本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种乌饭树芽诱导培养基及组培方法。
背景技术：
乌饭树又名南烛，是杜鹃花科、越橘属常绿灌木或乔木，古名染菽，主要分布在亚洲东北部及东南部，在我国广泛分布于长江以南的各省区。因人们有每年阴历三月初三用其叶蒸乌饭食用而得名。乌饭树喜光、耐旱、耐寒、耐瘠薄，适生范围较广，我国大部分地区均可种植，是不可多得的制作盆景、盆栽的优良素材。除此之外，乌饭树叶亦可入药，其性平，略带酸涩，含三十一烷，无羁萜，无羁萜醇，槲皮素，异荭草素等多种脂溶性有效成分，有抗氧化、延缓衰老、抗疲劳、降血糖、抗癌防癌、改善视网膜功能等功用。
由于扦插生根较难，乌饭树这一重要的经济植物尚未得到广泛的推广应用。基于组培快繁技术建立乌饭树的快速繁殖技术体系，将极大的有利于其推广应用。根据现有技术的记载，乌饭树组织培养时间长、污染率高、繁殖系数低。尤其乌饭树组织培养常以带芽茎段为外植体，芽诱导过程中产生新芽、新梢少，且极易受到污染，成活率低。芽诱导阶段是乌饭树植物组织培养过程中的第一个重要阶段，然而，现有技术中对乌饭树组织培养芽诱导培养阶段的研究较少。如cn103404440a(2013.11.27)公开了一种乌饭树组织培养的方法，经过外植体消毒、诱导培养、增殖培养、生根培养获得乌饭树组培苗；cn110612903a(2019.12.27)公开了一种乌饭树组配继代生根的方法；cn110810249a(2020.02.21)公开了一种促进乌饭树丛生芽培养的培养基及应用。文献《乌饭树芽诱导体系的建立》(张祝丽,姜燕琴,於虹.北方园艺,2015(17):79-82.)建立的乌饭树芽诱导体系，虽然污染率、褐化率较低，但增殖倍数仅为1。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种乌饭树芽诱导培养基，以提升乌饭树组织培养芽诱导阶段成活率，并提升增殖系数。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种乌饭树芽诱导培养基，以ms为基本培养基，添加有2.0～3.0mg/lzt和0.5～2.0mg/lnaa。
优选的是，所述培养基配方为蔗糖30g/l 琼脂7.0～7.5g/l ms 2.0～3.0mg/lzt 0.5～2.0mg/lnaa 5.0～10.0mg/l碳纳米管。
更优选的是，所述培养基配方为蔗糖30g/l 琼脂7.5g/l ms 2.5mg/lzt 1.5mg/lnaa 10.0mg/l碳纳米管。
本发明另一方面目的在于提供一种乌饭树芽诱导培养基的应用，将乌饭树带芽茎段外植体接种至所述芽诱导培养基进行芽诱导培养。
优选的是，将所述带芽茎段插入芽诱导培养基，插入深度为0.3～0.5cm。
优选的是，所述芽诱导培养条件为：培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光周期为光照16h/d，光源为led白光。
本发明目的还在于提供一种乌饭树组织培养方法，包括：乌饭树芽诱导培养基诱导乌饭树无菌芽的萌发，经壮芽培养后，诱导产生丛生芽，丛生芽经过壮芽、生根阶段培养，生成生根试管苗
