本申请涉及多光子成像技术领域，特别是涉及一种微型化多光子显微系统及其探头和控制方法。
背景技术：
目前，大多数细胞生物学主要在离体培养的细胞体系中研究。然而与细胞生物学研究有所不同的是，大脑的功能研究的整体性和原位性显得更加关键：仅研究分离的神经元无法解释神经系统的功能和规律。换句话说，必须要求神经元处在其正常生存的大脑环境中才能使其正常运转。然而，大脑是一个高度复杂的器官。使用包括共聚焦显微镜在内的传统的荧光显微系统，由于被观测的信号会受到样本组织的散射和吸收，无法穿透如此深的组织进行成像。而多光子显微系统特有的非线性光学特性，以及其工作波长处在红外区域等特点，使得多光子成像技术具有更好的光学切片能力和更深的穿透深度。因此，多光子显微系统成为大脑内无创神经成像的首选技术。
为了使待观测动物在自由活动的时候直接对其神经元进行成像，科学家开始研发微型化多光子显微系统，使多光子显微系统可以直接固定在自由活动的动物身上，让动物“带着显微系统运动”。
但是，现有的微型化多光子显微系统只能对确定工作距离(成像深度)的像面进行成像。如何实现对不同工作距离(成像深度)的像面进行成像，是目前神经成像领域亟待解决的问题。
技术实现要素：
第一方面，提供一种微型化多光子显微系统的探头，包括：变焦器件，用于对待观测样本的内部组织进行轴向的激光扫描；扫描仪，用于对所述内部组织进行平面激光扫描；光学系统，位于所述变焦器件和所述扫描仪之间，所述光学系统的设置使所述变焦器件的实际变焦位置与所述扫描仪的位置重合，或使所述实际变焦位置处于所述变焦器件的位置和所述扫描仪的位置之间。
第二方面，提供一种微型化多光子显微系统，包括上述微型化多光子显微系统的探头。
第三方面，提供一种微型化多光子显微系统的控制方法：控制变焦器件，以对待观测样本的内部组织进行轴向的激光扫描；控制扫描仪，以对所述内部组织进行平面激光扫描；控制所述变焦器件的实际变焦位置，使得所述变焦器件的实际变焦位置与所述扫描仪的位置重合，或使所述实际变焦位置处于所述变焦器件的位置和所述扫描仪的位置之间。
本申请的实施例在变焦器件和扫描仪之间设置光学系统，该光学系统的设置使变焦器件的实际变焦位置与扫描仪的位置重合，或使实际变焦位置处于变焦器件的位置和扫描仪的位置之间。实现微型化多光子显微系统对不同工作距离(成像深度)的像面进行成像的前提下，避免了变焦位置与扫描仪的位置之间存在间隔所引起的数值孔径压缩和光焦度与对焦位置对应关系非线性的问题。
附图说明
图1是现有微型化多光子显微系统示意图。
图2是一种可变焦微型化多光子显微系统的局部示意图。
图3是本申请提供的一种可变焦的微型化多光子显微系统实施例示意图。
图4是本申请提供的一种可变焦的微型化多光子显微系统中的光学系统实施例示意图。
图5是将本申请实施例提供的一种微型化多光子显微系统固定在小鼠头部的示意图。
图6是本申请实施例提供的一种微型化多光子显微系统固定在可自由活动的小鼠头部的示意图及其观测结果图。
图7是对小鼠头部同一位置进行为期一个月的观察的神经元变化图。
图8是小鼠在三种不同情况下的活动轨迹图及其运动距离和运动速度的对比图。
图9是本申请提供的一种微型化多光子显微系统控制方法实施例示意图。
具体实施方式
多光子成像技术具有更好的光学切片能力和更深的穿透深度，因此，微型化多光子显微系统广泛应用于对大脑神经元的观察。
为便于理解，下面结合图1，对现有微型化多光子显微系统进行举例说明。光线传播路径如图1中灰色部分所示。
光线导入装置1用于接收光源输出的光线并导入到微型化多光子显微系统的探头内。可选地，导入的光线可以是激光，例如中心波长为800nm、920nm、1030nm的激光。
