盐或纤维素衍生物3.0g/l、明胶27.5g/l；ph为6.2-8.0。所述gfap抗体磁微粒偶联物的制备方法，包括以下步骤：a1、将磁微粒用缓冲液4清洗后，重悬至5mg/ml，得到磁微粒溶液；按磁微粒与抗体质量比100:5的比例，向磁微粒溶液中加入gfap抗体，得到混合液1；a2、按缓冲液4与磁微粒体积质量比100:5的比例，向混合液1中加入缓冲液4，室温反应10min，得到混合液2，按缓冲液5与磁微粒体积质量比100:5的比例，向混合物2中加入缓冲液5，37℃反应20小时，得到磁微粒偶联物；a3、用缓冲液6清洗磁微粒偶联物，重悬至5mg/ml，37℃反应20小时，用缓冲液8清洗磁微粒偶联物，重悬至10mg/ml，即得所述gfap抗体磁微粒偶联物；所述缓冲液4，由以下组分组成：na2b4o7·10h2o8.5g/l；ph为9.0-11.0；所述缓冲液5，由以下组分组成：k2hpo4500g/l；ph为9.0-11.0；所述缓冲液6，由以下组分组成：tris7.8g/l、nacl9.0g/l、牛血清白蛋白6.5g/l、吐温2012.5ml；ph为7.3-7.8。所述校准品1为20pg/ml的gfap重组蛋白溶液，所示标准品2为160pg/ml的gfap重组蛋白溶液，其制备方法为：将gfap重组蛋白溶解于缓冲液7中，混合均匀。所述质控品为浓度为40pg/ml的gfap重组蛋白溶液，其制备方法为：将gfap重组蛋白溶解于缓冲液7中，混合均匀。所述缓冲液7，由以下组分组成：tris13.5g/l、牛血清白蛋白27.5g/l、甘氨酸15.5g/l；ph为7.6-8.8。对比例1本对比例与实施例3的区别在于，试剂b的制备过程中，采用的缓冲液9，由以下组分组成：na2hpo4·12h2o4.5g/l、nah2po40.5g/l、nacl4.0g/l、牛血清白蛋白100g/l、蔗糖70g/l、纤维素盐或纤维素衍生物8.0g/l、明胶22g/l和卡拉胶8g/l；ph为6.2-8.0。对比例2本对比例与实施例3的区别在于，试剂b的制备过程中，采用的缓冲液9，由以下组分组成：na2hpo4·12h2o6.5g/l、nah2po40.64g/l、nacl7.0g/l、牛血清白蛋白60g/l、蔗糖150g/l、纤维素盐或纤维素衍生物1g/l、明胶4g/l；ph为6.2-8.0。对比例3本对比例与实施例3的区别在于，试剂b的制备过程中，采用的缓冲液9，由以下组分组成：na2hpo4·12h2o5.0g/l、nah2po40.5g/l、nacl8.0g/l、牛血清白蛋白1g/l、蔗糖40g/l、纤维素盐或纤维素衍生物6g/l、明胶60g/l；ph为6.2-8.0。对比例4本对比例与实施例3的区别在于，试剂b采用的原料gfap抗体磁微粒偶联物的制备方法，包括以下步骤：a1、将磁微粒用缓冲液4清洗后，重悬至5mg/ml，得到磁微粒溶液；按磁微粒与抗体质量比100:5的比例，向磁微粒溶液中加入gfap抗体，得到混合液1；a2、按缓冲液4与磁微粒体积质量比100:5的比例，向混合液1中加入缓冲液4，室温反应10min，得到混合液2，按缓冲液5与磁微粒体积质量比100:5的比例，向混合物2中加入缓冲液5，37℃反应20小时，得到磁微粒偶联物；a3、用缓冲液6清洗磁微粒偶联物，重悬至5mg/ml，37℃反应20小时，用缓冲液8清洗磁微粒偶联物，重悬至10mg/ml，即得所述gfap抗体磁微粒偶联物；所述缓冲液4，由以下组分组成：na2b4o7·10h2o12g/l；ph为9.0-11.0；所述缓冲液5，由以下组分组成：k2hpo4450g/l；ph为9.0-11.0；所述缓冲液6，由以下组分组成：tris6g/l、nacl6.0g/l、牛血清白蛋白20g/l、吐温2015ml；ph为7.3-7.8。