本发明涉及大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法，属于植物离体培养
技术领域：
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：大花红景天(rhodiolacrenulata(hook.f.etthoms.)h.ohba.)是红景天属植物中的珍品，被誉为“高原人参”，为《中国药典》收录的唯一基原植物，野生资源主要生长于川西高原、西藏和滇西北海拔4000m以上高海拔山区的流石滩上或石缝中，其生境特殊、生长缓慢、繁殖困难、更新周期漫长。近年来，随着国内外市场需求量增加，红景天野生资源遭到掠夺式采挖，资源面临枯竭，大花红景天等红景天属多种植物已被列为国家ⅱ级濒危保护植物，因此，急需开展大花红景天的人工快速繁育工作。其中，通过愈伤组织诱导再分化可产生大量可分化的愈伤组织，是快速、大量繁育大花红景天的理想方案。目前，利用愈伤组织途径进行大花红景天的再生，普遍存在愈伤组织诱导率低、培养基成本高等问题，比如申请号为201710671226.8的专利《一种大花红景天的离体培养联合用培养基及离体培养方法》公开了一种采用大花红景天的离体培养方法。其采用叶片培养愈伤组织，而叶片需要在灭菌后进行培养，从而影响了其愈伤组织的诱导率和增值率，造成愈伤组织诱导率低的问题。本专利为经过种子培育无菌苗，优化后诱导愈伤组织的外植体为植株根颈顶端组织，不需二次消毒，减少外植体损伤，提高了愈伤组织诱导率、增殖率；本专利优化了愈伤组织诱导、生芽、生根的培养基及激素，形成了大花红景天根颈顶端组织再生植株技术，可快速实现工厂化种苗生产，降低种苗繁育成本。技术实现要素：针对大花红景天的离体培养方法，本发明解决的第一个技术问题是提供一种愈伤组织诱导率高且分化、增殖率高的离体培养方法。大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法，按以下步骤进行：a、取大花红景天种子，经消毒后，接种至无菌苗培养基中进行培养，获得无菌苗；b、选择无菌苗的根颈顶端组织为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基中培养，获得愈伤组织，再将愈伤组织转移至增殖培养基中进行继代培养；所述根颈顶端组织为根颈靠近芽端0.5～2cm的组织；c、选取继代培养的愈伤组织在分化培养基中进行诱导分化，获得丛生芽；并进行继代培养；d选取继代培养的丛生芽，将丛生芽从基部切开，将带有芽点的组织转接到生根培养基培养，得到生根无菌苗；e、将生根无菌苗培养至幼苗长出2～4片新叶，进行移栽，得到再生植株。在一种实施方式中，无菌苗培养基的配制方法为：以1/2ms培养基为基底，添加蔗糖和琼脂，再调整ph为5～6，即得；蔗糖添加量为1/2ms培养基总量的2.5～3.5wt％，琼脂添加量为1/2ms培养基总量的0.5～1.5wt％；愈伤组织诱导培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、2,4-d、6-ba、kt和iaa，再调整ph至5.5～6，即得；蔗糖添加量为ms培养基总量的2.5～3.5wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.5～1.5wt％；配制好的愈伤组织诱导培养基中，2,4-d的浓度为0.5～3.5mg·l-1、6-ba的浓度为1.0～3.5mg·l-1、kt的浓度为0.1～1mg·l-1、iaa的浓度为0.2～1mg·l-1；优选的，配制好的愈伤组织诱导培养基中，2,4-d的浓度为1.0～2.0mg·l-1、6-ba的浓度为1.0～2.0mg·l-1、kt的浓度为0.2～0.8mg·l-1、iaa的浓度为0.2～1.0mg·l-1；所述愈伤组织诱导培养基与增殖培养基相同；分化培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、6-ba和iaa，再调整ph至5.5～6；蔗糖添加量为ms培养基总量的2.5～3.5wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.8～1.0wt％；分化培养基中，6-ba的浓度为2.0～3.0mg·l-1、iaa的浓度为0.1～0.5mg·l-1；生根培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、iba、naa和iaa，再调整ph至5.5～6；蔗糖添加量为ms培养基总量的2.5～3.5wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.5～1.0wt％；生根培养基中，iba的浓度为0.5～1.5mg·l-1、naa的浓度为0.1～1.0mg·l-1、iaa的浓度为0.1～1.0mg·l-1。