本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种测定糖化血红蛋白的液相层析试剂及其制备方法
背景技术：
：糖化血红蛋白hba1c是红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类相结合的产物。它是通过缓慢、持续及不可逆的糖化反应形成，其含量的多少取决于血糖浓度以及血糖与血红蛋白接触时间,与红细胞的生存有关，其合成速率与平均120d生命周期的红细胞糖化量成正比函数关系，在临床上，hba1c代表了人体在最近2-3月平均血糖水平的控制，且与抽血时间、患者是否空腹以及是否使用胰岛素等因素无关，因此hba1c是衡量血糖控制的金标准，也是诊断和管理糖尿病的重要手段。目前已知的测定糖化血红蛋白的方法有酶法、免疫法、硼酸亲和层析法、离子交换hplc法、毛细管电泳法。其中离子交换hplc法为ifcc指导的标准参考方法，具有精密度好、检测结果准确等优点，通常采用离子交换hplc法检测的精密度cv值小于3％，但其所需设备昂贵，检测成本高，同时其检测耗时较长。与之相对的是免疫层析法，因免疫层析操作简单，易于在基层医院开展，但由于其局限局层析材质的不均一，导致检测结果的精密度和准确性不佳，通常采用免疫层析法检测的精密度cv值小于15％，检测的准确度和精密度得不到保证。技术实现要素：本发明提供一种测定糖化血红蛋白的液相层析试剂及其制备方法，通过配置特殊的试剂r2，将示踪粒子标记抗体溶于试剂r2中，在待测样本前处理阶段就使其与示踪粒子标记抗体结合，同时通过配置试剂r1，在前处理阶段针对样本进行溶血处理，一方面简化了试纸条的制备工艺，另一方面提升了试纸条的特异性和稳定性，使检测精密度cv值低于3％。为了实现上述目的，本发明采用如下技术手段：一种测定糖化血红蛋白的液相层析试剂，其特征在于，包括：免疫层析试纸条、试剂r1以及试剂r2；所述试剂r1包含1-10g/l的溶血剂，所述溶血剂优选为sds；所述试剂r2包含0.05-0.2g/l示踪粒子标记抗人血红蛋白抗体。优选地，所述免疫层析试纸条包括：样品垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫，所述硝酸纤维素膜上靠近样品垫端设置有1条或多条检测线，所述检测线为抗人糖化血红蛋白抗体，所述硝酸纤维素膜上靠近吸水垫端设置有1条质控线，所述质控线为羊抗鼠抗体。优选地，所述试剂r1还包括20-100mmol/l的缓冲液、0.1-0.8g/l的防腐剂、50-100mmol/l的氯化钠以及以及15-30ml/l的表面活性剂。优选地，所述缓冲液选自mopso缓冲液、hepes缓冲液、tris缓冲液或磷酸盐缓冲液中的至少一种，所述防腐剂选自proclin-300或叠氮钠中的至少一种，所述表面活性剂选自tween-20、tween-80、曲拉通x100以及曲拉通x405中的至少一种。优选地，所述试剂r2还包括5-50mmol/l的缓冲液、2-10g/l的蛋白稳定剂、20-50g/l的保护剂、0.1-0.8g/l的防腐剂。优选地，所述试剂r2中缓冲液选自mopso缓冲液、hepes缓冲液、tris缓冲液或磷酸盐缓冲液中的至少一种，所述保护剂选自海藻糖或蔗糖中的至少一种，所述防腐剂选自proclin-300或叠氮钠中的至少一种，所述蛋白稳定剂选自酪蛋白钠及其水解产物、bsa、脱脂奶粉、鱼明胶或氨基酸中的至少一种。优选地，所述示踪粒子为彩色微球，优选为红色微球。