本发明涉及食药用真菌菌种制备技术领域，特别涉及一种血耳优良菌种的培育方法。
背景技术：
血耳又称药耳、血色银耳、血木耳，是一种真菌，鲜时暗赤褐色至黑褐色，硬胶质带肉质，叶状，大型，瓣片薄，边全缘，波状，下部连合，可食，营养丰富，又可作药用。血耳舒筋活血，能使粘稠性血液被稀释，增强流动性，降低人体中风的危险性。血耳还有补血、美容等功效，是纯天然的补血性食材。血耳是湖北西北部山区民间治疗月经不调、白带过多的妇科良药，还对各种痢疾及肝炎有很好的疗效。目前血耳人工栽培过程中，基础性研究较少，段木栽培产量低，接种后出耳率低下，代料栽培研究没有起步。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种血耳优良菌种的培育方法，具有培育出高产、接种出耳率高的效果。本发明人研发发现血耳菌种是由血耳菌絲寄生在另一种皱韧革菌的菌絲体形成的复合体，二者缺一不可。研究报告待发表。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：步骤一，母种的获得，取离血耳基部最近的基木作分离物，即离血耳基部最近的基木最有可能同时含有血耳菌丝、皱韧革菌，接种于试管内的黄豆饼粉培养基上，于24-26℃下培养满管后，筛选出同时含有血耳菌丝、皱韧革菌的培养物，再于18-20℃下，继续培养35-40天；
因母种培养物不能搅拌，所以本发明设计了二代母种。
步骤二，二代母种的制备，挑取步骤一中，母种接种块两边的菌丝，接种于二代母种培养基上，步骤一中的一只试管只用于接种两瓶二代母种培养基，其余菌丝不用，于26℃下培养15-20天，检查无杂菌后，得到二代母种；
其中，以重量份数计，二代母种培养基的原料包括：60-75份的锯木屑、20-30份麦麸、1-2.5份石膏粉、1-2.5份硫酸镁、0.5-2份糖，料水比为1:1.0-1.2，二代母种培养基制备方法如下：取锯木屑与麦麸混合，取石膏粉、硫酸镁、糖与水混合后加入锯木屑与麦麸的混合物中，搅拌均匀后得到二代母种培养基；
步骤三、原种的制备，原种培养基的原料组分及制备方法与二代母种培养基相同，取原种培养基灭菌后，在原种培养基内拨开小孔，取步骤二中含有二代母种的培养基混合均匀后接种于小孔内，用原种培养基将小孔覆盖，于24-26℃培养45-50天，得到原种。
通过采用上述技术方案，菌种是血耳栽培成功的基本保证，本发明创造性地采用含有血耳菌丝、皱韧革菌的血耳分离物作为母种，能从源头保证菌种的有效性。本发明中，因不能保证直接获取的母种内血耳菌丝与皱韧革菌是结合在一起的，在步骤一的母种培养时不能搅拌，只起到繁殖血耳菌丝和皱韧革菌，接种处的血耳菌丝和皱韧革菌在生长繁殖过程中结合形成复合体；在步骤二中，挑取母种接种处生长繁殖的菌丝，该处的菌丝含有血耳菌丝和皱韧革菌结合形成的复合体，在二代母种培养基内培养繁殖，搅拌均匀后接种于原种培养基内进行培养，得到原种。
相比于现有技术，本发明的区别之一在于独创性选择血耳菌丝和皱韧革菌复合体来作为菌种，区别之二在于针对母种中血耳菌丝和皱韧革菌结合不牢固、不能保证母种内血耳菌丝与皱韧革菌结合形成复合体，采用步骤一、步骤二、步骤三对原始的母种进行培育，制备的原种内含有血耳菌丝与皱韧革菌结合的复合体，作为有效菌种。
本发明的进一步设置为：步骤四，栽培种的生产，取枝条，剪成段后用糖水浸泡沥干，与锯木屑培养料混合装入培养袋后，加套环封口、灭菌，锯木屑培养料与原种培养基相同；将步骤三中的原种培养基搅拌均匀后接种于培养袋内，于24-26℃下培养50-60天，菌丝长满培养袋后，降温至15-20℃再培养20天，得到栽培种。