在一种具体的实施方式中：无菌苗培养基的配制方法为：以1/2ms培养基为基底，添加蔗糖和琼脂，再调整ph为5.4，即得；蔗糖添加量为1/2ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为1/2ms培养基总量的0.9wt％；愈伤组织诱导培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、2,4-d、6-ba、kt和iaa，再调整ph至5.8，即得；蔗糖添加量为ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.9wt％；配制好的愈伤组织诱导培养基中，2,4-d的浓度为1.5mg·l-1、6-ba的浓度为1.5mg·l-1、kt的浓度为0.5mg·l-1、iaa的浓度为0.20mg·l-1；分化培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、6-ba和iaa，再调整ph至5.8；蔗糖添加量为ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.9wt％；分化培养基中，6-ba的浓度为2.5mg·l-1、iaa的浓度为0.25mg·l-1；生根培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、iba、naa和iaa，再调整ph至5.8；蔗糖添加量为ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.8wt％；生根培养基中，iba的浓度为1.00mg·l-1、naa的浓度为0.20mg·l-1、iaa的浓度为0.50mg·l-1。在一种实施方式中：步骤a中，无菌苗培养条件为：湿度为70～80％；每天置于光照下10～14h，黑暗下10～14h；优选的，无菌苗培养条件为：每天置于光照下12h，黑暗下12h；步骤b中，愈伤组织培养条件为：湿度70～80％，每天置于光照下6～10h、黑暗下14～18h；所述愈伤组织的继代培养条件与愈伤组织培养条件相同；优选的，愈伤组织培养条件为：每天置于光照下8h、黑暗下16h；步骤c中，丛生芽培养条件为：湿度70～80％、每天置于光照下14～18h、黑暗下6～10h；所述丛生芽的继代培养条件与丛生芽培养条件相同；优选的，丛生芽培养条件为：每天置于光照下16h、黑暗下8h；步骤d中，生根无菌苗培养条件为：湿度70～80％、每天置于光照下10～14h、黑暗下10～14h；优选的，生根无菌苗培养条件为：每天置于光照下12h、黑暗下12h；其中，所述光照时，光照强度2000～2500lx，环境温度为20±1℃；黑暗时，环境温度为10±1℃。在一种实施方式中：步骤a中，种子消毒方法为：取大花红景天种子，用灭菌的水浸湿后，流水冲洗，再吸干种子表面水分；再在无菌条件下，用酒精浸泡20～30s，无菌水冲洗5～6次，吸干种子表面水分，用hgcl溶液浸泡6～8min，无菌水冲洗5～6次，吸干种子表面水分，在超净工作台接种至无菌苗培养基；优选的，酒精浓度为75％；hgcl溶液的浓度为0.1wt％。在一种实施方式中：步骤b中，种子播种后，选择生长25～30d的无菌苗的根颈顶端组织用于诱导愈伤组织；将愈伤组织转移至增殖培养基中进行继代增殖时，选取根颈顶端组织诱导18～25d的愈伤组织；优选诱导时间为20～22d的愈伤组织。在一种实施方式中：步骤c中，选择疏松颗粒状的愈伤组织诱导丛生芽；优选的，选取继代次数为3代的继代培养的愈伤组织诱导丛生芽，以20～22d为一代。在一种实施方式中：步骤c中，丛生芽继代培养的方法为：按照丛生芽的培养方法，30d后进行继代培养，以25～30d为一代，继代2次，获得植株健壮、基生叶多的大花红景天丛生芽。在一种实施方式中：步骤d中，选择植株健壮、基生叶多的丛生芽用来培养生根无菌苗；优选的，选择继代2次的丛生芽用来培养生根无菌苗。在一种实施方式中：步骤e中，将生根无菌苗转瓶培养20～25d得到加强生根苗，待苗高2～3cm时打开瓶口在大花红景天适宜区域，室温下炼苗7～14d后，然后用蒸馏水清洗根部，移入盛有基质的穴盘中，在湿度65～75％的条件下，遮阳度为60～65％条件下培养，待幼苗长出2～4片新叶，移栽至大田；其中，转瓶培养的培养基与生根培养基一致。本发明的有益效果：1、本专利为经过种子培育无菌苗，筛选并优化无菌苗外植体，优化后外植体为植株地上根颈顶端组织，不需二次消毒，减少外植体损伤，提高了愈伤组织诱导率和增殖率。2、本专利采用根茎顶端作为外植体诱导愈伤组织，出愈率高达98％，诱导成的愈伤组织增殖率可达到40倍。3、本发明整个培养的不同阶段的培养基，选用特定的诱导激素，成本低，培养效果好。4、本发明的方法可以快速获得大花红景天再生植株，实现工厂化种苗生产。