准直器2用于准直来自光线导入装置1的光线，减少不同频率光线之间的色差，以提高传输效率和激发效率。
扫描仪4通过改变光线入射角角度，对动物活体样本内部的组织平面进行二维平面扫描。其中平面扫描指的是在活体样本内部组织某一固定深度的xy平面进行扫描。可选地，扫描仪4可采用微机电扫描仪(mems)。mems可高速、均匀地进行扫描，且具有大扫描角和大视野。
扫描透镜6设置在扫描仪4和物镜10之间的光路上，用于将扫描仪4二维扫描所产生的角度变化的光线转化成位置变化的光线。
物镜10用于将导入的光线汇聚到待观测样本内部，从而激发活体样本产生荧光信号。物镜10还用于输出荧光信号。
双色镜9设置在物镜10和采集透镜8之间的光路上，用于将激光和荧光信号分开以及输出荧光信号。
采集透镜8用于有效收集透过双色镜9的荧光信号。
荧光信号输出装置7用于接受通过采集透镜8的荧光信号，并输出荧光信号。可选地，荧光信号输出装置7可以为一种柔性光纤束(sfb)，sfb内各玻璃光纤保持松散状态，以便于由自由活动的活体样本携带，进而最小化活体样本运动引起的扭矩和张力，且不降低荧光信号的收集效率。
上文所述的现有微型化多光子显微系统只能对确定工作距离(成像深度)的像面进行成像。如何实现对不同工作距离(成像深度)的像面进行成像，是目前神经成像领域亟待解决的问题。图2展示了一种可变焦的微型化多光子显微系统的实现方式：通过在准直器2和扫描仪4中间设置变焦器件3，使得微型化多光子显微系统实现在z轴(光轴方向)上的变焦(比如电控对焦调节)，从而对待观测样本的内部组织进行轴向的扫描，进而实现对不同工作距离(成像深度)的像面进行成像。其中轴向的扫描指的是在待观测样本内部组织的z轴方向上不同位置的扫描。
但是，可变焦的微型化多光子显微系统的变焦性能并不理想，原因如下。在理想情况下，经过变焦器件3的光线的变焦位置应与扫描仪4的位置重合，以达到最佳的变焦性能。受限于变焦器件3自身的封装体积，且变焦器件3实际安装在准直器2和扫描仪4之间，因此实际光线产生变焦的位置与扫描仪4的位置会存在一定间距δ。而该间距δ会带来两方面负面影响：其一，由于变焦过程中成像的数值孔径会随着变焦量的变化而变化，所以当变焦器件3引入正光焦度时，成像的数值孔径会相应的压缩，进而造成分辨率下降。随着间距δ的增加，数值孔径的压缩会越来越严重。其二，若实际光线变焦位置与扫描仪4所在位置重合，变焦器件3的光焦度与工作距离(成像深度)是线性的对应关系。但当存在间距δ时，该对应关系转为非线性对应关系，即不同区间的等量光焦度变化会带来不同的工作距离变化。因此，为了在成像时精确控制对焦位置，变焦器件3的光焦度参数需要进行非线性标定，以得到对应的位置关系，这增加了对焦过程的复杂性。
针对上述问题，本申请提供一种微型化多光子显微系统。作为一种实现方式，如图3所示，设置光学系统5。光学系统5将原本距离扫描仪4较远的变焦器件3的原始变焦位置转换到扫描仪4附近的实际变焦位置处，从而减小上述间距δ，进而减小变焦所引起的数值孔径压缩和光焦度与对焦位置对应关系非线性的问题。需要说明的是，原始变焦位置指的是不设置光学系统5时，变焦器件3引入光焦度变化的位置，实际变焦位置指的是设置光学系统5后，变焦器件3引入光焦度变化的位置。
需要说明的是，对于光学系统5设置的位置不做限制，例如可以在变焦器件3和扫描仪4之间。
由上述论述可知，间距δ越小，变焦对上述问题的影响就越小。可选地，光学系统5的设置使得变焦位置与扫描仪4的位置重合时，间距δ为0，此时变焦性能最佳，变焦对于上述问题的影响可降至最低。
