本发明属于木兰科木兰属植物培育领域，尤其涉及一种景宁木兰腋芽组织培养的繁育方法。
背景技术：
景宁木兰magnoliasinostellata是木兰科magnoliaceae木兰属magnolia落叶灌木，发表于1989年，仅分布于浙江南部部分地区，因其树形优美，花色靓丽，观赏性极佳，导致野外种群被过度采挖，种群数量在近几年急剧下降；此外，由于景宁木兰花粉母细胞常减数分裂异常，导致该种虽然花多但自然结实率低下。目前，该种在《中国物种红色名录》中被列为极度濒危(cr)物种。
景宁木兰常生于河流溪旁，喜水，耐涝，在耐水湿方面较其他木兰科树种在园林绿化应用中有较强优势，适合在南方园林绿化中应用。目前尚未有景宁木兰的组培成功案例报道，现有的景宁木兰主要以扦插和嫁接繁殖为主，其中景宁木兰扦插生根率低，且嫁接方法繁殖得到的苗木不具备其耐水湿的特性，无法满足园林应用需求。
技术实现要素：
本发明旨在至少解决上述技术问题之一，提供了一种景宁木兰腋芽组织培养的繁育方法，其可加快景宁木兰的繁殖速度，且获取得的景宁木兰苗木能保持母种特性，不仅可以满足园林应用的需求，还可以满足其种群的野外保护及回归需求。
本发明的技术方案是：一种景宁木兰腋芽组织培养的繁育方法，包括以下步骤：
外植体选取：选取带有腋芽的景宁木兰枝条，除去叶片后用水冲洗，并切下带有腋芽的茎段作为外植体放入无菌瓶内；
外植体处理：利用次氯酸钠对外植体进行消毒，并用无菌水冲洗消毒后的外植体5-6次；
防褐化处理：将消毒后的外植体放入pvp中，并置于摇床中处理4-18h；
初代培养：将防褐化处理后的外植体接种至初代培养基中培养得到不定芽，所述初代培养基包括ms基本培养基、6-ba0.5-2mg/l、kt0.2-1mg/l、naa0.05-0.2mg/l、iba0.05-0.1mg/l、琼脂7g/l、蔗糖30g/l，且初代培养基的ph为5.8-6.5；
继代培养：将所述初代培养得到的不定芽转接至继代培养基中培养得到增殖芽，所述继代培养基包括ms基本培养基、6-ba0.5-1.5mg/l、naa0.05-0.2mg/l、iba0.05-0.1mg/l、琼脂7g/l、蔗糖30g/l，且所述继代培养基的ph为5.8-6.5；
生根培养：将增殖芽转接至生根培养基中培养得到生根苗，所述生根培养基包括1/2ms基本培养基、naa1-2mg/l、iba1-2mg/l、琼脂7g/l、蔗糖30g/l，且所述生根培养基的ph为5.8-6.5；
幼苗移栽：将经所述生根培养得到的生根苗种植于腐殖土中。
可选地，在所述外植体选取中，对景宁木兰枝条冲洗的时间为1-2h。
可选地，在所述外植体处理中，采用1％的次氯酸钠对外植体消毒8-15min。
可选地，在所述防褐化处理中，将消毒后的外植体放入0.1％的pvp中，且摇床的工作条件为：温度23-25℃，振荡速度为80-120rpm。
可选地，所述初代培养的条件为：温度23-25℃，光照强度4200-5600lx，光照时间12-14h/d，培养50d。
可选地，所述继代培养的条件为：温度23-25℃，光照强度4200-5600lx，光照时间12-14h/d。
可选地，所述生根培养的条件为：温度23-25℃，光照强度4200-5600lx，光照时间12-14h/d。
可选地，在所述幼苗移栽中，先对生根苗进行炼苗处理，再将生根苗种植于腐殖土中。
本发明所提供的一种景宁木兰腋芽组织培养的繁育方法，以带有腋芽的景宁木兰枝段作为外植体进行培养繁殖，通过调整不同培养阶段的培养基配方，利用初代培养基来诱导促进景宁木兰腋芽快速生长出不定芽，利用继代培养基来促进不定芽快速增殖，提高其增殖系数，利用生根培养基来诱导增殖芽生根，确保其生根率，有利于降低景宁木兰苗木的培育成本，可以满足园林应用的需求；且通过本发明的繁育方法培养得到的景宁木兰苗木能保持母种特性，还可满足景宁木兰种群的野外保护及回归需求。
