本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种测定补体c1q的试剂盒。
背景技术：
补体c1q是由一群存在于血液、体液及细胞膜表面上具有酶活性的异源六聚体组成的糖蛋白，是补体经典途径第一补体成分c1的一个亚基，作为补体经典激活途径的启动蛋白，识别并结合免疫复合物而启动激活的途径，具有调节各种免疫细胞反应的能力。可作为系统性红斑狼疮(sle)诊断及狼疮肾炎(ln)活动性预测的指标，在与类风湿性关节炎、肾脏疾病、肾移植排斥反应、动脉粥样硬化以及混合性结缔组织病等疾病的诊断中也发挥了重要作用。
目前补体c1q的检测手段主要为火箭免疫电泳(rie)、酶联免疫法(elisa)以及免疫比浊法(tia)，但目前业界尚无公认的标准。rie对于血清中c1q的检测具有重要的指导意义，但是由于其重复性不好，耗时较长，手工操作，目前无专门商业化的设备，在临床实验室很少用到这个方法。elisa需要的手工操作、耗时较长，在临床上尚未大规模使用。
目前一般使用普通比浊法检测血清中c1q的含量。普通比浊法一般直接使用抗血清制备r2试剂，但抗血清中存在大量非特异性蛋白，在促凝剂的存在下，r2试剂会产生明显白色沉淀，这种情况在羊抗c1q血清上尤其严重。解决这个问题的传统方法是长久放置r2试剂后过滤沉淀取上清液，或使用经蛋白g凝胶柱纯化的抗体制作r2试剂。前者处理时间长，特别是针对羊抗c1q血清效果不好，滤液仍会有沉淀析出；后者效果较明显，但会明显增加试剂成本。
技术实现要素：
本发明提供一种测定补体c1q的试剂盒，通过在试剂r2中添加少量的重组链球菌蛋白g，明显加速了c1q抗血清中杂蛋白的沉淀，缩短了试剂盒的制备时间，同时提升了试剂检测的精密度和稳定性。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术手段：一种测定补体c1q的试剂盒，包括试剂r1以及试剂r2，其特征在于，所述试剂r2中包括重组链球菌蛋白g。
优选地，所述试剂r2还包括缓冲液以及补体c1q抗血清。
优选地，所述重组链球菌蛋白g的含量为0.02-0.1g/l。
优选地，所述试剂r2还包括无机盐离子、加速剂以及防腐剂。
优选地，所述试剂r1包含缓冲液、表面活性剂、防腐剂、无机盐离子以及加速剂。
优选地，所述试剂r1包含30-50mmol/l缓冲液、10-20g/l表面活性剂、0.5-1.5g/l防腐剂、10-250mmol/l无机盐离子以及40-80g/l加速剂。
优选地，所述试剂r2包含30-50mmol/l的缓冲液、200-400mmol/l的无机盐离子、10-30g/l的加速剂、0.5-1.5g/l的防腐剂以及10-30g/l的补体c1q抗血清。
优选地，所述试剂r1中缓冲液选自tris或磷酸盐缓冲液中的至少一种；表面活性剂选自tritonx-100、brij58或tween-80中的至少一种；所述防腐剂选自proclin-300、叠氮钠或庆大霉素中的至少一种；所述无机盐离子选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述加速剂选自葡聚糖、peg6000、peg8000中的至少一种。
优选地，所述试剂r2中的缓冲液选自tris或磷酸盐缓冲液中的一种；所述无机盐离子选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述加速剂选自葡聚糖、peg6000或peg8000中的至少一种；所述防腐剂选自proclin-300、叠氮钠或庆大霉素中的至少一种。
重组链球菌蛋白g作为促凝剂用于制备测定补体c1q的试剂盒中的用途。本发明的有益效果在于：
本发明通过在血清补体c1q检测试剂盒试剂r2中添加少量的重组链球菌蛋白g，从而达到了能在不影响抗原抗体反应特应性的情况下，明显加速c1q抗血清中杂蛋白的沉淀，显著缩短了试剂盒生产阶段的处理时间，在保证试剂盒检测准确性和精密度的基础上显著提高了生产效率，降低了生产成本。
附图说明
图1为根据本发明实施例3所提供的c1q标准品浓度与测定值的标准曲线图；
图2为根据本发明实施例4所提供的试剂r2中重组链球菌蛋白g添加量与空白组线性关系图；