附图说明图1为采用大花红景天的根茎顶端为外植体诱导愈伤组织实物图；图2为采用大花红景天的叶片为外植体诱导愈伤组织实物图；图3为采用大花红景天的茎段为外植体诱导愈伤组织实物图；图4为大花红景天不同外植体诱导愈伤组织比较(a为茎、b为根颈顶端组织、c为叶)；图5为大花红景天丛生芽诱导过程图；其中a为愈伤组织，b为丛生芽诱导，c为丛生芽的继代培养；图6为大花红景天生根诱导实物图。具体实施方式大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法，按以下步骤进行：a、取大花红景天种子，经消毒后，接种至无菌苗培养基中进行培养，获得无菌苗；b、选择无菌苗的根颈顶端组织为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基中培养，获得愈伤组织，再将愈伤组织转移至增殖培养基中进行继代培养；所述根颈顶端组织为根颈靠近芽端0.5～2cm的组织；c、选取继代培养的愈伤组织在分化培养基中进行诱导分化，获得丛生芽；并进行继代培养；d选取继代培养的丛生芽，将丛生芽从基部切开，将带有芽点的组织转接到生根培养基培养，得到生根无菌苗；e、将生根无菌苗培养至幼苗长出2～4片新叶，进行移栽，得到再生植株。其中，本发明所述的大花红景天种子为：8～9月采集的成熟种子，并于室内自然干燥，阴凉保存。本发明经过种子培育无菌苗，筛选无菌苗外植体，优化后外植体为植株根颈顶端组织，不需二次消毒，减少外植体损伤，提高愈伤组织诱导率和增殖率。选用植株根颈顶端组织进行诱导，相比于叶片和茎段，其诱导率更高。在一种实施方式中：无菌苗培养基的配制方法为：以1/2ms培养基为基底，添加蔗糖和琼脂，再调整ph为5～6，即得；蔗糖添加量为1/2ms培养基总量的2.5～3.5wt％，琼脂添加量为1/2ms培养基总量的0.5～1.5wt％；愈伤组织诱导培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、2,4-d、6-ba、kt和iaa，再调整ph至5.5～6，即得；蔗糖添加量为ms培养基总量的2.5～3.5wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.5～1.5wt％；配制好的愈伤组织诱导培养基中，2,4-d的浓度为0.5～3.5mg·l-1、6-ba的浓度为1.0～3.5mg·l-1、kt的浓度为0.1～1.0mg·l-1、iaa的浓度为0.2～1.0mg·l-1；优选的，配制好的愈伤组织诱导培养基中，2,4-d的浓度为1.0～2.0mg·l-1、6-ba的浓度为1.0～2.0mg·l-1、kt的浓度为0.2～0.8mg·l-1、iaa的浓度为0.2～1.0mg·l-1；所述愈伤组织诱导培养基与增殖培养基相同；分化培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、6-ba和iaa，再调整ph至5.5～6；蔗糖添加量为ms培养基总量的2.5～3.5wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.8～1.0wt％；分化培养基中，6-ba的浓度为2.0～3.0mg·l-1、iaa的浓度为0.1～0.5mg·l-1；所述丛生芽的继代培养基与分化培养基相同。生根培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、iba、naa和iaa，再调整ph至5.5～6；蔗糖添加量为ms培养基总量的2.5～3.5wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.5～1.0wt％；生根培养基中，iba的浓度为0.5～1.5mg·l-1、naa的浓度为0.1～1.0mg·l-1、iaa的浓度为0.1～1.0mg·l-1。在一种具体的实施方式中：为了提高出芽率，无菌苗培养基的配制方法为：以1/2ms培养基为基底，添加蔗糖和琼脂，再调整ph为5.4，即得；蔗糖添加量为1/2ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为1/2ms培养基总量的0.9wt％；为了提高诱导率，愈伤组织诱导培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、2,4-d、6-ba、kt和iaa，再调整ph至5.8，即得；蔗糖添加量为ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.9wt％；配制好的愈伤组织诱导培养基中，2,4-d的浓度为1.5mg·l-1、6-ba的浓度为1.5mg·l-1、kt的浓度为0.5mg·l-1、iaa的浓度为0.20mg·l-1；分化培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、6-ba和iaa，再调整ph至5.8；蔗糖添加量为ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.9wt％；分化培养基中，6-ba的浓度为2.5mg·l-1、iaa的浓度为0.25mg·l-1；生根培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、iba、naa和iaa，再调整ph至5.8；蔗糖添加量为ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.8wt％；生根培养基中，iba的浓度为1.00mg·l-1、naa的浓度为0.20mg·l-1、iaa的浓度为0.50mg·l-1。