优选的是，所述壮芽培养基配方为：蔗糖40g/l 琼脂7.0～7.5g/l ms 2.0～3.0mg/l6-ba 0.5～1.0mg/lnaa 3.0～5.0mg/l碳纳米管；所述丛生芽诱导培养基配方为：蔗糖30g/l 琼脂7.0～7.5g/l ms 2.0～3.0mg/lzt 1.0～1.5mg/l2,4-d 2.0～5.0mg/l碳纳米管；所述生根培养基配方为：蔗糖40g/l 琼脂7.0～7.5g/l ms 1.0～1.5mg/l6-ba 0.5～1.0mg/liba 2.0～5.0g/l活性炭 2.0～5.0mg/l碳纳米管。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种乌饭树芽诱导培养基，以ms为基本培养基，添加有2.0～3.0mg/lzt和0.5～2.0mg/lnaa，具体配方为蔗糖30g/l 琼脂7.0～7.5g/l ms 2.0～3.0mg/lzt 1.0～2.0mg/lnaa 5.0～10.0mg/l碳纳米管。以ms为基本培养基，相较于其他基本培养基使乌饭树芽诱导成活率大幅上升，平均成活率为73.33％；以2.0～3.0mg/lzt和0.5～2.0mg/lnaa为外源激素，能够显著提升芽诱导数量，增殖系数达到4.67倍。基于本发明乌饭树组织培养方法建立的乌饭树高效快繁技术体系，为乌饭树的大规模推广应用提供技术支撑。
具体实施方式
本发明针对乌饭树快繁体系，提供了一种乌饭树芽诱导培养基及应用该培养基进行芽诱导和乌饭树组织培养的方法，以提升乌饭树组织培养过程中的成活率，并进一步提升乌饭树芽诱导阶段的增殖系数。
本发明提供了一种乌饭树芽诱导培养基，以ms为基本培养基，添加有2.0～3.0mg/lzt和0.5～2.0mg/lnaa。组织培养过程中使用不同的基本培养基类型、不同的培养方式对培养物的增殖及分化方向存在着较大影响，且不同植物种类适应的类型也不相同。本发明以ms作为乌饭树组织培养过程中的基本培养基，明显优于wpm、1/2ms等基本培养基，能够显著提高乌饭树组织培养过程中的成活率，保证植物组织的脱分化、再分化，利于诱导、增殖、生根阶段的进行。在植物组织培养过程中，需要添加外源激素，不同种类、不同浓度外源激素对芽诱导、芽增殖、生根的影响不同。本发明以2.0～3.0mg/lzt和0.5～2.0mg/lnaa作为乌饭树芽诱导阶段外源激素，能够明显提升芽诱导阶段的增殖系数(新芽总数/外植体个数)，利于乌饭树组织培养大规模应用。优选的是，本发明乌饭树芽诱导培养基配方为蔗糖30g/l 琼脂7.0～7.5g/l ms 2.0～3.0mg/lzt 0.5～2.0mg/lnaa 5.0～10.0mg/l碳纳米管；更优选的是，蔗糖30g/l 琼脂7.5g/l ms 2.5mg/lzt 1.5mg/lnaa 10.0mg/l碳纳米管。
本发明还提供了将乌饭树带芽茎段外植体接种至上述芽诱导培养基进行芽诱导培养的应用。在植物组织培养过程中，外植体选择包括茎尖、茎段、叶片、根、子叶等器官，不同器官之间的分化能力有较大差异，培养的难易程度也不同。本发明以乌饭树的带芽茎段作为外植体，在芽诱导培养基上，侧芽较容易诱导出新芽，增殖系数达到可达到2.67～4.67。优选的是，所述带芽茎段插入芽诱导培养基，插入深度为0.3～0.5cm；进一步更优选的是，插入方式为垂直插入。更优选的是，带芽茎段获取方式为于5-6月(梅雨季节来临之前)，取乌饭树当年生枝条，并剪成1～2cm的带芽小段。
在组织培养过程中，消毒是十分重要的一步，通过消毒可明显提升组织培养效果，降低污染率和褐化率。本发明优选带芽茎段的外植体消毒方式为：洗涤剂震荡漂洗1～1.5h后，流水冲洗2～2.5h，在超净工作台上，将茎段置于已灭菌的玻璃瓶中，用75％乙醇消毒30s～45s，无菌水冲洗2～3次，每次30s～45s；随后用0.1％hgcl2处理8～12min，无菌水清洗4～6次，无菌吸水纸吸干表面的水分，备用。
在植物组织培养中，温度、光照等各种环境条件会影响组织培养的生长和发育，植物组织培养在最适宜的温度下生长分化才能更好，温度过高或过低都会影响生长，且不同培养目标的培养温度也不相同。光照条件，即光强、光周期及光质也影响着细胞的增殖和器官的分化。本发明优选芽诱导培养条件为：培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光周期为光照16h/d，光源为led白光。
