本发明涉及组织培养及种苗高通量繁育技术领域，特别涉及一种花椒种苗的高通量繁育方法及培养基。
背景技术：
花椒(zanthoxylumbungeanummaxim)是人们喜爱的上等调味品和副食品加工的主要佐料，在国内外调味品市场中占有重要位置。花椒具有重要的经济价值，被广泛应用于食品、医药、日用化工工业。随着科技的发展，人们不断地开发花椒的新用途。然而，总的来看，虽然我国花椒产业的发展取得了很大的成绩，但仍处于初级开发阶段，资源尚未得到充分的开发利用。而植物组织培养对于花椒的良种快繁、脱毒苗培养、转基因植物培育、种质保存和香料有机物的提取等都有着十分重要的意义。
目前花椒主要采用种子繁育，此方法简单易行，群众易掌握，培育苗木时间短，苗木根系发达，生长健壮，寿命长，适应性强，但采用这种方法，常会因采种或调种不当，易于造成种质混杂，且后代常出现性状分离，无法保持母株的优良性状，影响经济效益。而采用无性繁育方法，如嫁接、扦插与组培等。能保证母体品种的优良遗传特性和经济性状，减少品种的分化和衰退、提高引进品种的适应性，扩大繁育和迅速推广优良品种。其中组织培养技术，主要是在室内进行种苗繁育，避免遭受天气因素的干扰，生长状态相对一致，利于集中管理，降低成本。并且以花椒愈伤组织作为外植体材料，通过丛生芽诱导或进行体细胞胚发生进行植株再生，能够摆脱对母株材料的限制，极大地提高花椒种苗的繁育效率，达到高通量繁育种苗的目的，而且利用大规模细胞培养可以对花椒的次生代谢物质进行生产，提高经济效益。因此组织培养技术对于花椒种苗繁育具有重要的实用价值。
申请公布号cn108496804a发明公开了一种无刺花椒组织培养初代诱导的方法，包括取外植体，外植体消毒，接种和诱导培养，通过优化取外植体、消毒处理、接种方式及诱导培养基，该方法有效抑制了无刺花椒外植体的内生菌产生，建立了无刺花椒组织培养初代诱导技术体系。其接种方法具体为：采用将茎段的上端插入到培养基中，腋芽浸没于培养基，茎段下端暴露在培养基表面外，培养基配方为含0mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、4.0mg/lzt，0.lmg/l植物抑菌剂ppm、6g/l卡拉胶和30g/l蔗糖的ms培养基。但该诱导培养基对花椒外植体的丛生芽诱导率偏低。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种花椒种苗的高通量繁育方法及培养基。本方法最终实现了只需要以带腋芽茎段为外植体，进行增殖分化，再生根成完整植株，提高了丛生芽诱导率，节省了初级诱导时间与材料，同时避免了初级诱导中内生菌污染的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种花椒种苗的高通量繁育方法，包括以下步骤：
将灭菌后的带腋芽茎段接种到丛生芽诱导培养基中进行丛生芽诱导，丛生芽诱导培养基为含有0.5～3.0mg/l6-ba、0.1～1.0mg/lnaa的ms培养基；
将丛生芽分株后接种到增殖生根培养基上进行增殖生根培养；增殖生根培养基为含有0.1～0.5mg/lnaa的1/2ms培养基。
作为优选，丛生芽诱导培养基为含有2.0mg/l6-ba、0.5mg/lnaa的ms培养基。
作为优选，增殖生根培养基为含有0.5mg/lnaa的1/2ms培养基。
作为优选，丛生芽诱导的条件为28±2℃、光照强度500～1000lux、光照周期12h/d。
作为优选，增殖生根培养的条件为28±2℃、光照强度1500～2500lux、光照周期12h/d。
优选地，增殖生根培养的条件为28±2℃、光照强度2000lux、光照周期12h/d。
作为优选，带腋芽茎段的长度为1～1.5cm。
作为优选，灭菌程序为：带腋芽茎段先用吐温-20清洗，然后用医用酒精消毒，最后用升汞灭菌。
在本发明提供的具体实施例中，灭菌程序为：首先将外植体置于容器内，加入吐温-203～4滴，用纱布封口进行流水冲洗10～30min；随后转到无菌操作台上，用75％酒精消毒30～50s后，无菌水洗涤3～4次；再用0.1％升汞灭菌4～8min，无菌水洗涤4～5次，无菌水每次洗涤1～2min，沥干水分。