实施例4一种定量检测gfap的试剂盒的检测方法，采用北京美联泰科生物技术有限公司的全自动化学发光免疫分析仪进行检测，包括以下步骤：s1、免疫反应：将30ul样本、50ul试剂b、50ul试剂a依次加入反应孔位中，在37℃条件下反应20min；s2、磁分离及清洗：在清洗孔位m1加入300μl清洗液，将含磁微粒的混合物用磁力吸出反应孔位，在清洗孔位m1脱磁；清洗2min后，在清洗孔位m2、清洗孔位m3分别进行1次磁分离及清洗；s3、读值：在测读孔加入150ul发光底物，将含磁微粒的混合物用磁力吸出清洗孔位m3，在测读孔脱磁，碱性磷酸酶催化的发光底物发光后检测相对发光强度(rlu)；s4、根据检测的校准品数值，获得一条gfap浓度-发光值标准曲线，所述标准曲线使用四参数logistic方程拟合；s5、样本的检测值与标准曲线上的浓度值对应，从而实现对样本的浓度检测。实施例5试剂盒性能分析按照实施例4的检测方法对实施例1-3和对比例1-4制备的定量检测gfap的试剂盒进行检测，对试剂盒的准确度、检出限、线性、重复性和校准品和质控品瓶间差等指标进行分析。(1)准确度实验要求：将已知浓度的胶质纤维酸性蛋白(gfap)加入到低值样本中，其回收率应在[85,115]％范围内；实验方法：将浓度为800pg/ml(允许偏差±10％)的胶质纤维酸性蛋白(gfap)液(a)加入到浓度为0pg/ml～20pg/ml的样本b中，所加入胶质纤维酸性蛋白抗原与样本b之间的体积比例为1:9，根据公式(1)计算回收率r，检测结果如表4所示。式中：r—回收率；v—样品a液的体积；v0—血清样品b液的体积；c—血清样品b液加入a液后的3次测量平均值；c0—血清样品b液的3次测量平均值；cs—样品a液的浓度。表4试剂盒回收率％实施例189.22实施例2110.08实施例3102.45由上表可见，本发明实施例1-3制备的试剂盒回收率在[85,115]％范围内，符合要求。(2)空白限实验要求：≤10pg/ml。实验方法：将零浓度校准品作为样本，重复测试20次，得到20次测试结果的rlu值(相对发光值)，计算其平均值和标准差(sd)。根据试剂盒所用校准品的定标曲线方程，将平均值所对应的rlu值代入上述方程中，求出对应的浓度值，即为空白限，结果如表5所示。表5由上表可见，本发明实施例1-3制备的试剂盒的空白限不高于10pg/ml，符合要求。(3)检出限实验要求：检出限不高于15pg/ml。实验方法：将200pg/ml的样本分别稀释8、10、12、14、16倍。对5份浓度近似lod的低值样本进行检测，每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，如果低于生产企业提供的空白限数值的检测结果的数量应小于或等于3个，即可认为空白限(10pg/ml)和检出限的设置基本合理，检测结果如表6所示。表6实例低于空白限(10pg/ml)数量实施例11实施例21实施例30有上表可知，本发明实施例1-3的试剂盒，低于生产企业提供的空白限数值的检测结果的数量为0或1，检出限设置合理，符合要求。(4)线性区间实验要求：在[0.015,25]ng/ml的线性范围内，相关系数r应≥0.990。实验方法：将接近线性范围上限的高值样本(25ng/ml)与零浓度样本混合成6个稀释浓度，理论浓度分别为25ng/ml、5ng/ml、1ng/ml、0.2ng/ml、0.02ng/ml、0ng/ml。对每一浓度的样本各重复测试3次得到浓度值，记录各样品的测量结果，并计算各样品3次测量值的平均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(2)计算线性回归的相关系数(r)，结果如表7所示。式中：r———相关系数；xi———稀释比例；yi———各个样本测定结果均值；———稀释比例的均值；———样本测定结果总均值。