其中，2,4-d具体指生长素2,4-二氯苯氧乙酸；6-ba具体指6-苄基嘌呤；kt具体指激动素；iaa具体指吲哚乙酸；iba具体指吲哚丁酸；naa具体指萘乙酸。所述1/2ms、ms培养基配方见表1、表2所示：表11/2ms培养基配方表2ms培养基配方在一种实施方式中：步骤a中，无菌苗培养条件为：湿度为70～80％；每天置于光照下10～14h，黑暗下10～14h；优选的，无菌苗培养条件为：每天置于光照下12h，黑暗下12h；步骤b中，愈伤组织培养条件为：湿度70～80％，每天置于光照下6～10h、黑暗下14～18h；优选的，愈伤组织培养条件为：每天置于光照下8h、黑暗下16h；所述愈伤组织的继代培养条件与愈伤组织培养条件相同；步骤c中，丛生芽培养条件为：湿度70～80％、每天置于光照下14～18h、黑暗下6～10h；优选的，丛生芽培养条件为：每天置于光照下16h、黑暗下8h；所述丛生芽的继代培养条件与丛生芽培养条件相同；步骤d中，生根无菌苗培养条件为：湿度70～80％、每天置于光照下10～14h、黑暗下10～14h；优选的，生根无菌苗培养条件为：每天置于光照下12h、黑暗下12h；其中，上述步骤在光照下时，光照强度2000～2500lx，环境温度为20±1℃；黑暗下时，环境温度为10±1℃。在一种实施方式中，步骤a中，种子消毒方法为：取大花红景天种子，用灭菌的水浸湿后，流水冲洗，再吸干种子表面水分；再在无菌条件下，用酒精浸泡20～30s，无菌水冲洗5～6次，吸干种子表面水分，用hgcl溶液浸泡6～8min，无菌水冲洗5～6次，吸干种子表面水分，在超净工作台接种至无菌苗培养基；优选的，酒精浓度为75％；hgcl溶液的浓度为0.1wt％。在一种实施方式中：步骤a中，种子播种后，5d后开始发芽，15d后形成无菌苗。选择生长25～30d的无菌苗的根颈顶端组织用于诱导愈伤组织。步骤b中，无菌苗的根颈顶端组织接种于愈伤组织诱导培养基中培养，9～10d即开始产生愈伤组织，18d后产生的愈伤组织为黄绿色呈颗粒状，增殖迅速，且组织结构比较紧密，有利于进一步分化培养。将愈伤组织转移至增殖培养基中进行继代培养时，选取根颈顶端组织诱导18～25d的愈伤组织；优选的诱导时间为20～22d的愈伤组织。以20～22d为一代，愈伤组织连续增殖三代后得到大量的所述的疏松颗粒状愈伤组织。在一种实施方式中，步骤c中，选择愈伤组织连续增殖三代后的愈伤组织诱导丛生芽，培养18～20d开始出芽，30d左右可获得大花红景天丛生芽。按照丛生芽的培养方法，30d后进行丛生芽的继代培养，以25～30d为一代，继代2次，获得植株健壮、基生叶多的大花红景天丛生芽。在一种实施方式中，步骤d中，选取的继代培养次数为2次的丛生芽诱导生根。更优选的，选取继代培养2次中的叶片发育完整、厚实、基生叶多的丛生芽。经过25～30d培养，丛生芽基部开始有根系形成，45d后可形成大花红景天生根无菌苗。在一种实施方式中，步骤d中，将生根无菌苗转瓶培养20～25d得到加强生根苗，待苗高2～3cm时打开瓶口，在大花红景天适宜区域，室温下炼苗5～14d后，然后用蒸馏水清洗根部，移入盛有基质的穴盘中，在湿度65～75％的条件下，遮阳度为60～65％条件下培养，待幼苗长出2～4片新叶，移栽至大田；其中，转瓶培养的培养基与生根培养基一致。其中在具体的实施方式中，所述育苗基质可以为：耕作土、腐熟牛粪、蛭石按照4:2:1配置育苗基质。所述大花红景天适宜区域优选为青藏高原海拔3000～3800m。下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例1一、培养基的配制无菌苗培养基的配制方法为：以1/2ms培养基为基底，添加蔗糖和琼脂，再调整ph为5.4，即得；蔗糖添加量为1/2ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为1/2ms培养基总量的0.9wt％；愈伤组织诱导培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、2,4-d、6-ba、kt和iaa，再调整ph至5.8，即得；蔗糖添加量为ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.9wt％；配制好的愈伤组织诱导培养基中，2,4-d的浓度为1.5mg·l-1、6-ba的浓度为1.5mg·l-1、kt的浓度为0.5mg·l-1、iaa的浓度为0.20mg·l-1；所述愈伤组织诱导培养基与增殖培养基相同；分化培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、6-ba和iaa，再调整ph至5.8；蔗糖添加量为ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.9wt％；分化培养基中，6-ba的浓度为2.5mg·l-1、iaa的浓度为0.25mg·l-1；生根培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、6-ba和iaa，再调整ph至5.8；蔗糖添加量为ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.8wt％；分化培养基中，iba的浓度为1.00mg·l-1、naa的浓度为0.20mg·l-1、iaa的浓度为0.50mg·l-1。二、培养方法1、大花红景天种子收集与保存8月～9月采集大花红景天成熟的种子，室内自然干燥，并阴凉保存。2、大花红景天种子无菌苗培养2.1种子消毒取去除杂质且饱满的红景天种子，用灭菌的蒸馏水浸湿后，流水冲洗30分钟，无菌滤纸吸干种子表面水分。无菌条件下，用75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗6次，滤纸擦干，用0.1％hgcl浸泡5min，无菌水冲洗6次，滤纸擦干吸干，在超净工作台接种至培养基。2.2无菌苗培养将2.1处理后的种子接种至无菌苗培养基中进行培养。培养条件：湿度75％、每天光照下12h(光照强度为2000lx，环境温度为20±1℃)，黑暗下12h(黑暗时：环境温度为10±1℃)。3、愈伤组织诱导及增殖培养3.1愈伤组织诱导选择采用2.2培养方法培养25d的大花红景天无菌苗，取无菌苗的根颈顶端组织为外植体，在愈伤组织诱导培养基中进行培养。培养条件：湿度75％、每天光照下8h(其中，光照时，光照强度2000lx，环境温度为20±1℃)、黑暗下16h(环境温度为10±1℃)。培养9～10d开始产生愈伤组织，18～20d后产生的愈伤组织黄绿色呈颗粒状，增殖迅速，且组织结构比较紧密，有利于进一步分化培养。3.2愈伤组织的增殖选择3.1培养的大花红景天根颈顶端组织作为外植体诱导20d左右的愈伤组织，在增殖培养基进行增殖培养；培养条件：湿度75％、每天光照下8h，光照强度2000lx，环境温度为20±1℃、黑暗下16h(环境温度10℃±1℃)。以20～22d为一代，连续增殖三代得到大量的所述的疏松颗粒状愈伤组织。4、大花红景天丛生芽分化诱导4.1丛生芽诱导以3.2继代培养的愈伤组织，在分化培养基中进行诱导分化。培养条件：湿度75％、每天光照16h(其中，光照强度2000lx，环境温度：20±1℃)、黑暗8h(环境温度10℃±1℃)，培养18～20d开始出芽，30d左右可获得大花红景天丛生芽。4.2继代培养按照4.1中培养，30d后应转瓶进行继代培养(继代培养基与分化培养基相同)，继代培养30d，以30d为一代，连续继代2次，可诱导获得的丛生芽植株健壮、基生叶多的大花红景天丛生芽。5、大花红景天丛生芽生根培养以4.2中分化、继代培养2次丛生芽，选择叶片发育完整、厚实、基生叶多的丛生芽，将丛生芽从基部切开，将带有芽点的组织转接到生根培养基。培养条件：湿度75％、每天光照12h(其中，光照强度为2000lx，环境温度：20±1℃)、黑暗12h(环境温度：10℃±1℃)。经过25～30d丛生芽基部开始有根系形成，45d后可形成大花红景天生根无菌苗。6、大花红景天再生苗移栽将5中无菌苗转瓶培养20d左右得到加强生根苗，待苗高2～3cm时打开瓶口在大花红景天适宜区域(青藏高原海拔3000～3800m)室温下炼苗5～7d后，然后用蒸馏水清洗根部，移入盛有基质的穴盘中，在湿度65～75％，遮阳度为60～65％的条件下散光培养，待幼苗长出3～4片新叶，进行移栽。对比例1(用叶片培养愈伤组织)在实施例1的基础上，仅步骤二(培养方法)中的3.1(愈伤组织诱导)步骤不同，其余工艺包括培养基的配制以及培养方法均与实施例1一致。本对比例愈伤组织诱导步骤为：选择采用2.2培养方法培养25d的大花红景天无菌苗，取大花红景天叶片组织为外植体，在愈伤组织培养基中进行培养，培养条件：湿度75％、每天光照强度2000lx光照8h(20±1℃)、16h黑暗(10℃±1℃)。培养9～10d开始出现愈伤，23～25d后产生的愈伤组织黄绿色呈颗粒状。对比例2(用茎段培养愈伤组织)在实施例1的基础上，仅步骤二(培养方法)中3.1(愈伤组织诱导)步骤不同，其余工艺包括培养基的配制以及培养方法均与实施例1一致。本对比例愈伤组织诱导步骤为：选择采用2.2培养方法培养25d的大花红景天无菌苗，取大花红景天茎段组织为外植体，在愈伤组织培养基中进行培养，培养条件：湿度75％、每天光照强度2000lx光照8h(20±1℃)、16h黑暗(10℃±1℃)。