通过采用上述技术方案，步骤三得到的原种，可以用于段木接种，栽培血耳。在实践生产中，直接用原种接种生产成本过高，因此将原种扩大培养成栽培种，用于大规模生产中。在原种扩大培养成栽培种的过程中。
步骤四的独创性在于，一是采用用糖水浸泡沥干的枝条与锯木屑培养料混合后，将原种扩大培养形成在栽培种，从含有黄豆饼粉的母种培养基到含有锯木屑的二代母种培养基，再到枝条与锯木屑培养料混合的培养基，逐步驯化菌种适应木质环境；二是在菌丝长满培养袋后，降温至15-20℃再培养20天，降温培养过程中使其老熟后，方可用于段木接种，降温老熟的作用在于维持扩大培养过程中菌种的有效性。
得到的栽培种中，含有血耳菌种的锯木屑称为锯木屑菌种，含有菌种的枝条称为枝条菌种。
本发明的进一步设置为：步骤四中，枝条直径与栽培种栽培所用的段木孔穴孔径相等。
本发明的进一步设置为：步骤四中，按重量比，枝条：锯木屑培养基＝2：3。
本发明的进一步设置为：步骤四中，糖水浓度为0.05-2％。
本发明的进一步设置为：步骤四中，糖水浓度为0.1％。
本发明的进一步设置为：步骤二中，锯木屑为栎木锯木屑；步骤四中，枝条为栎木枝条。
通过采用上述技术方案，血耳常用的栽培段木为栎木，故步骤二中的锯木屑选用栎木锯木屑，步骤四中的枝条选栎木枝条，栎木枝条长度为1-1.2cm。
本发明的进一步设置为：步骤二中，以质量份数计，二代母种培养基原料包括72份锯木屑、24份麦麸、1.5份石膏粉、1.5份硫酸镁、1份糖，料水比为1：1.0-1.2。
本发明的进一步设置为：步骤一中的母种制备方法如下：摘除基木上的血耳，将基木晾干后，先以流水反复冲洗干净，切取离血耳生长最接近的部分基木，于实验室内以75％的酒精棉球擦洗多遍，再以无菌水清洗，并用无菌纱布吸干水分，再用无菌刀切开，夹取火柴头大小的基木块，置于事前准备好的试管培养基中央，每管放一粒，于24-26℃下培养，经多管比较筛选，选取生长健旺、无杂菌污染的分离物，及时转接到新鲜培养基上，经多次挑选，转管纯化，菌丝生长旺盛、后期略显灰白色、培养基底部略显淡红色的，即分离成功，得到母种。
本发明的进一步设置为：步骤一中，黄豆饼培养基原料包括30-40份黄豆饼粉、15-20份蔗糖、1-2份磷酸氢二钾、0.5-1份七水合硫酸镁、15-20份琼脂，料水比为1:1.0-1.2。
通过采用上述技术方案，本发明中的料水比为重量比。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过母种培养、二代母种培养、原种培养，制备得到血耳菌丝与皱韧革菌的的复合体作为血耳菌种，从源头上提高血耳菌种在栽培过程中接种后的出耳率，显著改善血耳菌种接种后出耳过程中稳定性差、出耳率低的问题，提升血耳栽培的产量。
2、因母种中血耳菌丝和皱韧革菌结合不牢固、不能保证母种内血耳菌丝与皱韧革菌结合形成有效菌种，将母种接种处繁殖的菌丝挑取到二代母种培养基内，培养后搅拌均匀并接种到原种培养基内，培养得到原种，保证原种内含有血耳菌丝与皱韧革菌结合的复合体的有效菌种。
3、在原种扩大培养成栽培种的过程中，首先采用糖水浸泡后枝条与锯木屑培养料混合后形成培养基，驯化栽培种适应木质生长环境，同时栽培后的枝条用于堵塞栽培过程中段木上的孔穴，能显著提高栽培过程中的出耳率；其次，申请人在实践研发过程中发现，在菌丝长满培养袋后降温至15-20℃再培养20天，能有效保证原种扩大培养形成栽培种的过程中菌种的有效性。