具体实施方式
在具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和各实施例，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，例如通过不同的具体技术特征/实施例的组合可以形成不同的实施方式，为了避免不必要的重复，本发明中各个具体技术特征/实施例的各种可能的组合方式不再另行说明。
本发明实施例提供的一种景宁木兰腋芽组织培养的繁育方法，包括以下步骤：
外植体选取：选取带有腋芽的景宁木兰枝条，除去叶片后用无菌水冲洗，以除去枝条上粘有的其他杂质，并切下带有腋芽的茎段作为外植体放入无菌瓶内；
外植体处理：利用次氯酸钠对外植体进行消毒，除去外植体上的各种细菌，并用水冲洗消毒后的外植体5-6次，防止次氯酸钠影响后续培养结果；
防褐化处理：将消毒后的外植体放入pvp中，抑制外植体褐化，并置于摇床中处理4-18h；
初代培养：将防褐化处理后的外植体接种至初代培养基中，至分化出芽得到不定芽，所述初代培养基包括ms基本培养基、6-ba0.5-2mg/l、kt0.2-1mg/l、naa0.05-0.2mg/l、iba0.05-0.1mg/l、琼脂7g/l、蔗糖30g/l，且初代培养基的ph为5.8-6.5。其中，6-ba可发挥使细胞脱分化、促进细胞分裂的效果，naa可发挥促进细胞生长、iba用于使细胞分裂和细胞增生、kt用于诱导外植体出芽。
继代培养：将所述初代培养得到的不定芽转接至继代培养基中进行增殖培养，得到增殖芽，所述继代培养基包括ms基本培养基、6-ba0.5-1.5mg/l、naa0.05-0.2mg/l、iba0.05-0.1mg/l、琼脂7g/l、蔗糖30g/l，且所述继代培养基的ph为5.8-6.5。其中，6-ba可发挥使细胞脱分化、促进细胞分裂的效果，naa可发挥促进细胞生长和分化的作用、iba用于使细胞分裂和细胞增生。
生根培养：将增殖芽转接至生根培养基中生根培养，得到生根苗，所述生根培养基包括1/2ms基本培养基、naa1-2mg/l、iba1-2mg/l、琼脂7g/l、蔗糖30g/l，且所述生根培养基的ph为5.8-6.5。其中，naa可发挥促进细胞生长和分化的作用、iba用于使增殖芽加速生根。
幼苗移栽：将经所述生根培养得到的生根苗种植于腐殖土中。
其中，选取带有腋芽的景宁木兰枝段作为外植体，经过外植体处理和防褐化处理后放入培养基中进行培养，通过调整不同培养阶段的培养基配方，在初代培养时结合特定配置的初代培养基来促进诱导景宁木兰腋芽快速生长产生不定芽，在继代培养时结合特定的继代培养基来促进不定芽快速增殖得到增殖芽，提高增殖芽的增殖系数，当增殖芽的芽长到一定高度(例如3-5cm)时进行生根培养，在生根培养时结合特定的生根培养基来诱导增殖芽产生根，确保生根苗的生根率，从而获取大量的景宁木兰幼苗，有利于降低景宁木兰的繁殖成本，以满足园林应用的需求。同时通过本发明的繁育方法获得的景宁木兰幼苗，能保持母种特性，还可以满足景宁木兰种群的野外保护及回归野外的需求，这对景宁木兰遗传操作或生物工程研究具有重大意义。
在本发明中，对6-ba、naa、iba和kt的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。
可选地，在所述外植体选取中，对景宁木兰枝条冲洗的时间可为1-2h。
在一些实施例中，可利用自来水来冲洗去叶片后的枝条，冲洗时间为1h。
可选地，在所述外植体处理中，将外植体放入1％的次氯酸钠中浸泡8-15min,对外植体进行消毒，并用无菌水冲洗消毒后的外植体5-6次。