培养12～13d开始出现愈伤，切口处增厚且颗粒状，22～25d后产生的愈伤组织黄绿色呈颗粒状，形态较小。对比例3(直接取田里的大花红景天的根颈顶端组织进行消毒后，用于培养愈伤组织)在实施例1的基础上，仅步骤二(培养方法)中的步骤1(大花红景天种子收集与保存)和步骤2(大花红景天种子无菌苗培养)不同，其余工艺包括培养基的配制以及培养方法与实施例1一致。将实施例1的培养方法中的步骤1和2修改为：取大花红景天地上根颈顶端组织，灭菌后，作为外植体，再按实施例1的步骤二(培养方法)中的步骤3(愈伤组织诱导及增殖培养)进行操作。选择灭菌后的大花红景天根颈顶端组织为外植体，在愈伤组织诱导培养基中进行培养，培养条件：湿度75％、每天光照强度2000lx，8h(20±1℃)、16h黑暗(10℃±1℃)。培养9～10d开始出现愈伤，切口处增厚且颗粒状，18～20d后产生的愈伤组织黄绿色呈颗粒状，增殖迅速，团块大，且组织结构比较紧密。试验例1按实施例1、对比例1～2不同外植体诱导愈伤组织的试验方法进行试验，共进行5次重复试验，统计其诱导率如表3所示。表3不同外植体诱导愈伤组织的诱导率即出愈率通过试验，由表3可见：大花红景天茎、叶片、根颈顶端3种组织作为外植体诱导愈伤组织，具有显著性差异，愈伤组织平均诱导率以根颈顶端组织最大86.83％、叶片次之61.80％、茎最低56.00％。试验过程中，根颈顶端组织最高可达98％。愈伤组织转入继代培养基后，继代培养20～22d后，愈伤组织团块以根颈顶端组织外植体为佳，愈伤组织呈颗粒状，分化、增殖速度快，根颈顶端组织诱导的愈伤组织块体积是叶片诱导的2～4倍；是茎诱导的4～6倍。以大花红景天根颈顶端组织诱导的愈伤组织诱导丛生芽，诱导率为85～90％，丛生芽诱导生根诱导率平均为72.00％，最高可达86％。试验例2按实施例1、对比例3的方法进行试验，共进行5次重复试验；统计不同处理方法得到的根茎顶端组织诱导愈伤组织的诱导率如表4所示。表4不同外植体诱导愈伤组织的诱导率即出愈率外植体出愈率说明田间大花红景天根颈顶端组织46±5.83诱导过程中外植体发霉率较高，诱导率低，增殖速度慢无菌苗根颈顶端组织86.83±8.01发霉率低，诱导率高实施例2不同培养基基底及ph值对无菌苗发芽率的影响按照下表5配制不同的无菌苗培养基，再取实施例1中步骤2.1(种子消毒)处理后的大花红景天种子按照实施例1中的2.2(无菌苗培养)进行培养。每组试验各使用100颗种子，共进行三次重复试验。培养5d后，观察不同培养基的发芽率，其中，发芽率＝发芽的种子数/播种的种子数*100％。经统计后，发芽率具体数值如下表5所示。表5培养基基底、ph值对无菌苗发芽的影响由表5可见，ph值对大花红景天无菌苗获得具有重要影响，通过试验确定以1/2ms培养基，ph5.4进行种子无菌培养，发芽率最高。实施例3按照下表6和表7配制不同的愈伤组织诱导培养基。再选择实施例1中2.2(无菌苗培养)培养25d的大花红景天无菌苗的根颈顶端组织为外植体，在不同的愈伤组织诱导培养基中进行培养，培养条件：湿度75％、每天光照强度2000lx光照8h(20±1℃)、16h黑暗(10℃±1℃)。愈伤组织诱导培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、2,4-d、6-ba、kt和iaa，再调整ph至5.8，即得；其中，蔗糖添加量为ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.9wt％；2,4-d、6-ba、kt和iaa的浓度如下表6和表7所示。不同培养基分别进行5次重复试验。培养25d天后，计算不同培养基的诱导率，如下表7所示。本实验设置4因素4水平试验，如下表6所示；不同培养基的诱导率如表7所示；正交试验极差分析如表8所示。表6因素水平表表7不同激素水平对大花红景天愈伤组织诱导率表8正交试验极差分析激素筛选结果表明，1)正交试验a11组(a2b3c4d4)优势明显，出愈为95.00％，2)正交试验极差分析表明，最优获得的愈伤组织的激素组合为a2b2c3d2，对愈伤组织诱导影响大小依次：iaa＞kt＞2,4-d＞6-ba，其中iaa对出愈率影响最大。改变iaa的用量制得3组不同的愈伤组织诱导培养基，再选择实施例1中2.2培养25d的大花红景天无菌苗根颈顶端组织为外植体，在愈伤组织培养基中进行培养，不同培养基分别进行5次重复试验。培养条件：湿度75％、每天光照强度2000lx光照8h(20±1℃)、16h黑暗(10℃±1℃)。对应的出愈率及愈伤组织形态如下表9所示：表9iaa浓度对愈伤组织出愈率优化试验表明，3种浓度的iaa对愈伤组织出愈率无显著差异(p＝0.99＞0.05)；iaa为0.50mg·l-1时愈伤组织诱导后易老化褐变；0.2mg·l-1愈伤组织呈颗粒状、形态小；0.25mg·l-1愈伤组织呈颗粒状，增殖迅速。当前第1页1 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技术特征：1.大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法，其特征在于，按以下步骤进行：
