本发明涉及一种通过幼胚挽救技术获得茉莉花种间杂交后代的方法，属于现代植物育种技术领域。
背景技术：
茉莉花（jasminumsambac(l.)atiton）为木樨科素馨属（也叫茉莉属），常绿小灌木或藤本状灌木，原产于印度、巴基斯坦等地，多分布于热带，亚热带和温带地区。我国以江苏、浙江、福建、台湾、广东、四川、云南分布最为广泛。茉莉花在我国已有约2000年的栽培历史，我国也是世界上茉莉花产量最多的国家，年产量占世界茉莉花总产量的50%以上。茉莉花叶色翠绿，花色洁白，清香四溢，是常见庭园及盆栽观赏芳香花卉，也是重要的花茶和香精原料。中医学认为茉莉花性味辛甘温，具有理气、开郁、辟秽、和中之功效，食之有清热明目，治高血压等作用，还可用于治疗腹胀腹泻、结膜炎、皮炎、疮毒等。茉莉花已广泛应用于盆栽观赏、园林绿化、花茶窨制、香料生产等方面，是我国既具观赏价值又具经济价值的重要园林花卉。
茉莉花的品种较多，目前仅我国就有60多个，其中主要的栽培品种根据其花瓣的不同可分为单瓣、双瓣和重瓣（多瓣）3种类型。其中单瓣茉莉和重瓣茉莉总体上生态适应性较弱，抗逆性和产花量较差，因此目前生产上使用的主要为双瓣茉莉。但双瓣茉莉经过多年的无性繁殖和长期使用，会出现品种性退化，导致其抗性和产花量均降低。因此，开展茉莉花种质创新和品种改良研究具有重要意义。
远缘杂交是指种以上分类单位生物类型之间的杂交，包括同属植物的种间杂交、不同属植物的属间杂交以及更高分类阶元物种之间的杂交，如亚族间杂交等。远缘杂交是植物种质创新和品种改良的重要途径之一，远缘杂交后代有明显的杂种优势，通过远缘杂交获得抗逆性强、观赏价值高的植物新品种是育种家追求的目标。但是，众多育种实践表明，由于各物种间存在不同程度的生殖隔离，使得远缘杂交在很多情况下都难以成功。远缘杂交障碍可划分为受精前障碍和受精后障碍，主要包括亲本的不育性、亲本的不可交配性或不亲和性、杂种胚与胚乳组织发育的不协调性以及由于杂种胚的降解或败育或杂种的不育而引起的杂种崩溃。
远缘杂交受精后障碍可通过幼胚挽救技术克服。幼胚挽救技术是在败育前取出幼胚（或胚珠）在适宜环境下培养，降低败育数，促进萌发，从而获得杂种的一种育种技术。幼胚挽救技术是一项技术难度比较大、各项操作规则要求都比较严格的工作，其工作过程中的每一个环节均受到很多因素的影响，这些因素的种类和取值的范围都会直接影响到培养的效果，因此，对这些因素的优化是植物幼胚挽救技术的永恒话题。根据现有的研究，胚挽救的主要影响因素包括以下几点：（1）亲本选择。（2）接种时间。胚的发育包括异养和自养两个阶段，第一阶段的胚需要从外界吸收营养物质及生长调节物质才能保障继续生长发育，当胚发育至心形胚晚期，转为自养阶段。因此，接种时间不当会影响胚挽救的结果，接种时间早，胚珠内合子胚发育不完全，培养难度大；时间晚，大部分合子胚开始败育或已完全败育，失去培养价值。（3）培养基。适宜培养基是促成幼胚发育成熟的关键环节之一。不同发育时期、不同物种需要的培养基各不相同。因此在培养过程需要多次重复试验以确定适合的培养基，以提高胚挽救成功率。（4）培养方式及条件。
幼胚挽救技术在新种质创制和新品种培育中得到迅猛发展，加快了植物育种进程，目前己在大田作物、果树、蔬菜等远缘杂交育种领域广泛应用。而国内外有关茉莉花杂交幼胚挽救的研究尚未见相关报道。
技术实现要素：
为克服现有技术的不足，本发明提供了一种利用幼胚挽救技术获得茉莉花种间杂交后代的方法，该方法能够克服茉莉花种间杂交障碍，提高茉莉花杂交育种成功率，缩短茉莉花杂交育种周期。
为实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