完整的植物组织培养快繁体系，包括外植体的获取、消毒、诱导、增殖和生根过程。本发明利用上述芽诱导培养基经过芽诱导阶段培养，诱导乌饭树无菌芽的萌发，经壮芽培养后，诱导产生丛生芽，丛生芽经过壮芽、生根阶段培养，生成生根试管苗。优选的是，芽诱导阶段，诱导乌饭树无菌芽的萌发；壮芽培养阶段：将所述萌发出的无菌新芽从外植体上切下，放入壮芽培养基上进行壮芽培养，生成无根试管苗；所述壮芽培养基配方为蔗糖40g/l 琼脂7.0～7.5g/l ms 2.0～3.0mg/l6-ba 0.5～1.0mg/lnaa 3.0～5.0mg/l碳纳米管；丛生芽诱导阶段：将所述无根试管苗切去部分叶片和下部茎段，保留顶端的2～3片叶片和2.0～2.5cm长的茎段，接种到丛生芽诱导培养基上，进行丛生芽诱导培养，至腋芽萌发出成从新生芽；所述丛生芽诱导培养基配方为：蔗糖30g/l 琼脂7.0～7.5g/l ms 2.0～3.0mg/lzt 1.0～1.5mg/l2,4-d 2.0～5.0mg/l碳纳米管；再次进行壮芽培养阶段，获得无根试管苗；生根培养阶段：将所述无根试管苗继代到生根培养基上进行生根培养，获得生根试管苗；所述生根培养基配方为：蔗糖40g/l 琼脂7.0～7.5g/l ms 1.0～1.5mg/l6-ba 0.5～1.0mg/liba 2.0～5.0g/l活性炭 2.0～5.0mg/l碳纳米管。
组培苗虽然具有一定的光合作用，但长期在高湿、弱光、高co2浓度、恒温、异养条件下生长，其组织分化不完善，光合自养能力弱，适应能力差。本发明优选对生根试管苗进行炼苗和移栽，炼苗过程可逐步改变其生长环境使其组织发育完全，以适应外界环境。更优选的是，所述炼苗在室内进行，将组培瓶松盖后，置于组培室缓冲间，放置2～3d，之后移入室内房间，置于自然散射光下，再放置2～3d；所述移栽为炼苗完成后，用镊子将试管苗取出，洗去根部的培养基，移栽到穴盘中，进行水肥管理；所述穴盘栽培基质为泥炭土、珍珠岩和田园土的混合物，优选泥炭土：珍珠岩：田园土的体积比＝1:1:1，所述栽培基质经多菌灵消毒处理。优选的是，所述多菌灵为700～900倍液。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
不同基础培养基对乌饭树组织培养成活率的影响
以ms、1/2ms、wpm、b5、dkw和n6基本培养基，添加蔗糖30g/l和琼脂7.5g/l作为乌饭树培养基进行组织培养，三次重复处理，每次处理外植体接种数为30个，统计成活率。
试验结果：
表1乌饭树芽诱导基本培养基的筛选
根据表1试验结果可以看出，不同基本培养基对乌饭树组织培养的成活率影响不同，n6基本培养基成活率最低，仅为13.33％，ms基本培养基成活率最高，达到73.33％。乌饭树组织培养需要时间长，从外植体到完整的生根试管苗需要几个月之久，以ms作为乌饭树组织培养的基本培养基，能够维持较高的成活率，利于大规模推广应用。
实施例2
不同浓度zt与naa配比对乌饭树芽诱导增殖系数的影响
以ms作为基本培养基，添加蔗糖30g/l和琼脂7.5g/l，分别添加1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/lzt和0.5、1.0、1.5、2.0mg/lnaa进行乌饭树芽诱导培养，以增殖系数(新芽总数/统计时外植体个数)为指标，筛选植物生长调节剂浓度。
试验结果：
表2乌饭树芽诱导培养基植物生长调剂浓度的筛选