a、取大花红景天种子，经消毒后，接种至无菌苗培养基中进行培养，获得无菌苗；
b、选择无菌苗的根颈顶端组织为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基中培养，获得愈伤组织，再将愈伤组织转移至增殖培养基中进行继代培养；所述根颈顶端组织为根颈靠近芽端0.5～2cm的组织；
c、选取继代培养的愈伤组织在分化培养基中进行诱导分化，获得丛生芽；并进行继代培养；
d选取继代培养的丛生芽，将丛生芽从基部切开，将带有芽点的组织转接到生根培养基培养，得到生根无菌苗；
e、将生根无菌苗培养至幼苗长出2～4片新叶，进行移栽，得到再生植株。
2.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法，其特征在于，
无菌苗培养基的配制方法为：以1/2ms培养基为基底，添加蔗糖和琼脂，再调整ph为5～6，即得；蔗糖添加量为1/2ms培养基总量的2.5～3.5wt％，琼脂添加量为1/2ms培养基总量的0.5～1.5wt％；
愈伤组织诱导培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、2,4-d、6-ba、kt和iaa，再调整ph至5.5～6.0，即得；蔗糖添加量为ms培养基总量的2.5～3.5wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.5～1.5wt％；配制好的愈伤组织诱导培养基中，2,4-d的浓度为0.5～3.5mg·l-1、6-ba的浓度为1.0～3.5mg·l-1、kt的浓度为0.1～1.0mg·l-1、iaa的浓度为0.2～1.0mg·l-1；优选的，配制好的愈伤组织诱导培养基中，2,4-d的浓度为1.0～2.0mg·l-1、6-ba的浓度为1.0～2.0mg·l-1、kt的浓度为0.2～0.8mg·l-1、iaa的浓度为0.2～1.0mg·l-1；
所述愈伤组织诱导培养基与增殖培养基相同；
分化培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、6-ba和iaa，再调整ph至5.5～6；蔗糖添加量为ms培养基总量的2.5～3.5wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.8～1.0wt％；分化培养基中，6-ba的浓度为2.0～3.0mg·l-1、iaa的浓度为0.1～0.5mg·l-1；
生根培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、iba、naa和iaa，再调整ph至5.5～6；蔗糖添加量为ms培养基总量的2.5～3.5wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.5～1.0wt％；生根培养基中，iba的浓度为0.5～1.5mg·l-1、naa的浓度为0.1～1.0mg·l-1、iaa的浓度为0.1～1.0mg·l-1。
3.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法，其特征在于，
无菌苗培养基的配制方法为：以1/2ms培养基为基底，添加蔗糖和琼脂，再调整ph为5.4，即得；蔗糖添加量为1/2ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为1/2ms培养基总量的0.9wt％；
愈伤组织诱导培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、2,4-d、6-ba、kt和iaa，再调整ph至5.8，即得；蔗糖添加量为ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.9wt％；配制好的愈伤组织诱导培养基中，2,4-d的浓度为1.5mg·l-1、6-ba的浓度为1.5mg·l-1、kt的浓度为0.5mg·l-1、iaa的浓度为0.20mg·l-1；
分化培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、6-ba和iaa，再调整ph至5.8；蔗糖添加量为ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.9wt％；分化培养基中，6-ba的浓度为2.5mg·l-1、iaa的浓度为0.25mg·l-1；