图3为根据本发明实施例5所提供的试剂r2孵育时间与空白组线性关系图。
具体实施例
本文包括以下的实施例，用于以例证的方式更清楚、明确地阐述本发明的技术方案。本领域技术人员根据本文的公开应当理解，可以在所公开的特定的实施方式中进行许多改变但是仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的思想和范围。本发明的具体实施方式仅用于解释本发明，而非意图通过任何方式限制本发明。
实施例1c1q检测试剂盒的制备
本发明的测定血清补体c1q的试剂盒包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分。
1.试剂r1的制备
按照下述配方进行配置，充分搅拌混匀后，放于2-8℃保存。
试剂r1：
其余溶剂为纯化水
2.试剂r2的制备
按照下述配方进行配置，充分搅拌混匀后，放于2-8℃保存。
试剂r2
其余溶剂为纯化水
实施例2试剂盒的使用方法
(1)将待测的血清样本与试剂r1以及试剂r2混合，搅拌混匀，使其充分反应；
(2)用全自动生化分析仪(日立7180)测定反应后的吸光度差值(主波长340nm，副波长700nm，仪器读点16-34)；
(3)根据吸光度变化值计算出样本中补体c1q的浓度。
其中，本发明的检测原理是：血清样品中补体c1q可与试剂中的抗c1q抗体结合形成抗原-抗体复合物，产生一定浊度，该浊度高低在一定抗体存在时与抗原的含量成正比，在一定波长下测定浊度并通过多点定标曲线可进行补体c1q的定量测定。
样本中补体c1q(mg/l)＝cs×δat/δas(mg/l)
(式中：δat以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值，δas以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值，cs校准液中补体c1q的浓度)
实施例3试剂盒性能测试
将实施例1制备的血清补体c1q检测试剂盒按照实施例2所述的使用方法进行性能测试。
(1)c1q标准品的检测结果
使用实施例1中制备得到的试剂盒检测不同浓度c1q标准品(取七个不同浓度，分别为30mg/l、50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l每个浓度设3个重复)，通过全自动生化分析仪(日立7180)读取信号。检测结果如下表所示：
表1c1q标准品检测结果
以c1q标准品浓度为横坐标，测定的平均浓度为纵坐标，建立对数方程并拟合标准曲线，结果如附图1所示，结果显示，使用本发明试剂盒进行检测，检测结果线性较好，通过该标准曲线可对样品中c1q浓度进行定量分析。
(2)精密度
选取临床c1q低值样本、中值样本以及高值样本，采用实施例1中制备得到试剂盒以及实施例2中使用方法进行测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准差，计算变异系数进行重复性考察，检测结果如下表所示：
表2c1q检测试剂盒精密度
变异系数分别为1.15％、1.14％以及1.34％，同时，以(均值/标准值-1)×100％计算相对偏差进行准确度考察，结果显示相对偏差分别为0.50％、0.50％以及0.73％，实验结果说明采用本实施例所述的制备方案得到的试剂盒具有较好的精密度和重复性。
(3)稳定性
取c1q检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验，2-8℃放置分别按时间2，4，6，8，9，10，11，12，13，14个月进行检测；开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、32天进行测定。结果显示c1q检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为12个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为30天。
(4)抗干扰性
配置浓度为200mg/l的c1q标准品，向其中分别加入不同含量的干扰物，随后使用实施例1制备得到的检测试剂盒，并采用实施例1的使用方法对所述样本进行检测，每组样本重复检测3次，计算均值，同时以(均值/标准值-1)×100％计算相对偏差进行准确度考察。检测结果如下表所示：