表7试剂盒相关系数r实施例10.9993实施例20.9995实施例30.9998对比例10.7134对比例20.8553对比例30.8216对比例40.8886由上表可知，实施例1-3的试剂盒的线性相关系数(r)实验结果不低于0.9900，因此可以定义实施例1-3的试剂盒的线性范围为[0.015,25]ng/ml；而对比例1-4的试剂盒的线性相关系数(r)均低于0.9900，线性相关系数(r)实验结果低于0.9900，表明，当改变试剂b磁微粒标记的gfap抗体溶液的缓冲液9的组分、用量以及原料gfap抗体磁微粒偶联物的制备方法对试剂盒的线性关系产生影响，导致线性关系变差。(5)重复性实验要求：对高浓度样本和低浓度样本各测试10次，cv≤10％。实验方法：同批号试剂盒重复测试高浓度样本(4-6ng/ml)、低浓度样本(0.18-0.22ng/ml)各10次，计算10次测试结果的平均值和标准差sd。按公式(3)计算变异系数(cv)，结果如表8所示。式中：sd——样本测试值的标准差；——样本测试值的平均值。表8由上表可知，本发明实施例1-3的试剂盒的重复性不高于10％，而对比例1-4的试剂盒的重复性大于10％，表明，当改变试剂b磁微粒标记的gfap抗体溶液的缓冲液9的组分、用量以及原料gfap抗体磁微粒偶联物的制备方法导致试剂盒的重复性和稳定性变差。(6)校准品和质控品瓶间差实验要求：校准品和质控品瓶间差cv＜10％。实验方法：检测同一批号10瓶校准品(或质控品)各1次，按公式(4)计算，测定结果的均值与标准差(sd1)。另取上述10瓶校准品(或质控品)中的1瓶连续测定5次，计算结果的均值和标准差(sd2)，按照公式(5)、(7)计算瓶间重复性cv％，测量结果如表9所示。说明：当sd1<sd2时，令cv瓶间＝0式中：sd——标准差。表9由上表可知，实施例1-3的试剂盒检测校准品和质控品瓶间差cv均＜10％，符合要求，而对比例1-4的试剂盒的校准品和质控品瓶间差cv均大于等于10％，不符合要求。磁微粒是有一定质量的颗粒，成分主要为fe0及fe2o3，其直径在1-4微米之间且不溶于水，磁微粒抗体偶联物由于连接了蛋白具有一定的亲水性，在重力作用下，磁微粒抗体偶联物会在水介质中快速下沉，在一定时间后，甚至会板结，板结后再次混匀的难度很大，从而影响了试剂盒的检测结果。本发明改进了磁微粒发光法中磁微粒载体的缓冲体系(缓冲液9)，使其具有如下优点：(1)磁微粒抗体偶联物在在常温环境下7天内不会出现肉眼可见的下沉；(2)试剂b在常温环境下保持很好的流动性，在仪器进行吸取操作时时不会影响吸取量，在混匀时，溶液不会出现挂壁残留；(3)试剂b在2-8℃的环境下可以变为凝胶状，6个月内可以保持磁微粒抗体偶联物的悬浮性；(4)在第13个月进行试验，虽然磁微粒抗体偶联物已经完全沉降，但极易混匀。如表10所示，本发明实施例1-3的试剂盒在第14个月的重复性结果cv小于8％、与第0月的准确度结果偏差的绝对值不超过10％。而对比例1-4组在第14个月的结果的重复性结果cv大于30％、与第0月的准确度结果偏差的绝对值超过50％，其中，与0月偏差的计算公式为：(第14月回收率值-第0月回收率值)×100/第0月回收率值。表10综上所述，本发明的定量检测gfap的试剂盒改善了磁微粒抗体偶联物的流动性和沉降性能，提高了检测的准确度和重复性，稳定性好，同时，检出限低，线性关系好，符合行业标准。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种磁微粒标记的gfap抗体溶液，其特征在于，由gfap抗体磁微粒偶联物和缓冲液9组成；
所述缓冲液9，由以下组分组成：na2hpo4·12h2o5.6-5.9g/l、nah2po40.55-0.60g/l、nacl9.0g/l、牛血清白蛋白1.0-50g/l、蔗糖80.0-140g/l、纤维素盐或纤维素衍生物1.0-5.0g/l、明胶5.0-50g/l；ph为6.2-8.0。