可选地，在所述防褐化处理中，将消毒后的外植体可放入0.1％的pvp中，且摇床的工作条件可为：摇床的工作为温度23-25℃，摇床的振荡速度为80-120rpm。
在一些实施例中，摇床的工作条件可为：摇床的工作为温度24℃，摇床的振荡速度为100rpm。
可选地，进行初代培养时，温度23-25℃，光照强度4200-5600lx，光照时间12-14h/d，培养50d至分化出芽。
可选地，进行继代培养时，温度23-25℃，光照强度4200-5600lx，光照时间12-14h/d。
可选地，所述生根培养的条件可为：温度23-25℃，光照强度4200-5600lx，光照时间12-14h/d。
可选地，在所述幼苗移栽中，先对生根苗进行炼苗处理，以使得生根苗可适应外界环境，确保种植于腐殖土中的生根苗正常生长。
本发明实施例所提供的一种景宁木兰腋芽组织培养的繁育方法，以带有腋芽的景宁木兰枝段作为外植体进行培养繁殖，通过调整不同培养阶段的培养基配方，能使得景宁木兰腋芽快速生长出不定芽，并可提高其继代培养的增殖系数和确保生根培养的生根率，有利于降低景宁木兰苗木的培育成本，可以满足园林应用的需求；且通过本发明的繁育方法培养得到的景宁木兰苗木能保持母种特性，还可满足景宁木兰种群的野外保护及回归需求。
为了进一步了解本发明，下面结合具体地的实施例进行详细说明。
实施例1
外植体选取：4月初于浙江省景宁县选取带有腋芽的景宁木兰枝条，利用自来水冲洗1h，并按两节为一段对枝条进行裁切处理得到枝段，将裁切处理后的枝段放入无菌瓶中；
外植体处理：从无菌瓶中取出枝段，利用1％次氯酸钠消毒10min后，再用无菌水冲洗5次，并从枝段上切取一个含有腋芽的茎段作为一个外植体；
防褐化处理：将外植体倒入0.1％pvp中，并放置于摇床中，保持摇床内温度为24℃，摇床的振荡速度为100rpm，震荡处理8h，得到褐化率为6.8％的外植体；
初代培养：将防褐化处理后的外植体接种至初代培养基中，培养条件为：培养温度24℃，光照强度5000lx，光照时间14h/d，培养50d，至分化出芽得到不定芽。其中，初代培养基为：ms基本培养基 6-ba0.9mg/l kt0.6mg/l naa0.1mg/l iba0.05mg/l 琼脂7g/l 蔗糖30g/l，初代培养基的ph＝6.2。
继代培养：将不定芽转接至继代培养基中，培养条件为：培养温度24℃，光照强度5000lx，光照时间14h/d，增殖培养得到增殖芽，增殖芽的增殖系数为3.57。其中，继代培养基为：ms基本培养基 6-ba1.0mg/l naa0.1mg/l iba0.05mg/l 琼脂7g/l 蔗糖30g/l，且继代培养基的ph＝6.2。
生根培养：将继代培养后的不定芽转接至生根培养基中，培养条件为：培养温度24℃，光照强度5000lx，光照时间14h/d，经生根培养诱导生根得到生根苗，生根率为59.3％。其中，生根培养基为：1/2ms基本培养基 naa1.5mg/l iba2mg/l 琼脂7g/l 蔗糖30g/l，且生根培养基的ph＝6.2。
幼苗移栽：将生根苗进行炼苗后，种植于腐殖土中，获得景宁木兰植株。
实施例2
外植体选取：9月于深圳市中国科学院仙湖植物园取景宁木兰带有腋芽的枝条，去除叶片后，利用自来水冲洗1h，然后将带有腋芽的茎段切下，作为外植体；
外植体处理：将外植体利用1％次氯酸钠消毒12min，无菌水冲洗5次，切除多余部分，保留腋芽；
防褐化处理：将外植体处理后的外植体倒入0.1％pvp中，并放置于摇床中保持摇床内温度为24℃，摇床的振荡速度为100rpm，震荡处理14h，得到褐化率为8.7％的外植体；
初代培养：将防褐化处理后的外植体接种至初代培养基中，培养条件为：培养温度24℃，光照强度5000lx，光照时间14h/d，经培养50d后得到不定芽。其中，初代培养基为：ms基本培养基 6-ba0.9mg/l kt0.6mg/l naa0.1mg/l iba0.05mg/l 琼脂7g/l 蔗糖30g/l，初代培养基的ph＝6.0。