表3c1q检测试剂盒抗干扰性
结果显示，当在c1q标准品中分别加入干扰物质：胆红素、溶血血红蛋白以及乳糜时，测定浓度与理论浓度的相对偏差分别为3.18％、1.78％以及1.31％，均小于5％，结果表明干扰物对该反应体系基本无影响，本发明制备得到的试剂盒具有较好的抗干扰性。
实施例4重组链球菌g添加量对试剂盒性能的影响
本实施例共设置六组实验，其中每组实验中所用试剂盒除试剂r2中重组链球菌g的含量与实施例1不相同，试剂盒的其余制备方法均与实施例1相同。具体情况如下表：
表4
向5ml试剂r2中分别添加0mg、0.1mg、0.5mg、2.5mg、12.5mg重组链球菌蛋白g，随后4℃孵育24h，检测所述五组实验中杂质蛋白的沉淀量以及检测结果的精密度。
(1)试剂r2中添加重组链球菌g对杂质蛋白沉淀量的影响
实验结果显示，试剂r2中随着重组链球菌蛋白g含量的升高，白色沉淀量显著提高。测得沉淀干重如下表所示：
表5重组链球菌蛋白g添加量对杂质蛋白沉淀量的影响
(2)试剂r2中添加重组链球菌g对检测结果的影响
在本实施例中，为验证重组链球菌蛋白g的添加量是否影响抗原抗体的特异性反应(即检测结果的准确性)，选取22例临床定值样本，使用上述5种试剂盒进行检测，选用医院测值由小到大的22例新鲜样本考察与空白组的相关性。
使用全自动生化分析仪(日立7180)进行空白定标后，使用上述5种试剂盒检测样本的反应度，实验结果如下表所示：
表6样本检测反应度
注：使用日立7180检测22例新鲜样本反应度：空白定标(k值修改为10000)，校准类型为linear。
将上述4种试剂盒检测结果与空白组试剂盒检测结果比对并进行相关性作图(如附图2所示)，其中a组与空白组的相关性r2为0.9866，b组r2为0.9751，c组r2为0.4428，d组r2为0.3097。实验结果说明，在试剂r2中添加少量重组链球菌蛋白g(如a组)，不会明显影响抗原抗体的特异性反应，同时可以加速杂质蛋白的沉淀；但过量的重组链球菌蛋白g的加入(如c组以及d组)会结合目标蛋白，导致与空白组检测结果的相关性明显降低；而在试剂r2中加入0.1g/l的重组链球菌蛋白g(b组)时，不会影响抗原抗体的特异性反应，同时其蛋白沉淀量为空白组(传统方法)的近7倍。
实施例5试剂r2中添加重组链球菌g后孵育时间对试剂盒性能的影响
本实施例共设置五组实验，其中空白组所用试剂盒除试剂r2中重组链球菌g蛋白的添加量与实施例1不相同，组a-d所用试剂盒除试剂r2的孵育时间与实施例1不相同，试剂盒的其余制备方法均与实施例1相同。具体情况如下表：
表7
空白组：向5ml试剂r2中添加0g/l的重组链球菌蛋白g，4℃孵育24h；组a-d：向5ml试剂r2中分别添加0.1g/l的重组链球菌蛋白g，随后4℃孵育，其中a组孵育2h、b组孵育5h、c组孵育10h、d组孵育20h，检测所述五组实验中杂质蛋白的沉淀量以及检测结果的精密度。
(1)不同孵育时间对杂质蛋白沉淀量的影响
实验结果显示，当试剂r2中添加0.1g/l重组链球菌蛋白g后，随着孵育时间的增加，沉淀量也随之增加，在孵育5h后，沉淀量的增加速度放缓。测得沉淀干重如下表所示：
表8孵育时间对杂质蛋白沉淀量的影响
(2)不同孵育时间对检测结果的影响
在本实施例中，为验证添加少量重组链球菌蛋白g后，不同孵育时间是否影响抗原抗体的特异性反应(即检测结果的准确性)，选用医院测值由小到大的22例新鲜样本考察与空白组的相关性。
使用全自动生化分析仪(日立7180)进行空白定标后，使用上述5种试剂盒检测样本的反应度，实验结果如下表所示：
表9样本检测反应度
注：使用日立7180检测22例新鲜样本反应度：空白定标(k值修改为10000)，校准类型为linear。
将上述4种试剂盒检测结果与空白组试剂盒检测结果比对并进行相关性作图(如附图3所示)，其中a组与空白组的相关性r2为0.9879，b组r2为0.9857，c组r2为0.9898，d组r2为0.9724。实验结果说明，在试剂r2中添加少量重组链球菌蛋白g，孵育时间的长短不会影响抗原抗体的特异性反应，同时在孵育时长为5h时(如a组)，白色沉淀量为9.7mg，是空白组(传统方法)沉淀量的近7倍，而孵育时间大大缩短，实验结果说明在试剂r2中添加少量的重组链球菌蛋白g后，可以加速试剂r2中杂质蛋白的沉淀速度，显著缩短了生产阶段的处理时间，在保持试剂盒检测准确性和精密度的基础上显著提高了生产效率。