2.根据权利要求1所述的磁微粒标记的gfap抗体溶液，其特征在于，所述gfap抗体磁微粒偶联物的制备方法为：
(1)将磁微粒用缓冲液4清洗后，重悬至5mg/ml，得到磁微粒溶液；按磁微粒与抗体质量比100:1-100:10的比例，向磁微粒溶液中加入gfap抗体，得到混合液1；
(2)按缓冲液4与磁微粒体积质量比100:1-10的比例，向混合液1中加入缓冲液4，室温反应10min，得到混合液2，按缓冲液5与磁微粒体积质量比100:1-10的比例，向混合物2中加入缓冲液5，37℃反应16-24小时，得到磁微粒偶联物；
(3)用缓冲液6清洗磁微粒偶联物，重悬至5mg/ml，37℃反应16-24小时，用缓冲液8清洗磁微粒偶联物，重悬至10mg/ml，即得所述gfap抗体磁微粒偶联物。
3.根据权利要求2所述的磁微粒标记的gfap抗体溶液，其特征在于，步骤(1)中所述磁微粒为甲苯磺酰基磁珠。
4.根据权利要求2所述的磁微粒标记的gfap抗体溶液，其特征在于，步骤(1)中所述缓冲液4，由以下组分组成：na2b4o7·10h2o7-10g/l，ph为9.0-11.0。
5.根据权利要求2所述的磁微粒标记的gfap抗体溶液，其特征在于，步骤(2)中所述缓冲液5，由以下组分组成：k2hpo4470-530g/l；ph为9.0-11.0。
6.根据权利要求2所述的磁微粒标记的gfap抗体溶液，其特征在于，步骤(3)中所述缓冲液6，由以下组分组成：tris7.5-8.0g/l、nacl9.0g/l、牛血清白蛋白3.0-10.0g/l和吐温205-20ml；ph为7.3-7.8。
7.根据权利要求2所述的磁微粒标记的gfap抗体溶液，其特征在于，步骤(3)中所述缓冲液8，由以下组分组成：na2hpo4·12h2o5.6-5.9g/l、nah2po40.55-0.60g/l、nacl9.0g/l和牛血清白蛋白1.0-50g/l；ph为7.0-7.6。
8.一种检测试剂条，其特征在于，包括权利要求1-7任一项所述的磁微粒标记的gfap抗体溶液。
9.一种定量检测gfap的试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述的检测试剂条。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，由检测试剂条、校准品、质控品和二维码组成，其中，检测试剂条由一系列溶液和附件组成一个整体，用于独立检测样本；校准品由两个浓度的gfap抗原和缓冲液配制而成，用于校准标准曲线；质控品由gfap抗原和缓冲液配制而成；二维码中录入了当批次的标准曲线；
所述检测试剂条包括试剂a、试剂b、清洗液和发光底物，其中，试剂a为碱性磷酸酶标记的gfap抗体溶液；试剂b为磁微粒标记的gfap抗体溶液；清洗液用于反应过程的清洗；所述发光底物为alp催化的发光底物。
技术总结本发明公开了一种定量检测GFAP的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括磁微粒标记的GFAP抗体溶液，所述缓冲液由以下组分组成：Na2HPO4·12H2O 5.6‑5.9g/L、NaH2PO4 0.55‑0.60g/L、NaCl 9.0g/L、牛血清白蛋白1.0‑50g/L、蔗糖80.0‑140g/L、纤维素盐或纤维素衍生物1.0‑5.0g/L、明胶5.0‑50g/L；pH为6.2‑8.0。本发明通过改进磁微粒发光法中的磁微粒载体的缓冲体系，改善了磁微粒抗体偶联物的流动性和沉降性能，提高了试剂盒的准确度和重复性，稳定性好，同时，检出限低，线性关系好，符合行业标准。
技术研发人员：刘聪;郑兴华;李博飞;冯玉静
受保护的技术使用者：北京美联泰科生物技术有限公司
技术研发日：2020.11.16
技术公布日：2021.03.12