生根培养基的配制方法为：以ms培养基为基底，添加蔗糖、琼脂、iba、naa和iaa，再调整ph至5.8；蔗糖添加量为ms培养基总量的3wt％，琼脂添加量为ms培养基总量的0.8wt％；生根培养基中，iba的浓度为1.00mg·l-1、naa的浓度为0.20mg·l-1、iaa的浓度为0.50mg·l-1。
4.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织快速获得再生植株的方法，其特征在于：
步骤a中，无菌苗培养条件为：湿度为70～80％；每天置于光照下10～14h，黑暗下10～14h；优选的，无菌苗培养条件为：每天置于光照下12h，黑暗下12h；
步骤b中，愈伤组织培养条件为：湿度70～80％，每天置于光照下6～10h、黑暗下14～18h；所述愈伤组织的继代培养条件与愈伤组织培养条件相同；优选的，愈伤组织培养条件为：每天置于光照下8h、黑暗下16h；
步骤c中，丛生芽培养条件为：湿度70～80％、每天置于光照下14～18h、黑暗下6～10h；所述丛生芽的继代培养条件与丛生芽培养条件相同；优选的，丛生芽培养条件为：每天置于光照下16h、黑暗下8h；
步骤d中，生根无菌苗培养条件为：湿度70～80％、每天置于光照下10～14h、黑暗下10～14h；优选的，生根无菌苗培养条件为：每天置于光照下12h、黑暗下12h；
其中，所述光照时，光照强度2000～2500lx，环境温度为20±1℃；黑暗时，环境温度为10±1℃。
5.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织快速获得再生植株的方法，其特征在于，步骤a中，种子消毒方法为：取大花红景天种子，用灭菌的水浸湿后，流水冲洗，再吸干种子表面水分；再在无菌条件下，用酒精浸泡20～30s，无菌水冲洗5～6次，吸干种子表面水分，用hgcl溶液浸泡6～8min，无菌水冲洗5～6次，吸干种子表面水分，在超净工作台接种至无菌苗培养基；优选的，酒精浓度为75％；hgcl溶液的浓度为0.1wt％。
6.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织快速获得再生植株的方法，其特征在于：
步骤b中，种子播种后，选择生长25～30d的无菌苗的根颈顶端组织用于诱导愈伤组织；
将愈伤组织转移至增殖培养基中进行继代时，选取根颈顶端组织诱导18～25d的愈伤组织；优选诱导时间为20～22d的愈伤组织。
7.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织快速获得再生植株的方法，其特征在于，步骤c中，选择疏松颗粒状的愈伤组织诱导丛生芽；优选的，选取继代次数为3代的继代培养的愈伤组织诱导丛生芽，以20～22d为一代。
8.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织快速获得再生植株的方法，其特征在于，步骤c中，丛生芽继代培养的方法为：按照丛生芽的培养方法，30d后进行继代培养，以25～30d为一代，继代2次，获得植株健壮、基生叶多的大花红景天丛生芽。
9.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织快速获得再生植株的方法，其特征在于，步骤d中，选择植株健壮、基生叶多的丛生芽用来培养生根无菌苗；优选的，选择继代2次的丛生芽用来培养生根无菌苗。
10.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织快速获得再生植株的方法，其特征在于，步骤e中，将生根无菌苗转瓶培养20～25d得到加强生根苗，待苗高2～3cm时打开瓶口在大花红景天适宜区域，室温下炼苗7～14d后，然后用蒸馏水清洗根部，移入盛有基质的穴盘中，在湿度65～75％的条件下，遮阳度为60～65％条件下培养，待幼苗长出2～4片新叶，移栽至大田；其中，转瓶培养的培养基与生根培养基一致。
技术总结本发明涉及大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法，属于植物离体培养技术领域。大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法，具体方法为：a、取大花红景天种子，经消毒后，培养获得无菌苗；b、选择无菌苗的根颈顶端组织为外植体进行培养，获得愈伤组织；c、选取继代培养的愈伤组织进行诱导分化，获得丛生芽；d选取继代培养的丛生芽，将丛生芽从基部切开，将带有芽点的组织转接到生根培养基培养，得到生根无菌苗；e、将生根无菌苗培养至幼苗长出2～4片新叶，进行移栽，得到再生植株。本专利利用大花红景天种子培育无菌苗，以植株地上根颈顶端组织为外植体进行诱导，不需二次消毒，减少外植体损伤，提高了愈伤组织诱导率和增殖率。
技术研发人员：赵文吉;贾国夫;何正军;刘兴;童琪;闫利军;张昌兵;范康;吴婍;泽让东洲
受保护的技术使用者：四川省草原科学研究院;西藏天赐源生物科技有限责任公司
技术研发日：2020.12.04
技术公布日：2021.03.12
