本发明涉及一种红皮云杉组织培养基及培养方法，属于植物培植技术领域。
背景技术：
云杉属植物高大通直，木质柔软且节少，纹理均匀美丽，结构整齐易加工，且具有良好的共鸣能力，而且在造纸用材、造林等领域都具有重要作用。然而，成年云杉属植物通过扦插或种子繁殖的效率很低，而组织培养难度大、诱导效率低。以上原因导致的育种难问题极大制约了云杉作为优良针叶树木的规模化应用。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种红皮云杉组织培养基及培养方法，解决了传统的种子繁殖、扦插繁殖等方式的繁殖率低、产率少等问题。
为解决上述技术问题，本发明提供一种红皮云杉组织培养基，包括：
愈伤组织诱导培养基：1/2lm培养基 2,4-d 6-ba naa 黄基水杨酸 丙酮酸钠 β-巯基乙醇 vorinostat trichostatina 5-azacytidine triton-100；
增殖培养基：ms基础培养基 6-ba naa γ-氨基丁酸 谷氨酰胺 β-巯基乙醇 维生素c 维生素b 三乙醇胺；
芽分化培养基：1/2lm naa 6-ba β-巯基乙醇 iba 维生素c 维生素b 柑橘果胶 黄原胶 乳酸。
优选地，所述2,4-d的浓度为0.05-1.00mg/l，6-ba的浓度为0.50-3.00mg/l，naa的浓度为0.05-5.15mg/l，黄基水杨酸的浓度为0.05-5.00μg/l，丙酮酸钠的浓度为0.05-5.15μg/l，β-巯基乙醇的终浓度为1：2000-8000，所述vorinostat为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，终浓度为0.1-10μmol/l，所述trichostatina为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，终浓度为1-100nmol/l，所述5-azacytidine为一种dna甲基化酶抑制剂，浓度为1-100μmol/l，所述triton-100的浓度为0.001%-1%。
优选地，所述6-ba的浓度为0.5-5.5mg/l，naa的浓度为0.1-10mg/l，γ-氨基丁酸的浓度为5-100μmol/l，谷氨酰胺的浓度为0.1-8μg/l，β-巯基乙醇的终浓度为1：2000-8000，维生素c的浓度为0.05-10μg/l，维生素b的浓度为0.05-10μg/l，三乙醇胺的浓度为0.1%-5%。
优选地，所述naa的浓度为0.05-10mg/l，6-ba的浓度为0.5-10mg/l，β-巯基乙醇的终浓度为1：3500-10000，iba的浓度为0.01-1mg/l，维生素c的浓度为0.0.5-10μg/l，维生素b的浓度为0.05-10μg/l，柑橘果胶的浓度为0.1-10g/l，黄原胶的浓度为0.05-10g/l，乳酸的浓度为0.5%-10%。
本发明提供一种红皮云杉组织培养方法，包括：
选择红皮云杉休眠芽、针叶或嫩茎做为外植体，并消毒处理；
诱导前将外植体浸泡到nacl溶液中进行预处理；
利用上述的愈伤组织诱导培养基进行愈伤组织诱导；
利用上述的增殖培养基进行愈伤组织的增殖；
利用上述的芽分化培养基进行诱导芽的分化。
优选地，在12月冬季采休眠芽；3月初春季取幼嫩针叶片和嫩茎。
优选地，所述休眠芽消毒处理方法为：休眠芽用清水冲洗后,送入无菌超净工作台，用75%酒精浸泡30秒后,迅速浸入无菌水，然后再用流动无菌水冲洗5次从而进行预处理消毒；然后采用10%naclo溶液浸泡3分钟进行深入消毒处理，naclo溶液中含有1%的吐温-20和2%的84消毒液；再浸入5%百菌清处理30分钟后，再浸入1%高锰酸钾溶液浸泡3分钟；无菌水冲洗5次后备用。
优选地，所述幼嫩针叶片和嫩茎的消毒处理方法为：75%酒精浸泡10秒，无菌水流水冲洗5次,再用0.1%的hgcl2浸泡10分钟，hgcl2中含有0.2%的吐温-20和5%的百菌清；无菌水冲洗5次并在超净台中用无菌纸吸干水分并晾干。