继代培养：将不定芽转接至继代培养基中，培养条件为：培养温度24℃，光照强度5000lx，光照时间14h/d，培养得到增殖芽，增殖芽的增殖系数为3.58。其中，继代培养基为：ms基本培养基 6-ba1.0mg/l naa0.1mg/l iba0.05mg/l 琼脂7g/l 蔗糖30g/l，继代培养基的ph＝6.0。
生根培养：将继代培养后的不定芽转接至生根培养基中，培养条件为：培养温度24℃，光照强度5000lx，光照时间14h/d，经诱导生根得到生根苗，生根率63.2％。其中，生根培养基为：1/2ms基本培养基 naa2mg/l iba2mg/l 琼脂7g/l 蔗糖30g/l，生根培养基的ph＝6.2。
幼苗移栽：将生根苗进行炼苗后，种植于腐殖土中，获得景宁木兰植株。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种景宁木兰腋芽组织培养的繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：
外植体选取：选取带有腋芽的景宁木兰枝条，除去叶片后用水冲洗，并切下带有腋芽的茎段作为外植体放入无菌瓶内；
外植体处理：利用次氯酸钠对外植体进行消毒，并用无菌水冲洗消毒后的外植体5-6次；
防褐化处理：将消毒后的外植体放入pvp中，并置于摇床中处理4-18h；
初代培养：将防褐化处理后的外植体接种至初代培养基中培养得到不定芽，所述初代培养基包括ms基本培养基、6-ba0.5-2mg/l、kt0.2-1mg/l、naa0.05-0.2mg/l、iba0.05-0.1mg/l、琼脂7g/l、蔗糖30g/l，且初代培养基的ph为5.8-6.5；
继代培养：将所述初代培养得到的不定芽转接至继代培养基中培养得到增殖芽，所述继代培养基包括ms基本培养基、6-ba0.5-1.5mg/l、naa0.05-0.2mg/l、iba0.05-0.1mg/l、琼脂7g/l、蔗糖30g/l，且所述继代培养基的ph为5.8-6.5；
生根培养：将增殖芽转接至生根培养基中培养得到生根苗，所述生根培养基包括1/2ms基本培养基、naa1-2mg/l、iba1-2mg/l、琼脂7g/l、蔗糖30g/l，且所述生根培养基的ph为5.8-6.5；
幼苗移栽：将经所述生根培养得到的生根苗种植于腐殖土中。
2.如权利要求1所述的景宁木兰腋芽诱导组织培养的繁育方法，其特征在于，在所述外植体选取中，对景宁木兰枝条冲洗的时间为1-2h。
3.如权利要求1所述的景宁木兰腋芽诱导组织培养的繁育方法，其特征在于，在所述外植体处理中，采用1％的次氯酸钠对外植体消毒8-15min。
4.如权利要求1所述的景宁木兰腋芽诱导组织培养的繁育方法，其特征在于，在所述防褐化处理中，将消毒后的外植体放入0.1％的pvp中，且摇床的工作条件为：温度23-25℃，振荡速度为80-120rpm。
5.如权利要求1所述的景宁木兰腋芽诱导组织培养的繁育方法，其特征在于，所述初代培养的条件为：温度23-25℃，光照强度4200-5600lx，光照时间12-14h/d，培养50d。
6.如权利要求1所述的景宁木兰腋芽诱导组织培养的繁育方法，其特征在于，所述继代培养的条件为：温度23-25℃，光照强度4200-5600lx，光照时间12-14h/d。
7.如权利要求1所述的景宁木兰腋芽诱导组织培养的繁育方法，其特征在于，所述生根培养的条件为：温度23-25℃，光照强度4200-5600lx，光照时间12-14h/d。
8.如权利要求1所述的景宁木兰腋芽诱导组织培养的繁育方法，其特征在于，在所述幼苗移栽中，先对生根苗进行炼苗处理，再将生根苗种植于腐殖土中。
技术总结