本发明还提供了一种花椒种苗的高通量繁育培养基，包括丛生芽诱导培养基和增殖生根培养基；
丛生芽诱导培养基为含有0.5～3.0mg/l6-ba、0.1～1.0mg/lnaa的ms培养基；
增殖生根培养基为含有0.1～0.5mg/lnaa的1/2ms培养基。
作为优选，丛生芽诱导培养基为含有2.0mg/l6-ba、0.5mg/lnaa的ms培养基。
作为优选，增殖生根培养基为含有0.5mg/lnaa的1/2ms培养基。
本发明提供了一种花椒种苗的高通量繁育方法及培养基。该方法包括以下步骤：将灭菌后的带腋芽茎段接种到丛生芽诱导培养基中进行丛生芽诱导，所述丛生芽诱导培养基为含有0.5～3.0mg/l6-ba、0.1～1.0mg/lnaa的ms培养基；将丛生芽分株后接种到增殖生根培养基上进行增殖生根培养；所述增殖生根培养基为含有0.1～0.5mg/lnaa的1/2ms培养基。本发明具有如下技术效果：
本发明以不同外植体和培养基作为对照方法，与本发明方法在相同环境条件下进行培养，结果显示，只有以带腋芽茎段为外植体材料，才能诱导出丛生芽，获得丛生芽；以嫩叶、嫩茎与愈伤组织为外植体材料，在培养中逐渐褐化死亡，没有获得丛生芽或丛生芽，因此在花椒丛生芽诱导与丛生芽再生方面，本发明方法显著优于各对照方法。
本发明以带腋芽茎段为外植体材料及特定的诱导培养基，从而大大提高了丛生芽的分化率，缩短育苗周期，对日后的花椒种苗的高通量繁育与基因工程学研究具有重要意义。
附图说明
图1为本发明花椒种苗组培快繁技术方法的培养效果。
具体实施方式
本发明公开了一种花椒种苗的高通量繁育方法及培养基，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明涉及花椒组织培养及种苗高通量繁育技术领域，公开了一种以花椒带腋芽茎段为外植体的种苗快繁技术方法。本发明技术所述方法将花椒老茎上生出的嫩枝上带有腋芽的茎段摘取下来分成每节都有腋芽的1.0-1.5cm的茎段，经过消毒灭菌后，培养45d左右，诱导出丛生芽；首先对丛生芽进行增殖至长度达0.5cm左右，才能对丛生芽进行分芽，最后生根长成完整植株，以达到高通量繁育的目的。首先在含6-ba与naa的ms培养基上培养35至45天中，待腋芽逐渐膨大生成丛生芽，随后丛生芽将切下接在含6-ba与naa的ms培养基上进一步增殖成黄绿色的丛生芽团。其中丛生芽块继代在含naa的1/2ms培养基上培养30至40天后，丛生芽开始生根并展叶成完整植株，并可移栽入土。本方法最终实现了只需要以带腋芽茎段为外植体，进行增殖分化，再生根成完整植株，节省了初级诱导时间与材料，同时避免了初级诱导中内生菌污染的问题。这一花椒的离体再生方法，为日后花椒种苗的工厂化高通量繁育与基因工程育种研究提供了技术支撑。
本发明提供的花椒种苗的高通量繁育方法中所用培养基配方均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：本发明所述方法
截取花椒老茎上生出的嫩枝上带有腋芽的茎段，分成每节都有腋芽的1.0-1.5cm的茎段。首先将外植体装在三角瓶内，加入吐温-203-4滴，用洁净纱布封口进行流水冲洗10-30min，直至外植体表面泡沫冲洗干净。随后转到无菌操作台上，用75％酒精表面消毒30-50s后，无菌水洗涤3-4次，再用0.1％升汞灭菌4-8min，无菌水洗涤4-5次，无菌水每次洗涤1-2min，沥干水分后待接种。
将灭菌好的带腋芽茎段置于丛生芽诱导培养基上，28±2℃下暗光照(光照强度500-1000lux、光照周期12h/d)培养进行丛生芽诱导，培养基配方为ms 2.0mg/l6-苄氨基腺嘌呤(6-ba) 0.5mg/l萘乙酸(naa)。
将诱导出的丛生芽，进行分株后，接种到增殖生根培养基上，28±2℃下2000lux光照培养进行增殖生根，培养基配方为1/2ms 0.5mg/l萘乙酸(naa)。
本实施例组培快繁技术中各个时期的培养效果见图1。
对照例1：
以花椒嫩叶、嫩茎与愈伤组织为外植体，采用实施例1中培养方法，具体如下：