优选地，所述外植体预处理时，休眠芽浸泡到8g/lnacl溶液5分钟，针叶片和嫩茎浸泡到8g/lnacl溶液3分钟。
本发明所达到的有益效果：
（1）该发明中培养基的配方中分别使用了调节基因组dna甲基化酶的dna甲基化酶抑制剂5-azacytidine和调节乙酰化酶活性的组蛋白去乙酰化酶抑制剂vorinostat和trichostatina，这是由于组织培养过程中涉及到细胞分化的调节，其中很多基因表达发生改变，通过前期实验发现通过改变基因组表观遗传学的改变，尤其是促进细胞分裂素、生长素结合蛋白等植物细胞增殖分化过程中重要的相关基因的表达上调，有助于促进组织培养的高效进行。
（2）使用β-巯基乙醇这种还原剂降低组织培养过程中氧自由基对细胞的损伤，减轻细胞分化生长中的氧自由基含量。另外，由于γ-氨基丁酸是重要的植物生长促进剂，能促进植物对矿质元素的吸收；本发明研究发现其能加快植物愈伤组织形成的速度，添加γ-氨基丁酸后组培过程中植物组织中超氧物歧化酶(sod)水平上升，从而促进了组培的效率。因此从利用β-巯基乙醇抗氧化，和利用γ-氨基丁酸提高sod水平来抑制氧自由基对组培的抑制作用。
（3）在制作固体琼脂培养基的时候，除了使用基本配方的琼脂浓度外，还加入了果胶和黄原胶，主要是用于调整固体培养中的大分子骨架空间结构，为植物生根生长提供最适合固体培养基软硬度。
（4）本发明提供的方法基于组织培养的优越性，可以在最大程度上解决了传统的种子繁殖、扦插繁殖等方式的繁殖率低，产率少等问题，实现了红皮云杉的组织培养，并且以休眠芽为外植体的成功率最高，同时也提供了针叶、嫩茎等作为外植体的可能，使对红皮云杉的组织培养不仅限制于冬季采摘休眠芽，而且在春季依然可以通过采摘针叶、嫩茎而开展诱导。此外，该发明也为云杉属的其他植物组织培养提供了理论依据。该发明技术的规模化应用将带来巨大的生态和经济价值。
具体实施方式
下面对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明提供一种红皮云杉组织培养方法，包括以下步骤：
实施例1
步骤一、选择红皮云杉休眠芽、针叶、嫩茎等部分做为外植体，并消毒处理：
以休眠芽为外植体：在12月的冬季采休眠芽作为外植体。
消毒处理：休眠芽用清水冲洗后,送入无菌超净工作台，用75%酒精浸泡30秒后,迅速浸入无菌水，然后再用流动无菌水冲洗5次从而进行预处理消毒。然后采用10%naclo溶液(并同时含有1%的吐温-20，2%的84消毒液)浸泡3分钟进行深入消毒处理。再浸入5%百菌清处理30分钟后，再浸入1%高锰酸钾溶液浸泡3分钟。高锰酸钾不仅有杀菌功能，而且研究发现该步骤有助于后续愈伤组织形成效率的提高。无菌水冲洗5次,进行后续操作。
以嫩针叶片和嫩茎为外植体：3月的初春季节取幼嫩针叶片和嫩茎。
消毒处理：75%酒精浸泡10秒，无菌水流水冲洗5次,再用0.1%hgcl2(0.2%吐温-20，5%百菌清)浸泡10分钟后，无菌水冲洗5次并在超净台中用无菌纸吸干水分并晾干，以便进行后续操作。
步骤二、诱导前对外植体的预处理
在进行正式接种前，休眠芽还需再次浸泡到8g/lnacl溶液5分钟，针叶片和嫩茎浸泡到8g/lnacl溶液3分钟。该过程通过nacl的刺激，有助于后续愈伤组织形成。
步骤三、愈伤组织诱导培养的配制
愈伤组织诱导培养基的具体配方如下：1/2lm培养基 2,4-d(0.4mg/l) 6-ba(1.0mg/l) naa（0.3mg/l） 黄基水杨酸（0.1μg/l） 丙酮酸钠（0.5μg/l） β-巯基乙醇（终浓度1：2000） vorinostat(saha，一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，终浓度0.8μmol/l) trichostatina(tsa，一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，终浓度终40nmol/l) 5-azacytidine(5-aza，一种dna甲基化酶抑制剂1.2μmol/l) triton-100(0.01%)。