一种测定糖化血红蛋白的液相层析试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)试剂r1的制备：按照1-10g/l的溶血剂、20-100mmol/l的缓冲液、0.1-0.8g/l的防腐剂、50-100mmol/l的氯化钠以及以及15-30ml/l的表面活性剂进行配置后搅拌混匀，所述溶血剂优选为sds，所述缓冲液选自mopso缓冲液、hepes缓冲液、tris缓冲液或磷酸盐缓冲液中的至少一种，所述防腐剂选自proclin-300或叠氮钠中的至少一种，所述表面活性剂选自tween-20、tween-80、曲拉通x100以及曲拉通x405中的至少一种；(2)试剂r2的制备：按照0.05-0.2g/l示踪粒子标记抗人血红蛋白抗体、5-50mmol/l的缓冲液、2-10g/l的蛋白稳定剂、20-50g/l的保护剂以及0.1-0.8g/l的防腐剂进行配置后搅拌混匀，所述示踪粒子优选为红色微球，所述缓冲液选自mopso缓冲液、hepes缓冲液、tris缓冲液或磷酸盐缓冲液中的至少一种，所述保护剂选自海藻糖或蔗糖中的至少一种，所述防腐剂选自proclin-300或叠氮钠中的至少一种，所述蛋白稳定剂选自酪蛋白钠及其水解产物、bsa、脱脂奶粉、鱼明胶或氨基酸中的至少一种；(3)硝酸纤维素膜的处理：将抗人糖化血红蛋白单克隆抗体用pbs缓冲液稀释后在硝酸纤维素膜靠近样品垫端划检测线；将羊抗鼠igg抗体在硝酸纤维素膜靠近吸水垫端划质控线，该线与检测线相互平行，干燥；(4)试纸条的组装：将硝酸纤维素膜搭接在底衬上，样品垫搭接在硝酸纤维素膜的一端，吸水垫搭接在硝酸纤维素膜的另一端，切条。上述试剂盒在检测糖化血红蛋白中的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待测样本加入试剂r1中，搅拌混匀；(2)将步骤(1)中的混合液与试剂r2混合，搅拌混匀；(3)滴加混合液到实施例1中制备得到的试纸条加样孔中；(4)用免疫定量分析仪检测；优选地，步骤(1)中所述待测样本与试剂r1的体积比为1:50-1:100之间，步骤(2)中混合液与试剂r2的体积比为10:1-50:1之间。本发明的有益效果在于：(1)本发明通过配置试剂r1，在样品前处理阶段利用试剂r1对待测样本进行溶血处理，降低了试纸条的背景干扰，保证了检测的稳定性以及精密度。(2)本发明通过配置特殊的试剂r2，将示踪粒子标记抗体溶于试剂r2中，在待测样本前处理阶段就使其与示踪粒子标记抗体结合，取代了传统的结合垫结构，一方面简化了试纸条的制备工艺，另一方面克服了由于层析材质不均一导致检测结果的精密度和准确性不佳，提升了试纸条的特异性和稳定性，使检测精密度cv值低于3％。附图说明图1为根据本发明实施例1中的糖化血红蛋白检测试纸条的结构示意图；图2为根据本发明实施例3所提供的hba1c标准品浓度与测定值的标准曲线图；图3根据本发明实施例3所提供的hba1c测定值与临床值相关性图。图中标号分别表示：检测线1；质控线2；样品垫3；硝酸纤维素膜4；吸水垫5；底衬6。具体实施例本文包括以下的实施例，用于以例证的方式更清楚、明确地阐述本发明的技术方案。本领域技术人员根据本文的公开应当理解，可以在所公开的特定的实施方式中进行许多改变但是仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的思想和范围。本发明的具体实施方式仅用于解释本发明，而非意图通过任何方式限制本发明。实施例1糖化血红蛋白检测试纸条的制备1.试剂1的制备按照下述配方进行配置，充分搅拌混匀后，放于2-8℃保存。其余溶剂为纯化水2.试剂2的制备按照下述配方进行配置，充分搅拌混匀后，放于2-8℃保存。其余溶剂为纯化水3.试纸条的组装(1)硝酸纤维素膜的处理a.检测线的制备将抗人糖化血红蛋白hba1c单克隆抗体用20mmol/lph7.2的pbs缓冲液稀释到2.0mg/ml，以0.6ul/cm的量在硝酸纤维素膜左端处划检测线。b.质控线的制备将羊抗属igg抗体按2mg/ml的浓度，以0.6ul/cm的量在硝酸纤维素膜右端划质控线，该线与检测线相互平行，然后在干燥箱内45℃干燥24h。(2)样品垫的制备将玻璃纤维素膜裁剪成20*30cm每条。(3)吸水垫的制备将吸水纸裁剪成30*2.7cm每条。