取花椒母株上的嫩叶、嫩茎作为外植体材料。首先将外植体装在三角瓶内，加入吐温-203-4滴，用洁净纱布封口进行流水冲洗10-30min，直至外植体表面泡沫冲洗干净。随后转到无菌操作台上，用75％酒精表面消毒30-50s后，无菌水洗涤3-4次，再用0.1％升汞灭菌4-8min，无菌水洗涤4-5次，每次无菌水洗涤1-2min，沥干水分后待接种。
将灭菌好的嫩叶置于丛生芽诱导培养基上，28±2℃下暗光照(光照强度500-1000lux、光照周期12h/d)培养进行丛生芽诱导，培养基配方为ms 2.0mg/l6-苄氨基腺嘌呤(6-ba) 0.5mg/l萘乙酸(naa)。只在嫩叶、嫩茎的周围诱导出淡黄色的愈伤组织。愈伤组织并未分化出丛生芽。
对照例2：
将实施例1中的丛生芽诱导培养基改为ms 1.0mg/l激动素(kt) 0.1mg/l萘乙酸(naa)。具体如下：
截取花椒老茎上生出的嫩枝上带有腋芽的茎段，分成每节都有腋芽的1.0-1.5cm的茎段。首先将外植体装在三角瓶内，加入吐温-203-4滴，用洁净纱布封口进行流水冲洗10-30min，直至外植体表面泡沫冲洗干净。随后转到无菌操作台上，用75％酒精表面消毒30-50s后，无菌水洗涤3-4次，再用0.1％升汞灭菌4-8min，无菌水洗涤4-5次，每次无菌水洗涤1-2min，沥干水分后待接种。
将灭菌好的茎段基部置于丛生芽诱导培养基上，28±2℃下暗光照(光照强度500-1000lux、光照周期12h/d)培养进行丛生芽诱导，培养基配方为ms 0.1mg/l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d) 0.5mg/l激动素(kt)。
将诱导出的丛生芽，进行分株后，接种到增殖生根培养基上，28±2℃下2000lux光照培养进行增殖生根，培养基配方为1/2ms 0.5mg/l萘乙酸(naa)。对照例3：
将实施例1中的丛生芽诱导培养基改为ms 0.1mg/l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d) 0.5mg/l激动素(kt)，增殖生根培养基改为1/2ms 1.0mg/l激动素(kt) 0.1mg/l萘乙酸(naa)。具体如下：
取花椒母株上的嫩叶、嫩茎与愈伤组织作为外植体材料。首先将外植体装在三角瓶内，加入吐温-203-4滴，用洁净纱布封口进行流水冲洗10-30min，直至外植体表面泡沫冲洗干净。随后转到无菌操作台上，用75％酒精表面消毒30-50s后，无菌水洗涤3-4次，再用0.1％升汞灭菌4-8min，无菌水洗涤4-5次，每次无菌水洗涤1-2min，沥干水分后待接种。
将灭菌好的嫩叶置于丛生芽诱导培养基上，28±2℃下暗光照(光照强度500-1000lux、光照周期12h/d)培养进行丛生芽诱导，培养基配方为ms 0.1mg/l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d) 0.5mg/l激动素(kt)。只在嫩叶、嫩茎的周围诱导出淡黄色的愈伤组织。愈伤组织并未分化出丛生芽。
对照例4：
将实施例1中的丛生芽诱导培养基改为ms 0.1mg/l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d) 0.5mg/l6-ba。具体如下：
截取花椒老茎上生出的嫩枝上带有腋芽的茎段，分成每节都有腋芽的1.0-1.5cm的茎段。首先将外植体装在三角瓶内，加入吐温-203-4滴，用洁净纱布封口进行流水冲洗10-30min，直至外植体表面泡沫冲洗干净。随后转到无菌操作台上，用75％酒精表面消毒30-50s后，无菌水洗涤3-4次，再用0.1％升汞灭菌4-8min，无菌水洗涤4-5次，每次无菌水洗涤1-2min，沥干水分后待接种。
将灭菌好的茎段基部置于丛生芽诱导培养基上，28±2℃下暗光照(光照强度500-1000lux、光照周期12h/d)培养进行丛生芽诱导，培养基配方为ms 0.1mg/l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d) 0.5mg/l6-ba。