作为一种实现方式，光学系统5可以包括图3和图4所示的第一透镜51和第二透镜52，第一透镜51位于变焦器件3和第二透镜52之间，第二透镜52位于第一透镜51和扫描仪4之间。第一透镜51和第二透镜52(均可以是正透镜)的焦距均为f。第一透镜51和第二透镜52组成4f系统。如图4所示，该4f系统中，位置b为位置a的共轭位置，位置a和位置b之间的距离为4f。图4中灰色实线箭头表示光线传播方向。在理想情况下，变焦器件3对准直器2输入的光引入光焦度变化的位置如图3中位置a所示，也就是变焦器件3对光线进行焦度变化的原始变焦位置如图3中位置a所示，使用4f系统后，光线发生变化的位置会变换到图中位置b处，也就是原变焦位置会共轭到位置b的实际变焦位置处，位置b在变焦器件3和扫描仪4之间，且位置b在扫描仪4附近或与扫描仪4重合。因此，通过光学系统5减小了变焦位置到扫描仪4之间的距离(即间距δ)，从而抑制了上述两种负面效应。利用4f系统改变变焦器件3的实际变焦位置，在实现起来比较简单。当然，光学系统5还可以采用其他设计方式，只要能够改变变焦器件3的实际变焦位置即可。
作为一种实现方式，其中原始变焦位置(即位置a)到第一透镜51的距离为焦距f，转换后的实际变焦位置(即位置b，也是理论上扫描仪4所在的位置)到第二透镜的距离也为f，第一透镜51和第二透镜52的距离为2倍的f。这种设置第一透镜51和第二透镜52的方式可使得光学系统5构成标准的4f系统，使转换效果更优，结构简单。
作为一种实现方式，在实际装配过程中，由于空间尺寸紧凑，第二透镜52的安装可能存在封装结构冲突的问题。因此实际装配过程中会适当减小原始变焦位置(即位置a)与第一透镜51之间的间距，使光线经过4f系统的光学共轭位置b(即理论上扫描仪4所在的位置)与第二透镜52的间距拉长，也就是增加了第二透镜52到扫描仪4之间的距离，进而为第二透镜52的安装提供空间。
具体使用哪种类型的变焦器件3，本申请不做限制。作为一种实现方式，由于液体变焦透镜具有结构紧凑、响应快速、体积小巧等优势，因此，可选取液体变焦透镜，例如电可调透镜(electricallytunablelens，etl)作为变焦器件3。
扫描仪4也可称为扫描镜，具体选用哪种类型的扫描仪4，本申请不做限制。考虑到微型化多光子显微系统对于可靠性、精度以及尺寸等的要求，作为一种实现方式，可选取微机电扫描仪(mems)作为扫描仪4。
需要说明的是，本申请涉及的微型化多光子显微系统，可以是微型化多光子显微镜或包含微型化多光子显微探头的其他设备。本申请涉及的多光子可以包括：双光子、三光子、二次谐波或三次谐波等非线性激发信号。
需要说明的是，在实际使用微型化多光子显微系统对活体观测时，需要将微型化多光子显微系统固定在待观测位置处以便观察。例如，图5展示了将微型化多光子显微系统固定在小鼠头部。本申请对待观测活体类型不做限制，例如可以是小鼠，也可以是其他类型的动物。本申请对观测部位或观测内容不做限制，例如，可以是脑神经、脊柱神经等。图6中的(a)为将本申请微型化多光子系统固定在可自由活动的小鼠的脑部，并对其脑神经进行的观测，观测结果如图6中的(b)所示。图7为用本申请的微型多光子系统对小鼠脑部同一位置进行为期一个月的观察的神经元变化图。