(4)组装塑料底衬、样品垫以及吸水垫为本领域通用材料，在塑料底衬上一次紧密搭接样品垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫(如附图1所示)。将贴好的中间物用斩切机切成3.72mm宽一条的试纸条。实施例2试纸条的使用方法(1)将0.05ml待测样本加入2.45ml试剂r1中，搅拌混匀，完成快速溶血；(2)将步骤(1)中的混合液与0.1ml的试剂r2混合，搅拌混匀，使样本中的血红蛋白抗体及血红蛋白与抗人血红蛋白抗体充分反应；(3)滴加60ul混合液到实施例1中制备得到的试纸条加样孔中；(4)样品混合液层析至试纸条检测线与抗人糖化血红蛋白抗体结合，随后再层析至质控线与羊抗鼠抗体结合；(5)用免疫定量分析仪(重庆中元汇吉生物技术有限公司，q8pro)测定反应后的灰度值，并根据灰度值计算出样本中的糖化血红蛋白的比例。实施例3性能测试(1)hba1c标准品的检测结果采用实施例2中的试纸条使用方法，待测样本选用不同浓度的hba1c标准品(取七个不同浓度，分别为2％、4％、6％、8％、12％、14％、16％，每个浓度设3个重复)，将经过试剂r1以及r2前处理后的待测样本分别滴加至实施例1中制备得到的试纸条样品垫上，用免疫定量分析仪(重庆中元汇吉生物技术有限公司，q8pro)读取信号。检测结果如下表所示：表1hba1c标准品检测结果以hba1c抗原标准品浓度为横坐标，测定的平均浓度为纵坐标，建立对数方程并拟合标准曲线，结果如附图2所示，其r2＝0.9993，相关性较好，检测范围为2％-16％。结果证明，使用本发明试纸条进行检测，检测结果线性较好，通过该标准曲线可对样品中hba1c蛋白浓度进行定量分析。(2)精密度测定配置低值样本2％、中值样本6％以及高值样本14％的hba1c标准品溶液，采用实施例1中制备得到试纸条以及实施例2中使用方法进行测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准差，计算变异系数进行重复性考察，检测结果如下表所示：表2hba1c检测试纸条精密度变异系数分别为1.83％、1.21％以及1.53％，同时，以(1-均值/标准值)×100％计算相对偏差进行准确度考察，结果显示相对偏差分别为-0.50％、-0.98％和-1.19％，实验结果说明采用本实施例所述的制备方案得到的试纸条具有较好的精密度和准确度。(3)不同时间差异性测定配置浓度为5％的样本，在加样后分别于1min、3min、5min、10min、20min、30min以及60min时使用免疫定量分析仪(重庆中元汇吉生物技术有限公司，q8pro)进行重复测定，比较在不同时间检测的结果差异，计算相对偏差(不同时间点测得浓度值/第一时间测得浓度值)，检测结果如下表所示：表3hba1c检测试纸条不同时间差异性时间1min3min5min10min20min30min60min浓度5.12％5.16％5.09％5.07％5.14％5.26％5.27％相对偏差-2.4％-0.2％-1.8％-1.4％-0.8％-1.2％-3.4％结果显示，本发明实施例1制备得到试纸条在加样后2-60min内检测差异性较小，说明其时间稳定性较好.(4)临床评价采集医院检测hba1c的全血样本200份，用本发明的试剂盒和罗氏免疫比浊法检测hba1c试剂盒两种方法同时进行检测比较。将两种方法的检测结果进行线性分析，结果如图3所示，其r2＝0.9876，因此本发明hba1c检测试纸条与罗氏免疫比浊检测试剂盒的相关性很好，符合临床分析要求，适合用于临床检测。实施例4本实施例共设置六组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂r1中的表面活性剂曲拉通x100的浓度不同，其余制备方法均与实施例1相同。同时采用所述六种试剂盒进行检测，检测结果如下表所示：表4注：本实施例中a组试剂r1中曲拉通x100的含量为5ml/l；b组为10ml/l；c组为15ml/l；d组为20ml/l；e组为30ml/l；f组为40ml/l，其余组分以及制备工艺均与实施例1相同。