将诱导出的丛生芽，进行分株后，接种到增殖生根培养基上，28±2℃下2000lux光照培养进行增殖生根，培养基配方为1/2ms 1.0mg/l6-苄氨基腺嘌呤(6-ba) 0.1mg/l萘乙酸(naa)。
对照例5：
参照cn108496804a发明中最优技术方案，将实施例1中的丛生芽诱导培养基改为ms 0.1mg/lnaa 4.0mg/lzt 0.lmg/lppm、6g/l卡拉胶 30g/l蔗糖。具体如下：
截取花椒老茎上生出的嫩枝上带有腋芽的茎段，分成每节都有腋芽的1.0-1.5cm的茎段。首先将外植体装在三角瓶内，加入吐温-203-4滴，用洁净纱布封口进行流水冲洗10-30min，直至外植体表面泡沫冲洗干净。随后转到无菌操作台上，用75％酒精表面消毒30-50s后，无菌水洗涤3-4次，再用0.1％升汞灭菌4-8min，无菌水洗涤4-5次，无菌水每次洗涤1-2min，沥干水分后待接种。
将灭菌好的带腋芽茎段置于丛生芽诱导培养基上，28±2℃下暗光照(光照强度500-1000lux、光照周期12h/d)培养进行丛生芽诱导，培养基配方为ms 0.1mg/lnaa 4.0mg/lzt 0.lmg/lppm、6g/l卡拉胶 30g/l蔗糖。
将诱导出的丛生芽，进行分株后，接种到增殖生根培养基上，28±2℃下2000lux光照培养进行增殖生根，培养基配方为1/2ms 0.5mg/l萘乙酸(naa)。
试验例1：对比试验
按照实施例1和对照例1-5的方法进行试验，统计丛生芽诱导率与丛生芽诱导情况，结果见表1。
表1不同培养方法丛生芽诱导率、丛生芽诱导率对比
由表1可以看出，采用本发明的以老茎上的侧芽基部为外植体再生获得完整植株的方法，增殖率达3-4倍以上。采用本发明所提供的愈伤诱导、丛生芽分化的培育方式，丛生芽分化率达92％左右，相比其他对照方法，为最优的培育方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.一种花椒种苗的高通量繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：
将灭菌后的带腋芽茎段接种到丛生芽诱导培养基中进行丛生芽诱导，所述丛生芽诱导培养基为含有0.5～3.0mg/l6-ba、0.1～1.0mg/lnaa的ms培养基；
将丛生芽分株后接种到增殖生根培养基上进行增殖生根培养；所述增殖生根培养基为含有0.1～0.5mg/lnaa的1/2ms培养基。
2.根据权利要求1所述的高通量繁育方法，其特征在于，所述丛生芽诱导培养基为含有2.0mg/l6-ba、0.5mg/lnaa的ms培养基。
3.根据权利要求1所述的高通量繁育方法，其特征在于，所述增殖生根培养基为含有0.5mg/lnaa的1/2ms培养基。
4.根据权利要求1所述的高通量繁育方法，其特征在于，所述丛生芽诱导的条件为28±2℃、光照强度500～1000lux、光照周期12h/d。
5.根据权利要求1所述的高通量繁育方法，其特征在于，所述增殖生根培养的条件为28±2℃、光照强度1500～2500lux、光照周期12h/d。
6.根据权利要求1所述的高通量繁育方法，其特征在于，所述带腋芽茎段的长度为1～1.5cm。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的高通量繁育方法，其特征在于，所述灭菌程序为：带腋芽茎段先用吐温-20清洗，然后用医用酒精消毒，最后用升汞灭菌。
8.一种花椒种苗的高通量繁育培养基，其特征在于，包括丛生芽诱导培养基和增殖生根培养基；
所述丛生芽诱导培养基为含有0.5～3.0mg/l6-ba、0.1～1.0mg/lnaa的ms培养基；
所述增殖生根培养基为含有0.1～0.5mg/lnaa的1/2ms培养基。
9.根据权利要求8所述的高通量繁育培养基，其特征在于，所述丛生芽诱导培养基为含有2.0mg/l6-ba、0.5mg/lnaa的ms培养基。
10.根据权利要求8或9所述的高通量繁育培养基，其特征在于，所述增殖生根培养基为含有0.5mg/lnaa的1/2ms培养基。
技术总结