需要说明的是，本申请中“微型化”指的是多光子显微化显微系统在观测活体期间，对待观测活体的活动影响较小，例如，该多光子显微系统固定在待观测活体上时，待观测活体仍然可以自由运动。由于本申请的一种实施例提供的显微系统安装于活体头部，其重量为4.2g，因此，设计了三种情况的对比实验，包括：活体头部无负载、头部有4.2g负载和头部装有本申请提供的一种微型化多光子显微镜，实验结果如图8所示。图8中的(a)显示了活体无负载自由活动的活动轨迹；图8中的(b)显示了活体头部有4.2g负载的活动轨迹；图8中的(c)显示了活体头部装有本申请提供的一种微型化多光子显微系统的运动轨迹。图8中的(d)为上述三种情况的运动距离对比图，图8中的(e)为上述三种情况的运动速度对比图。由图8可看出，本申请的多光子微型化显微系统对活体的运动轨迹、运动距离、运动速度几乎没有影响。
下面对本申请的方法实施例进行描述，由于方法实施例可以由上文描述的微型化多光子显微系统执行，因此未详细描述的部分可参见上文。
图9是本申请实施例提供的一种微型化多光子显微系统的控制方法的示意性流程图。该微型化多光子显微系统可包括变焦器件、光学系统和扫描仪。
图9的方法可以包括步骤s901：控制变焦器件，以对待观测样本的内部组织进行轴向的激光扫描；步骤s902：控制扫描仪，以对待观测样本内部组织进行平面激光扫描；步骤s903：控制变焦器件的实际变焦位置，使得变焦器件的实际变焦位置与扫描仪的位置重合，或使实际变焦位置处于变焦器件的位置和扫描仪的位置之间。
可选地，通过焦距相同的第一透镜和第二透镜组成的4f系统控制变焦器件的实际变焦位置。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种微型化多光子显微系统的探头，其特征在于，包括：
变焦器件，用于对待观测样本的内部组织进行轴向的扫描；
扫描仪，用于对所述内部组织进行平面扫描；
光学系统，位于所述变焦器件和所述扫描仪之间，所述光学系统的设置使所述变焦器件的实际变焦位置与所述扫描仪的位置重合，或使所述实际变焦位置处于所述变焦器件的位置和所述扫描仪的位置之间。
2.根据权利要求1所述的探头，其特征在于，所述光学系统包括焦距相同的第一透镜和第二透镜；
所述第一透镜位于所述变焦器件和所述第二透镜之间，所述第二透镜位于所述第一透镜和所述扫描仪之间，所述第一透镜和所述第二透镜形成4f系统。
3.根据权利要求2所述的探头，其特征在于：
所述变焦器件的原始变焦位置到所述第一透镜的距离等于所述第一透镜的焦距。
4.根据权利要求2所述的探头，其特征在于：
所述变焦器件的原始变焦位置到所述第一透镜的距离小于所述第一透镜的焦距。
5.根据权利要求1～4中的任一所述探头，其特征在于：
所述变焦器件为液体变焦透镜。
6.根据权利要求1～4中的任一所述探头，其特征在于：
所述扫描仪为微机电扫描仪。
7.根据权利要求1～4中的任一所述探头，其特征在于，还包括：
准直器，用于对输入的光线进行准直处理，所述变焦器件位于所述准直器和所述扫描仪之间。
8.一种微型化多光子显微系统，其特征在于，包括：
权利要求1～7中任一所述探头。
9.一种微型化多光子显微系统的控制方法，其特征在于，
控制变焦器件，以对待观测样本的内部组织进行轴向的激光扫描；
控制扫描仪，以对所述内部组织进行平面激光扫描；
控制所述变焦器件的实际变焦位置，使得所述变焦器件的实际变焦位置与所述扫描仪的位置重合，或使所述实际变焦位置处于所述变焦器件的位置和所述扫描仪的位置之间。
10.根据权利要求9所述的控制方法，其特征在于：
所述变焦器件的实际变焦位置的控制是利用光学系统实现的，所述光学系统包括焦距相同的第一透镜和第二透镜；所述第一透镜位于所述变焦器件和所述第二透镜之间，所述第二透镜位于所述第一透镜和所述扫描仪之间，所述第一透镜和所述第二透镜形成4f系统。
技术总结