实验结果显示，在试剂r1中当表面活性剂曲拉通x100的含量在15ml/l-30ml/l之间时，精密度较高。实施例5本实施例共设置4组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂r1中的表面活性剂种类不同，其余制备方法均与实施例1相同。同时采用所述四种试剂盒进行检测，检测结果如下表所示：表5注：本实施例中a组试剂r1中表面活性剂为20ml/ltween-20；b组为20ml/lbrij58、c组为20ml/l曲拉通x450；d组为20ml/ltween-80；e组为20ml/l曲拉通x100，其余组分以及制备工艺均与实施例1相同。实验结果表明，在试剂r1中采用的表面活性剂为tween-20、曲拉通x405、tween-80以及曲拉通x100时，试纸条的检测精密度较高。实施例6本实施例共设置五组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂r2中的保护剂(海藻糖)的浓度不同，其余制备方法均与实施例1相同。同时采用所述五种试剂盒进行检测，检测结果如下表所示：表4注：本实施例中a组试剂r2中海藻糖的含量为10g/l；b组为20g/l；c组为30g/l；d组为50g/l；e组为70g/l，其余组分以及制备工艺均与实施例1相同。实验结果显示，在试剂r2中当保护剂海藻糖的含量在20-50g/l之间时，精密度较高。综上所述，本发明通过配置试剂r1，在样品前处理阶段利用试剂r1对待测样本进行溶血处理，降低了试纸条的背景干扰，同时保证了检测的稳定性以及精密度。同时，通过配置特殊的试剂r2，将示踪粒子标记抗体溶于试剂r2中，在待测样本前处理阶段就使其与示踪粒子标记抗体结合，取代了传统的结合垫结构，一方面简化了试纸条的制备工艺，另一方面克服了由于层析材质不均一导致检测结果的精密度和准确性不佳，提升了试纸条的特异性和稳定性，使检测精密度cv值低于3％。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种测定糖化血红蛋白的液相层析试剂，其特征在于，包括：免疫层析试纸条、试剂r1以及试剂r2；
所述试剂r1包含1-10g/l的溶血剂，所述溶血剂优选为sds；
所述试剂r2包含0.05-0.2g/l示踪粒子标记抗人血红蛋白抗体。
2.根据权利要求1所述的一种测定糖化血红蛋白的液相层析试剂，其特征在于，所述免疫层析试纸条包括：样品垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫，所述硝酸纤维素膜上靠近样品垫端设置有1条或多条检测线，所述检测线为抗人糖化血红蛋白抗体，所述硝酸纤维素膜上靠近吸水垫端设置有1条质控线，所述质控线为羊抗鼠抗体。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定糖化血红蛋白的液相层析试剂，其特征在于，所述试剂r1还包括20-100mmol/l的缓冲液、0.1-0.8g/l的防腐剂、50-100mmol/l的氯化钠以及以及15-30ml/l的表面活性剂。
4.根据权利要求3所述的一种测定糖化血红蛋白的液相层析试剂，其特征在于，所述缓冲液选自mopso缓冲液、hepes缓冲液、tris缓冲液或磷酸盐缓冲液中的至少一种，所述防腐剂选自proclin-300或叠氮钠中的至少一种，所述表面活性剂选自tween-20、tween-80、曲拉通x100以及曲拉通x405中的至少一种。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种测定糖化血红蛋白的液相层析试剂，其特征在于，所述试剂r2还包括5-50mmol/l的缓冲液、2-10g/l的蛋白稳定剂、20-50g/l的保护剂、0.1-0.8g/l的防腐剂。