4、血耳菌丝为纯白色，皱韧革菌开始为白色、絮状，后期变为浅棕色。皱韧革菌生长快，在前面开路，血耳菌丝生长较慢。只有两种菌丝交合在一起，才是能得到本发明的有效菌种，如只取单一皱韧革菌作为菌种，是不能长出血耳的无效菌种。制备母种时，如果仅从血耳基部分离，只能得到血耳菌丝，没有皱韧革菌；如果从基木上离血耳较远的地方分离，只能得到皱韧革菌，血耳菌丝很少或者没有，分离菌种时，只能从离血耳生长最近的基木上取样分离，才有可能得到含有血耳菌絲和皱韧革菌复合体的菌种。该方法为本发明的第一个发现和研究得到的。分离的母种转化成二级母种时，本发明只选用原接种块附近最可能含有两种菌丝的培养物做成二级母种，让它在三角瓶固体培养料中生长，便于搅拌均匀，两种菌丝交合生长在一起，菌种有效性大为提高，为本发明的亮点，在生产实践中也支持了本发明。
5、本发明得到的栽培种在使用时，先将锯木屑菌种接种到段木的接种孔内，表面再塞入枝条菌种，能对菌种起到覆盖作用，防止菌种水分散失，避免杂菌的进入，枝条菌种本身也是血耳菌种，能最大限度保证接种的成活率，这也是本发明独创性的亮点。
6、本发明独创性采用血耳菌丝与皱韧革菌的的复合体作为血耳菌种，通过本发明独创的培育方法得到的栽培种，显著提高血耳栽培时接种出耳率，血耳生长良好，显著提高血耳产量，对血耳的大规模栽培和产业化有着十分重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1培育的血耳优良菌种栽培后多根段木出耳图。
图2是实施例1培育的血耳优良菌种栽培后单根椴木的出耳图。
图3是实施例1培育的血耳优良菌种栽培后段木出耳图。
图4是实施例1培育的血耳优良菌种栽培后段木出耳图。
图5是实施例1培育的血耳优良菌种栽培后段木出耳图。
图6是实施例1培育的血耳优良菌种栽培后的单朵图片。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：一种血耳优良菌种的培育方法，包括以下步骤，步骤一，母种的获得，摘除基木上的血耳，将基木晾干后，先以流水反复冲洗干净，切取离原血耳生长最接近的部分基木，于实验室内以75％的酒精棉球擦洗多遍，再以无菌水清洗，并用无菌纱布吸干水分，再用无菌刀切开，夹取火柴头大小的基木块，置于事前准备好的试管培养基中央，每管放一粒，于24-26℃下培养，经多管比较筛选，选取生长健旺、无杂菌污染的分离物，及时转接到新鲜培养基上，经多次挑选，转管纯化，菌丝生长旺盛、后期略显灰白色、培养基底部略显淡红色的，即分离得到母种，再于18-20℃下，继续培养35-40天。
母种制备过程中和培养过程中所用的培养基均为黄豆饼粉培养基，黄豆饼培养基原料包括40份黄豆饼粉、20份蔗糖、1.5份磷酸氢二钾、0.75份七水合硫酸镁、20份琼脂，料水比为1:1.0-1.2(重量比)，取原料和水混合均匀后得到培养基。
步骤二，二代母种的制备，挑取步骤一中，培养基中母种接种块两边的菌丝，接种于二代母种培养基上，步骤一中的一只试管只用于接种两瓶二代母种培养基，其余菌丝不用，于26℃下培养15-20天，检查无杂菌后，得到二代母种。
其中，以重量份数计，二代母种培养基的原料包括：72份的锯木屑、24份麦麸、1.5份石膏粉、1.5份硫酸镁、1份糖，料水比为1:1.0-1.2(重量比)，二代母种培养基制备方法如下：取锯木屑与麦麸混合，取石膏粉、硫酸镁、糖与水混合后加入锯木屑与麦麸的混合物中，搅拌均匀后得到二代母种培养基。