实施例4
本实施例中共设置4组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂r1中的表面活性剂种类不相同，其余试剂盒的制备方法均与实施例1相同。同时采用所述四种试剂盒进行检测，检测结果如下表所示：
表10
注：本实施例中a组试剂r1中的表面活性剂为15g/l的brij58；b组为15g/l的tetronic1307；c组为15g/l的tween-80；d组为15g/l的tween-20，其余组分以及制备工艺均与实施例1相同。
实验结果显示在试剂r1中采用上述4种表面活性剂，试剂盒的检测精密度都较高。
实施例5
本实施例中共设置5组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂r1中的表面活性剂tritonx-100浓度不相同，其余试剂盒的制备方法均与实施例1相同。同时采用所述五种试剂盒进行检测，检测结果如下表所示：
表11
注：本实施例中a组试剂r2中的表面活性剂为2g/l的tritonx-100；b组为5g/l的tritonx-100；c组为10g/l的tritonx-100；d组为20g/l的tritonx-100；e组为30g/l的tritonx-100，其余组分以及制备工艺均与实施例1相同。
实验结果表明，在试剂r1中表面活性剂tritonx-100的浓度范围为10-20g/l时，试剂盒的检测精密度加高。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
1.一种测定补体c1q的试剂盒，包括试剂r1以及试剂r2，其特征在于，所述试剂r2中包括重组链球菌蛋白g。
2.如权利要求1所述测定补体c1q的试剂盒，其特征在于，所述试剂r2还包括缓冲液以及补体c1q抗血清。
3.如权利要求2所述测定补体c1q的试剂盒，其特征在于，所述重组链球菌蛋白g的含量为0.02-0.1g/l。
4.如权利要求3任一权利要求所述测定补体c1q的试剂盒，其特征在于，所述试剂r2还包括无机盐离子、加速剂以及防腐剂。
5.如权利要求1-4任一权利要求所述测定补体c1q的试剂盒，其特征在于，所述试剂r1包含缓冲液、表面活性剂、防腐剂、无机盐离子以及加速剂。
6.根据权利要求5所述的一种测定补体c1q的试剂盒，其特征在于，所述试剂r1包含30-50mmol/l缓冲液、10-20g/l表面活性剂、0.5-1.5g/l防腐剂、10-250mmol/l无机盐离子以及40-80g/l加速剂。
7.根据权利要求5所述的一种测定补体c1q的试剂盒，其特征在于，所述试剂r2包含30-50mmol/l的缓冲液、200-400mmol/l的无机盐离子、10-30g/l的加速剂、0.5-1.5g/l的防腐剂以及10-30g/l的补体c1q抗血清。
8.根据权利要求6所述的一种测定补体c1q的试剂盒，其特征在于，所述试剂r1中缓冲液选自tris或磷酸盐缓冲液中的至少一种；表面活性剂选自tritonx-100、brij58或tween-80中的至少一种；所述防腐剂选自proclin-300、叠氮钠或庆大霉素中的至少一种；所述无机盐离子选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述加速剂选自葡聚糖、peg6000、peg8000中的至少一种。
9.根据权利要求7-8所述的一种测定补体c1q的试剂盒，其特征在于，所述试剂r2中的缓冲液选自tris或磷酸盐缓冲液中的一种；所述无机盐离子选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述加速剂选自葡聚糖、peg6000或peg8000中的至少一种；所述防腐剂选自proclin-300、叠氮钠或庆大霉素中的至少一种。
10.重组链球菌蛋白g作为促凝剂用于制备测定补体c1q的试剂盒中的用途。
技术总结