6.根据权利要求5所述的一种测定糖化血红蛋白的液相层析试剂，其特征在于，所述试剂r2中缓冲液选自mopso缓冲液、hepes缓冲液、tris缓冲液或磷酸盐缓冲液中的至少一种，所述保护剂选自海藻糖或蔗糖中的至少一种，所述防腐剂选自proclin-300或叠氮钠中的至少一种，所述蛋白稳定剂选自酪蛋白钠及其水解产物、bsa、脱脂奶粉、鱼明胶或氨基酸中的至少一种。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种测定糖化血红蛋白的液相层析试剂，其特征在于，所述示踪粒子为彩色微球，优选为红色微球。
8.一种测定糖化血红蛋白的液相层析试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)试剂r1的制备：按照1-10g/l的溶血剂、20-100mmol/l的缓冲液、0.1-0.8g/l的防腐剂、50-100mmol/l的氯化钠以及以及15-30ml/l的表面活性剂进行配置后搅拌混匀，所述溶血剂优选为sds，所述缓冲液选自mopso缓冲液、hepes缓冲液、tris缓冲液或磷酸盐缓冲液中的至少一种，所述防腐剂选自proclin-300或叠氮钠中的至少一种，所述表面活性剂选自tween-20、tween-80、曲拉通x100以及曲拉通x405中的至少一种；
(2)试剂r2的制备：按照0.05-0.2g/l示踪粒子标记抗人血红蛋白抗体、5-50mmol/l的缓冲液、2-10g/l的蛋白稳定剂、20-50g/l的保护剂以及0.1-0.8g/l的防腐剂进行配置后搅拌混匀，所述示踪粒子优选为红色微球，所述缓冲液选自mopso缓冲液、hepes缓冲液、tris缓冲液或磷酸盐缓冲液中的至少一种，所述保护剂选自海藻糖或蔗糖中的至少一种，所述防腐剂选自proclin-300或叠氮钠中的至少一种，所述蛋白稳定剂选自酪蛋白钠及其水解产物、bsa、脱脂奶粉、鱼明胶或氨基酸中的至少一种；
(3)硝酸纤维素膜的处理：将抗人糖化血红蛋白单克隆抗体用pbs缓冲液稀释后在硝酸纤维素膜靠近样品垫端划检测线；将羊抗鼠igg抗体在硝酸纤维素膜靠近吸水垫端划质控线，该线与检测线相互平行，干燥；
(4)试纸条的组装：将硝酸纤维素膜搭接在底衬上，样品垫搭接在硝酸纤维素膜的一端，吸水垫搭接在硝酸纤维素膜的另一端，切条。
9.根据权利要求1-6任意一项所述试剂盒在检测糖化血红蛋白中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测样本加入试剂r1中，搅拌混匀；
(2)将步骤(1)中的混合液与试剂r2混合，搅拌混匀；
(3)滴加混合液到实施例1中制备得到的试纸条加样孔中；
(4)用免疫定量分析仪检测。
10.根据权利要求9所述的试剂盒在检测糖化血红蛋白中的应用，其特征在于，步骤(1)中所述待测样本与试剂r1的体积比为1:50-1:100之间，步骤(2)中混合液与试剂r2的体积比为10:1-50:1之间。
技术总结本发明公开了一种测定糖化血红蛋白的液相层析试剂，其包括：免疫层析试纸条、试剂R1以及试剂R2，所述免疫层析试纸条包括：底衬、样品垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫，所述硝酸纤维素膜上固定有一条或多条检测线，所述检测线为抗人糖化血红蛋白抗体，所述试剂R1包含1‑10g/L的SDS，所述试剂R2包含示踪粒子标记抗人血红蛋白抗体。本发明通过配置特殊的试剂R2，将示踪粒子标记抗体溶于试剂R2中，在待测样本前处理阶段就使其与示踪粒子标记抗体结合，同时通过配置试剂R1，在前处理阶段针对样本进行溶血处理。本发明一方面简化了试纸条的制备工艺，另一方面提升了试纸条的特异性和稳定性，使检测精密度CV值低于3％。
技术研发人员：肖江涛;秦川
受保护的技术使用者：重庆中元汇吉生物技术有限公司
技术研发日：2020.11.18
技术公布日：2021.03.12