步骤三、原种的制备，原种培养基的原料组分及制备方法与二代母种培养基相同，取原种培养基灭菌后，在原种培养基内拨开小孔，取步骤二中含有二代母种的培养基混合均匀后接种于小孔内，用原种培养基将小孔覆盖，于24-26℃培养45-50天，得到原种。
步骤四，栽培种的生产，取枝条，枝条选栎木枝条，直径与栽培用段木上的接种孔直径相等，栎木枝条长度为1-1.2cm，剪成段后用糖水浸泡沥干，与锯木屑培养料混合装入培养袋后，加套环封口、灭菌，锯木屑培养料与原种培养基相同，按重量比，枝条：锯木屑培养料＝2：3；将步骤三中的原种培养基搅拌均匀后接种于培养袋内，于24-26℃下培养50-60天，菌丝长满培养袋后，降温至15-20℃再培养20天，得到栽培种。其中，糖水为蔗糖水溶液，浓度为0.1％。
实施例2：一种血耳优良菌种的培育方法，与实施例1的区别之处在于，黄豆饼培养基原料包括30份黄豆饼粉、15份蔗糖、1份磷酸氢二钾、0.5份七水合硫酸镁、15份琼脂，料水比为1:1.0-1.2(重量比)。以重量份数计，二代母种培养基的原料包括60份的锯木屑、20份麦麸、1份石膏粉、1份石膏粉、0.5份糖，料水比为1:1.0-1.2。步骤四中，糖水浓度为0.05％。
实施例3：一种血耳优良菌种的培育方法，与实施例1的区别之处在于：黄豆饼培养基原料包括30份黄豆饼粉、15份蔗糖、2份磷酸氢二钾、1份七水合硫酸镁、15份琼脂，料水比为1:1.0-1.2(重量比)。以重量份数计，二代母种培养基的原料包括：75份的锯木屑、30份麦麸、2.5份石膏粉、2.5份石膏粉、2份糖，料水比为1:1.0-1.2。步骤四中，糖水浓度为2％。
对比例1：一种血耳优良菌种的培育方法，与实施例1的区别之处在于，选择不含皱韧革菌的菌丝作为母种。
对比例2：一种血耳优良菌种的培育方法，与实施例1的区别之处在于，去除步骤二，将步骤一中培养后的母种搅拌均匀后接种于原种培养基的小孔内。
对比例3：一种血耳优良菌种的培育方法，与实施例1的区别之处在于，步骤四中，原种培养基与二代母种培养基相同，不包括枝条。
对比例4：一种血耳菌种，选择血耳菌作为菌种。
对比例5：一种血耳菌种的培育方法，与实施例2的区别之处在于，步骤四中，原种培养基与二代母种培养基相同，不包括枝条。
实验部分
段木接种出耳实验
选择栎木，砍伐后截成1m左右的段木，用电钻在段木上钻孔，孔穴与孔穴距离在8-10cm，孔穴直径在16mm左右，深28mm，每根段木钻40个接种孔孔穴。
在当年4月-5月接种，取实施例1-3、对比例1-4的血耳菌种，分别填入段木接种孔孔穴内，每个实施例或对比例分别填充满三根段木孔穴，压紧压实后，用枝条插入堵塞孔穴，即塞入枝条菌种，用小木锤打紧，防止脱落。在实施例1-3、对比例1-2中，堵塞孔穴的枝条为步骤四中栽培种生产完成后从培养袋内取出的枝条菌种，对比例3-4中，堵塞孔穴的枝条为段木上削取的枝条，对比例5中，孔穴上不覆盖枝条。接种完毕后进行上堆，保温发菌，保持堆内在25℃，每隔10天翻堆，洒水保湿和通气。1-2个月后，将栎木段木放荫蔽坡地。在段木上端加垫枕木，进行定期浇水、通气、保温，接种后5个月左右，即当年10月左右进入出耳期，测定各实施例及对比例的每根段木上的出耳数量，计算平均值，每孔计算为一朵，并将结果在表1中列出。
表1实施例1-3、对比例1-4的段木出耳朵数
从表1的实验数据分析，实施例1-3制备得到的血耳优良菌种在栽培后出耳率显著优于对比例1-4。从图1到图5可知，实施例1的血耳优良菌种栽培后出耳数较多，从图6可知，出耳后的血耳生长旺盛，干重达65g，大小有13×13cm，产量高。在实践过程中，实施例1中的血耳优良菌种栽培的段木中，50根段木为一铺，一铺段木采收的血耳干品约为2-3斤，个别高产户可采收五潮，达3-5斤，血耳产量得到显著提升。