一种通过幼胚挽救技术获得茉莉花种间杂交后代的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）人工杂交授粉：挑选生长健壮、无病虫害、花器官发育正常的毛茉莉和菊花茉莉植株作为杂交母本和父本材料，取母本植株上花蕾己长大、次日可开放的花朵进行去雄、套袋，待柱头发育成熟后，在父本植株上采集当天开放花朵的成熟花粉进行人工授粉；
（2）幼胚消毒与预处理：在授粉35~40d后采集蒴果，先经自来水充分冲洗，在超净工作台上先后用70%酒精和l%次氯酸钠溶液消毒30s和25min，每次消毒后均用无菌水冲洗3~5次；在解剖镜下剥取幼胚，放入无菌的培养皿中加少量的无菌水进行高温预处理；
（3）幼胚挽救培养：将预处理后的幼胚接种到萌发培养基中，在25±2℃条件下先暗培养1周，再转入光照条件继续培养，直至幼胚萌发生长成幼苗；
（4）增殖扩繁培养：待幼苗生长健壮后，剪下顶芽和茎段，转入增殖培养基中培养进行扩繁，每3~4周继代培养一次；
（5）生根培养：选择2cm以上、具有完整叶片的无根苗接种到生根培养基中，在温度25±2℃、光照强度2500~3500lx、光照周期14~16h/d的条件下培养诱导生根；
（6）炼苗移栽：当试管苗长至3~4cm高，根长1~2cm时，打开瓶口在培养室内放置3~4d进行炼苗，然后取出试管苗洗去根部的培养基，移栽到基质（珍珠岩：泥炭土=1∶1）中，浇足水，盖上塑料薄膜，温度控制在20~25℃，湿度控制在80%以上。
步骤（1）中所述人工授粉的具体操作为：用干净的毛笔刷小心蘸取花粉，涂抹在母本已去雄花朵的柱头上，授粉后继续套袋隔离，重复授粉3次。
步骤（1）中所述高温预处理是指将幼胚在37℃条件下处理2d。
步骤（2）中所述萌发培养基的组成为：k2so41100~1300mg/l，nh4no3500~700mg/l，mgso4·7h2o350~390mg/l，kh2po4165~205mg/l，cacl2·2h2o450~500mg/l，na2-edta37~38mg/l，feso4·7h2o27.4~28.2mg/l，h3bo33.0~3.4mg/l，ki0.8~1.2mg/l，mnso4·4h2o7.8~8.4mg/l，znso4·7h2o2.7~3.3mg/l，na2moo4·2h2o0.2~0.3mg/l，cuso4·5h2o0.02~0.03mg/l，cocl2·6h2o0.04~0.06mg/l，肌醇60~100mg/l，盐酸吡哆醇0.4~0.6mg/l，盐酸硫胺素0.9~1.1mg/l，泛酸钙1.0~2.0mg/l，甘氨酸2.0~3.0mg/l，脯氨酸25~35mg/l，水解酪蛋白100~180mg/l，叶酸1.0-1.5mg/l，苯丙氨酸1.5-2.5mg/l，阿拉伯葡聚糖150-250mg/l，kt0.8-1.2mg/l，naa0.4-0.6mg/l，三十烷醇0.03-0.05mg/l，丁二酸4.0-6.0mg/l，柚皮苷1.8-2.2mg/l，β-巯基乙醇19-23mg/l，活性炭0.5-1.0g/l，蔗糖30-40g/l，琼脂6.5-7.5g/l，ph值5.5~6.0。
步骤（2）中所述光照条件为：光照强度1500~2500lx，光照周期11~13h/d。
步骤（3）中所述增殖培养基的组成为：wpm 6-ba0.5mg/l naa0.1mg/l 抗坏血酸2.5mg/l 蔗糖30g/l 琼脂7.0g/l，ph值5.5~6.0。
步骤（3）中所述培养条件为：温度25±2℃，光照强度3000~4000lx，光照周期14~16h/d。
步骤（4）中所述生根培养基的组成为：1/2ms iba0.5mg/l zt0.2mg/l 蔗糖30g/l 琼脂6.0g/l 活性炭2.0g/l，ph值5.5~6.0。
本发明的有益效果：
1）本发明选择了最佳胚龄进行幼胚挽救培养，并且在幼胚挽救培养前进行37℃高温预处理，有利于提高幼胚萌发率。