将步骤一、二中处理好的外植体接种到培养基。休眠芽接种一周以后可见绿色颗粒状突起,19天后,愈伤组织明显形成，呈黄绿色。针叶在接种后一周后,针叶变大变宽、并发生形态扭曲,高度平均增加约0.72cm，23天后可见切口处出现黄绿色颗粒愈伤组织。嫩茎接种后26天可见切口两端出现愈伤组织。总的结果显示：休眠芽、针叶、嫩枝都可以诱导愈伤组织,其中以休眠芽诱导速度最快（一周可见），且效率也最高（为81.12%）。
步骤四、增殖培养基配制与愈伤组织的增殖
增殖培养基成分包括：ms基础培养基 6-ba(2.0mg/l) naa（0.5mg/l） γ-氨基丁酸（gaba,50μmol/l） 谷氨酰胺（glutamine，0.8μg/l） β-巯基乙醇（终浓度1：2000） 维生素c（0.2μg/l） 维生素b（0.1μg/l） 三乙醇胺（0.1%）。
外植体接种1.5个月左右后，各组的愈伤组织都开始明显增殖。转接到增殖培养基,转接15天后,愈伤组织快速生长快，颜色变成深绿。
步骤五、芽分化培养基配制与诱导芽的分化
分化培养基配制成分如下：1/2lm naa(0.4mg/l) 6-ba(1.5mg/l) β-巯基乙醇（终浓度1：3500） iba（0.03mg/l） 维生素c（0.2μg/l） 维生素b（0.1μg/l） 柑橘果胶（0.2g/l） 黄原胶（0.1g/l） 乳酸（2%）。
在转接到培养基后能够分化出针叶和芽。休眠芽分化率为21.23%，针叶为10.11%，嫩茎为5.13%。休眠芽的分化效率最高。
实施例2
步骤一、选择红皮云杉休眠芽、针叶、嫩茎等部分做为外植体，并消毒处理：步骤同实施例1。
步骤二、诱导前对外植体的预处理：步骤同实施例1。
步骤三、愈伤组织诱导培养的配制：
愈伤组织诱导培养基的具体配方如下：1/2lm培养基 2,4-d(0.4mg/l) 6-ba(1.0mg/l) naa（0.3mg/l） 黄基水杨酸（0.1μg/l） 丙酮酸钠（0.7μg/l） β-巯基乙醇（终浓度1：2000） vorinostat(saha，一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，终浓度0.26μmol/l) trichostatina(tsa，一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，终浓度终20nmol/l) 5-azacytidine(5-aza，一种dna甲基化酶抑制剂2μmol/l) triton-100(0.01%)。
将步骤一、二中处理好的外植体接种到培养基。休眠芽接种一周以后可见绿色颗粒状突起,16天后,愈伤组织明显形成，呈黄绿色。针叶在接种后一周后,针叶变大变宽、并发生形态扭曲,高度平均增加约0.92cm，20天后可见切口处出现黄绿色颗粒愈伤组织。嫩茎接种后28天可见切口两端出现愈伤组织。总的结果显示：休眠芽、针叶、嫩枝都可以诱导愈伤组织,其中以休眠芽诱导速度最快（一周可见），且效率也最高（为83.13%）。
步骤四、增殖培养基配制与愈伤组织的增殖
增殖培养基成分包括：ms基础培养基 6-ba(3.0mg/l) naa（0.6mg/l） γ-氨基丁酸（gaba,40μmol/l） 谷氨酰胺（glutamine，0.9μg/l） β-巯基乙醇（终浓度1：2000） 维生素c（0.25μg/l） 维生素b（0.3μg/l） 三乙醇胺（0.15%）。
外植体接种1.5个月左右后，各组的愈伤组织都开始明显增殖。转接到增殖培养基,转接15天后,愈伤组织快速生长快，颜色变成深绿。
步骤五、芽分化培养基配制与诱导芽的分化
分化培养基配制成分如下：1/2lm naa(0.8mg/l) 6-ba(1.7mg/l) β-巯基乙醇（终浓度1：3500） iba（0.15mg/l） 维生素c（0.45μg/l） 维生素b（0.15μg/l） 柑橘果胶（0.35g/l） 黄原胶（0.18g/l） 乳酸（1%）。
在转接到培养基后能够分化出针叶和芽。休眠芽分化率为17.55%，针叶为10.56%，嫩茎为6.13%。休眠芽的分化效率最高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