1.一种血耳优良菌种的培育方法，其特征在于：包括以下步骤，
步骤一，母种的获得，取离血耳基部最近的基木作分离物，接种于试管内的黄豆饼粉培养基上，于24-26℃下培养满管后，筛选出同时含有血耳菌丝、皱韧革菌的培养物，再于18-20℃下，继续培养35-40天；
步骤二，二代母种的制备，挑取步骤一中，母种接种块两边的菌丝，接种于二代母种培养基上，步骤一中的一只试管只用于接种两瓶二代母种培养基，其余菌丝不用，于26℃下培养15-20天，检查无杂菌后，得到二代母种；
其中，以重量份数计，二代母种培养基的原料包括：60-75份的锯木屑、20-30份麦麸、1-2.5份石膏粉、1-2.5份硫酸镁、0.5-2份糖，料水比为1:1.0-1.2，二代母种培养基制备方法如下：取锯木屑与麦麸混合，取石膏粉、硫酸镁、糖与水混合后加入锯木屑与麦麸的混合物中，搅拌均匀后得到二代母种培养基；
步骤三、原种的制备，原种培养基的原料组分及制备方法与二代母种培养基相同，取原种培养基灭菌后，在原种培养基内拨开小孔，取步骤二中含有二代母种的培养基混合均匀后接种于小孔内，用原种培养基将小孔覆盖，于24-26℃培养45-50天，得到原种。
2.根据权利要求1所述的一种血耳优良菌种的培育方法，其特征在于：步骤四，栽培种的生产，取枝条，剪成段后用糖水浸泡沥干，与锯木屑培养料混合装入培养袋后，加套环封口、灭菌，锯木屑培养料与原种培养基相同；将步骤三中的原种培养基搅拌均匀后接种于培养袋内，于24-26℃下培养50-60天，菌丝长满培养袋后，降温至15-20℃再培养20天，得到栽培种。
3.根据权利要求2所述的一种血耳优良菌种的培育方法，其特征在于：步骤四中，枝条直径与栽培种栽培所用的段木孔穴孔径相等。
4.根据权利要求2所述的一种血耳优良菌种的培育方法，其特征在于：步骤四中，按重量比，枝条：锯木屑培养基＝2：3。
5.根据权利要求2所述的一种血耳优良菌种的培育方法，其特征在于：步骤四中，糖水浓度为0.05-2％。
6.根据权利要求5所述的一种血耳优良菌种的培育方法，其特征在于：步骤四中，糖水浓度为0.1％。
7.根据权利要求2所述的一种血耳优良菌种的培育方法，其特征在于：步骤二中，锯木屑为栎木锯木屑；步骤四中，枝条为栎木枝条，栎木枝条长度为1-1.2cm。
8.根据权利要求1所述的一种血耳优良菌种的培育方法，其特征在于：步骤二中，以质量份数计，二代母种培养基原料包括72份锯木屑、24份麦麸、1.5份石膏粉、1.5份硫酸镁、1份糖，料水比为1:1.0-1.2。
9.根据权利要求1所述的一种血耳优良菌种的培育方法，其特征在于：步骤一中，摘除基木上的血耳，将基木晾干后，先以流水反复冲洗干净，切取离原血耳生长最接近的部分基木，于实验室内以75％的酒精棉球擦洗多遍，再以无菌水清洗，并用无菌纱布吸干水分，再用无菌刀切开，夹取火柴头大小的基木块，置于事前准备好的试管培养基中央，每管放一粒，于24-26℃下培养，经多管比较筛选，选取生长健旺、无杂菌污染的分离物，及时转接到新鲜培养基上，经多次挑选，转管纯化，菌丝生长旺盛、后期略显灰白色、培养基底部略显淡红色的，即分离得到母种，再于18-20℃下，继续培养35-40天。
10.根据权利要求1所述的一种血耳优良菌种的培育方法，其特征在于：步骤一中，黄豆饼培养基原料包括30-40份黄豆饼粉、15-20份蔗糖、1-2份磷酸氢二钾、0.5-1份七水合硫酸镁、15-20份琼脂，料水比为1:1.0-1.2。
技术总结