2）本发明设计了一种幼胚萌发培养基，通过调整培养基中的k2so4、nh4no3、mgso4·7h2o、kh2po4、cacl2·2h2o等物质浓度，筛选植物生长调节剂kt、naa、三十烷醇的最佳配比，以及添加苯丙氨酸、阿拉伯葡聚糖、丁二酸、柚皮苷、β-巯基乙醇、活性炭等，达到提高幼胚萌发率的目的。
3）本发明建立了一套完整的利用幼胚挽救技术获得茉莉花种间杂交后代的方法，为克服茉莉花远缘杂交受精后障碍，提高茉莉花杂交胚的萌发率提供了有效技术，也为茉莉花种间杂交育种的进一步研究奠定基础。
具体实施方式
实施例1
1.一种通过幼胚挽救技术获得茉莉花种间杂交后代的方法，包括以下步骤：
（1）人工杂交授粉：挑选生长健壮、无病虫害、花器官发育正常的毛茉莉和菊花茉莉植株作为杂交母本和父本材料，取母本植株上花蕾己长大、次日可开放的花朵进行去雄、套袋，待柱头发育成熟后，在父本植株上采集当天开放花朵的成熟花粉人工授粉，具体操作为：用干净的毛笔刷小心蘸取花粉，涂抹在母本已去雄花朵的柱头上，授粉后继续套袋隔离，重复授粉3次。
（2）幼胚消毒与预处理：在授粉35~40d后采集蒴果，先经自来水充分冲洗，在超净工作台上先后用70%酒精和l%次氯酸钠溶液消毒30s和25min，每次消毒后均用无菌水冲洗3~5次；在解剖镜下剥取幼胚，放入无菌的培养皿中加少量的无菌水进行高温预处理，即将幼胚在37℃条件下处理2d。
（3）幼胚挽救培养：将预处理后的幼胚接种到萌发培养基中，在25℃条件下暗培养1周，再转入光照条件（光照强度2000lx，光照周期12h/d）继续培养，直至幼胚萌发生长成幼苗；萌发培养基的组成为：k2so41200mg/l，nh4no3600mg/l，mgso4·7h2o370mg/l，kh2po4185mg/l，cacl2·2h2o475mg/l，na2-edta37.5mg/l，feso4·7h2o27.4~28.2mg/l，h3bo33.2mg/l，ki1.0mg/l，mnso4·4h2o8.1mg/l，znso4·7h2o3.0mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，cuso4·5h2o0.025mg/l，cocl2·6h2o0.05mg/l，肌醇80mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l，盐酸硫胺素1.0mg/l，泛酸钙1.5mg/l，甘氨酸2.5mg/l，脯氨酸30mg/l，水解酪蛋白140mg/l，叶酸1.3mg/l，苯丙氨酸2.0mg/l，阿拉伯葡聚糖200mg/l，kt1.0mg/l，naa0.5mg/l，三十烷醇0.04mg/l，丁二酸5.0mg/l，柚皮苷2.0mg/l，β-巯基乙醇21mg/l，活性炭0.75g/l，蔗糖35g/l，琼脂7.0g/l，ph值5.8。
（4）增殖扩繁培养：待幼苗生长健壮后，剪下顶芽和茎段，转入增殖培养基中培养进行扩繁，每3~4周继代培养一次；增殖培养基的组成为：wpm 6-ba0.5mg/l naa0.1mg/l 蔗糖30g/l 抗坏血酸2.5mg/l 琼脂7.0g/l，ph值5.8；培养条件为：温度25℃，光照强度3500lx，光照周期15h/d。
（5）生根培养：选择2cm以上、具有完整叶片的无根苗接种到生根培养基中，在温度25℃、光照强度3000lx、光照周期15h/d的条件下培养诱导生根；生根培养基的组成为：1/2ms iba0.5mg/l zt0.2mg/l 蔗糖30g/l 琼脂6.0g/l 活性炭2.0g/l，ph值5.8。
（6）炼苗移栽：当试管苗长至3~4cm高，根长1~2cm时，打开瓶口在培养室内放置3~4d进行炼苗，然后取出试管苗洗去根部的培养基，移栽到基质（珍珠岩：泥炭土=1∶1）中，浇足水，盖上塑料薄膜，温度控制在20~25℃，湿度控制在80%以上。