1.红皮云杉组织培养基，其特征在于，包括：
愈伤组织诱导培养基：1/2lm培养基 2,4-d 6-ba naa 黄基水杨酸 丙酮酸钠 β-巯基乙醇 vorinostat trichostatina 5-azacytidine triton-100；
增殖培养基：ms基础培养基 6-ba naa γ-氨基丁酸 谷氨酰胺 β-巯基乙醇 维生素c 维生素b 三乙醇胺；
芽分化培养基：1/2lm naa 6-ba β-巯基乙醇 iba 维生素c 维生素b 柑橘果胶 黄原胶 乳酸。
2.根据权利要求1所述的红皮云杉组织培养基，其特征在于，所述2,4-d的浓度为0.05-1.00mg/l，6-ba的浓度为0.50-3.00mg/l，naa的浓度为0.05-5.15mg/l，黄基水杨酸的浓度为0.05-5.00μg/l，丙酮酸钠的浓度为0.05-5.15μg/l，β-巯基乙醇的终浓度为1：2000-8000，所述vorinostat为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，终浓度为0.1-10μmol/l，所述trichostatina为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，终浓度为1-100nmol/l，所述5-azacytidine为一种dna甲基化酶抑制剂，浓度为1-100μmol/l，所述triton-100的浓度为0.001%-1%。
3.根据权利要求1所述的红皮云杉组织培养基，其特征在于，所述6-ba的浓度为0.5-5.5mg/l，naa的浓度为0.1-10mg/l，γ-氨基丁酸的浓度为5-100μmol/l，谷氨酰胺的浓度为0.1-8μg/l，β-巯基乙醇的终浓度为1：2000-8000，维生素c的浓度为0.05-10μg/l，维生素b的浓度为0.05-10μg/l，三乙醇胺的浓度为0.1%-5%。
4.根据权利要求1所述的红皮云杉组织培养基，其特征在于，所述naa的浓度为0.05-10mg/l，6-ba的浓度为0.5-10mg/l，β-巯基乙醇的终浓度为1：3500-10000，iba的浓度为0.01-1mg/l，维生素c的浓度为0.0.5-10μg/l，维生素b的浓度为0.05-10μg/l，柑橘果胶的浓度为0.1-10g/l，黄原胶的浓度为0.05-10g/l，乳酸的浓度为0.5%-10%。
5.红皮云杉组织培养方法，其特征在于，包括：
选择红皮云杉休眠芽、针叶或嫩茎做为外植体，并消毒处理；
诱导前将外植体浸泡到nacl溶液中进行预处理；
利用权利要求1或2所述的愈伤组织诱导培养基进行愈伤组织诱导；
利用权利要求1或3所述的增殖培养基进行愈伤组织的增殖；
利用权利要求1或4所述的芽分化培养基进行诱导芽的分化。
6.根据权利要求5所述的红皮云杉组织培养方法，其特征在于，在12月冬季采休眠芽；3月初春季取幼嫩针叶片和嫩茎。
7.根据权利要求5所述的红皮云杉组织培养方法，其特征在于，所述休眠芽消毒处理方法为：休眠芽用清水冲洗后,送入无菌超净工作台，用75%酒精浸泡30秒后,迅速浸入无菌水，然后再用流动无菌水冲洗5次从而进行预处理消毒；然后采用10%naclo溶液浸泡3分钟进行深入消毒处理，naclo溶液中含有1%的吐温-20和2%的84消毒液；再浸入5%百菌清处理30分钟后，再浸入1%高锰酸钾溶液浸泡3分钟；无菌水冲洗5次后备用。
8.根据权利要求5所述的红皮云杉组织培养方法，其特征在于，所述幼嫩针叶片和嫩茎的消毒处理方法为：75%酒精浸泡10秒，无菌水流水冲洗5次,再用0.1%的hgcl2浸泡10分钟，hgcl2中含有0.2%的吐温-20和5%的百菌清；无菌水冲洗5次并在超净台中用无菌纸吸干水分并晾干。
9.根据权利要求5所述的红皮云杉组织培养方法，其特征在于，所述外植体预处理时，休眠芽浸泡到8g/lnacl溶液5分钟，针叶片和嫩茎浸泡到8g/lnacl溶液3分钟。
技术总结