实施例2不同胚龄对幼胚萌发的影响
为了探明不同胚龄对幼胚萌发的影响，分别在杂交授粉20d、25d、30d、35d、40d后采集蒴果，剥取幼胚后进行幼胚挽救培养，每个处理接种70个幼胚，3次重复。接种培养50d后统计幼胚萌发率，结果见下表1。幼胚萌发率（%）=萌发种胚数/接种种胚数×100%。
由表1可以看出：不同胚龄对幼胚萌发率影响很大，太小的幼胚几乎不能萌发成苗，比如胚龄20d的萌发率仅为7.1%；随着胚龄增大幼胚萌发率也增大，其中胚龄为35d和40d的萌发率较为接近和稳定，并且显著高于胚龄为20d、25d和30d的萌发率。从较理想的萌发率及较高的时间效率上考虑，把最佳的胚龄确定在35d的胚龄。
实施例3不同预处理对幼胚萌发的影响
为了探明幼胚预处理方法对幼胚萌发的影响，在进行幼胚挽救培养之前，将幼胚取出放入无菌的培养皿中加少量的无菌水进行低温、高温预处理，并以25℃常温处理作对照，每个处理接种80个幼胚，3次重复。低温预处理是将幼胚在4℃条件下处理2d；高温预处理是将幼胚在37℃条件下处理2d；每组3次重复。然后将经过不同预处理的幼胚接种到萌发培养基中培养，50d后统计幼胚萌发率，结果见下表2。
由表2可以看出：高温预处理的幼胚萌发率达到67.5%，与对照的36.3%的萌发率相比有极大的提高，也明显高于低温预处理的42.5%的萌发率，说明对于茉莉花杂交胚而言，高温预处理是促进其萌发的有效方法。
实施例4培养基添加物对幼胚萌发的影响
1、不同浓度阿拉伯葡聚糖对幼胚萌发的影响
为了探明培养基中添加物阿拉伯葡聚糖对幼胚萌发的影响，分别将幼胚接种到添加不同浓度（0mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、400mg/l）阿拉伯葡聚糖的萌发培养基上培养，每个浓度处理接种60个幼胚，3次重复。接种培养50d后统计幼胚萌发率，结果见下表3。
由表3可以看出：随着阿拉伯葡聚糖浓度的增加，幼胚萌发率逐步提高，最大值为200mg/l浓度处理的68.3%，当其浓度增加至400mg/l时，萌发率反而降低至56.7%，说明200mg/l阿拉伯葡聚糖浓度是茉莉花种间杂交胚萌发的最佳浓度。
2、不同浓度丁二酸对幼胚萌发的影响
为了探明培养基中添加物丁二酸对幼胚萌发的影响，分别将幼胚接种到添加不同浓度（0mg/l、2.5mg/l、5.0mg/l、7.5mg/l、10.0mg/l）丁二酸的萌发培养基上培养，每个浓度处理接种60个幼胚，3次重复。接种培养50d后统计幼胚萌发率，结果见下表4。
由表4可以看出：随着丁二酸浓度由0到10.0mg/l逐渐增加，幼胚萌发率由对照的38.3%逐渐增加，5.0mg/l浓度处理下达到最大值65.0%，然后缓慢下降到7.5mg/l浓度处理的60.0%，最后降至10.0mg/l浓度处理的48.3%，说明一定浓度的丁二酸能够促进茉莉花种间杂交胚的萌发，且浓度不宜过高，5.0mg/l是最佳浓度。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
1.一种通过幼胚挽救技术获得茉莉花种间杂交后代的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）人工杂交授粉：挑选生长健壮、无病虫害、花器官发育正常的毛茉莉和菊花茉莉植株作为杂交母本和父本材料，取母本植株上花蕾己长大、次日可开放的花朵进行去雄、套袋，待柱头发育成熟后，在父本植株上采集当天开放花朵的成熟花粉进行人工授粉；
（2）幼胚消毒与预处理：在授粉35~40d后采集蒴果，先经自来水充分冲洗，在超净工作台上先后用70%酒精和l%次氯酸钠溶液消毒30s和25min，每次消毒后均用无菌水冲洗3~5次；在解剖镜下剥取幼胚，放入无菌的培养皿中加少量的无菌水进行高温预处理；
（3）幼胚挽救培养：将预处理后的幼胚接种到萌发培养基中，在25±2℃条件下先暗培养1周，再转入光照条件继续培养，直至幼胚萌发生长成幼苗；
（4）增殖扩繁培养：待幼苗生长健壮后，剪下顶芽和茎段，转入增殖培养基中培养进行扩繁，每3~4周继代培养一次；
（5）生根培养：选择2cm以上、具有完整叶片的无根苗接种到生根培养基中，在温度25±2℃、光照强度2500~3500lx、光照周期14~16h/d的条件下培养诱导生根；
（6）炼苗移栽：当试管苗长至3~4cm高，根长1~2cm时，打开瓶口在培养室内放置3~4d进行炼苗，然后取出试管苗洗去根部的培养基，移栽到基质（珍珠岩：泥炭土=1∶1）中，浇足水，盖上塑料薄膜，温度控制在20~25℃，湿度控制在80%以上。
2.根据权利要求1所述的一种通过幼胚挽救技术获得茉莉花种间杂交后代的方法，其特征在于，步骤（1）中所述人工授粉的具体操作为：用干净的毛笔刷小心蘸取花粉，涂抹在母本已去雄花朵的柱头上，授粉后继续套袋隔离，重复授粉3次。
3.根据权利要求1所述的一种通过幼胚挽救技术获得茉莉花种间杂交后代的方法，其特征在于，步骤（1）中所述高温预处理是指将幼胚在37℃条件下处理2d。
4.根据权利要求1所述的一种通过幼胚挽救技术获得茉莉花种间杂交后代的方法，其特征在于，步骤（2）中所述萌发培养基的组成为：k2so41100~1300mg/l，nh4no3500~700mg/l，mgso4·7h2o350~390mg/l，kh2po4165~205mg/l，cacl2·2h2o450~500mg/l，na2-edta37~38mg/l，feso4·7h2o27.4~28.2mg/l，h3bo33.0~3.4mg/l，ki0.8~1.2mg/l，mnso4·4h2o7.8~8.4mg/l，znso4·7h2o2.7~3.3mg/l，na2moo4·2h2o0.2~0.3mg/l，cuso4·5h2o0.02~0.03mg/l，cocl2·6h2o0.04~0.06mg/l，肌醇60~100mg/l，盐酸吡哆醇0.4~0.6mg/l，盐酸硫胺素0.9~1.1mg/l，泛酸钙1.0~2.0mg/l，甘氨酸2.0~3.0mg/l，脯氨酸25~35mg/l，水解酪蛋白100~180mg/l，叶酸1.0-1.5mg/l，苯丙氨酸1.5-2.5mg/l，阿拉伯葡聚糖150-250mg/l，kt0.8-1.2mg/l，naa0.4-0.6mg/l，三十烷醇0.03-0.05mg/l，丁二酸4.0-6.0mg/l，柚皮苷1.8-2.2mg/l，β-巯基乙醇19-23mg/l，活性炭0.5-1.0g/l，蔗糖30-40g/l，琼脂6.5-7.5g/l，ph值5.5~6.0。
5.根据权利要求1所述的一种通过幼胚挽救技术获得茉莉花种间杂交后代的方法，其特征在于，步骤（2）中所述光照条件为：光照强度1500~2500lx，光照周期11~13h/d。
6.根据权利要求1所述的一种通过幼胚挽救技术获得茉莉花种间杂交后代的方法，其特征在于，步骤（3）中所述增殖培养基的组成为：wpm 6-ba0.5mg/l naa0.1mg/l 抗坏血酸2.5mg/l 蔗糖30g/l 琼脂7.0g/l，ph值5.5~6.0。
7.根据权利要求1所述的一种通过幼胚挽救技术获得茉莉花种间杂交后代的方法，其特征在于，步骤（3）中所述培养条件为：温度25±2℃，光照强度3000~4000lx，光照周期14~16h/d。
8.根据权利要求1所述的一种通过幼胚挽救技术获得茉莉花种间杂交后代的方法，其特征在于，步骤（4）中所述生根培养基的组成为：1/2ms iba0.5mg/l zt0.2mg/l 蔗糖30g/l 琼脂6.0g/l 活性炭2.0g/l，ph值5.5~6.0。
技术总结