根据表2试验结果可以看出，以zt、naa作为乌饭树芽诱导培养基植物生长调节剂，不同浓度对芽诱导的增殖系数不同，随着植物生长调节剂浓度的升高，增殖系数呈先增加后减少的趋势。其中，以2.0～3.0mg/lzt和0.5～2.0mg/lnaa作为植物生长调节剂，乌饭树芽诱导培养阶段增殖系数为2倍以上，以2.5mg/lzt和1.5mg/lnaa作为植物生长调节剂，可使乌饭树芽诱导增殖系数达到4.67倍，能够为乌饭树组织培养节省大部分外植体材料，适合大规模应用。
实施例3
一种乌饭树芽诱导培养基，配方为蔗糖30g/l 琼脂7.5g/l ms 2.5mg/lzt 1.5mg/lnaa 10.0mg/l碳纳米管。
实施例4
一种乌饭树芽诱导培养基，配方为蔗糖30g/l 琼脂7.5g/l ms 2.0mg/lzt 2.0mg/lnaa 10.0mg/l碳纳米管。
实施例5
一种乌饭树芽诱导培养基，配方为蔗糖30g/l 琼脂7.0g/l ms 3.0mg/lzt 0.5mg/lnaa 5.0mg/l碳纳米管。
实施例6
利用实施例3培养基进行乌饭树芽诱导培养，诱导乌饭树无菌芽萌发，包括以下步骤：
将消毒过的带芽茎段垂直插入芽诱导培养基，插入深度为0.4cm；培养条件为培养温度25±1℃，光照强度200μmol·m-2·s-1，光周期为光照16h/d，光源为led白光，外植体成活率71.33％，增殖系数为3.33。
实施例7
利用实施例4培养基进行乌饭树芽诱导培养，诱导乌饭树无菌芽萌发，包括以下步骤：
将消毒过的带芽茎段插入芽诱导培养基，插入深度为0.3cm；培养条件为培养温度25±1℃，光照强度100μmol·m-2·s-1，光周期为光照16h/d，光源为led白光，外植体成活率67.67％，增殖系数为3.67。
实施例8
利用实施例5培养基进行乌饭树芽诱导培养，诱导乌饭树无菌芽萌发，包括以下步骤：
将消毒过的带芽茎段插入芽诱导培养基，插入深度为0.5cm；培养条件为培养温度25±1℃，光照强度300μmol·m-2·s-1，光周期为光照16h/d，光源为led白光，外植体成活率70.33％，增殖系数为4.33。
实施例9
一种乌饭树组织培养方法，包括以下步骤：
(1)芽诱导阶段：按实施例6的方法进行乌饭树芽诱导，获得乌饭树无菌芽；
(2)壮芽培养阶段：将所述萌发出的无菌新芽从外植体上切下，放入壮芽培养基上进行壮芽培养，生成无根试管苗；所述壮芽培养基配方为蔗糖40g/l 琼脂7.5g/l ms 2.5mg/l6-ba 0.8mg/lnaa 4.0mg/l碳纳米管；
(3)丛生芽诱导阶段：将所述无根试管苗切去部分叶片和下部茎段，保留顶端的2片叶片和2.3cm长的茎段，接种到丛生芽诱导培养基上，进行丛生芽诱导培养，至腋芽萌发出成从新生芽；所述丛生芽诱导培养基配方为：蔗糖30g/l 琼脂7.5g/l ms 2.5mg/lzt 1.3mg/l2,4-d 3.5mg/l碳纳米管；诱导率为91.67％；
(4)壮芽培养阶段：按步骤(2)再次进行壮芽培养，获得无根试管苗；
(5)生根培养阶段：将所述无根试管苗继代到生根培养基上进行生根培养，获得生根试管苗；所述生根培养基配方为：蔗糖40g/l 琼脂7.5g/l ms 1.3mg/l6-ba 0.8mg/liba 3.5g/l活性炭 3.5mg/l碳纳米管；生根率为92.52％；
(6)炼苗和移栽：炼苗在室内进行，将组培瓶松盖后，置于组培室缓冲间，放置2d，之后移入室内房间，置于自然散射光下，再放置3d；所述移栽为炼苗完成后，用镊子将试管苗取出，洗去根部的培养基，移栽到10×10穴盘中，进行水肥管理；所述穴盘栽培基质为泥炭土：珍珠岩：田园土体积比＝1:1:1，所述栽培基质经800倍多菌灵消毒处理；成活率为87.45％。
实施例10
一种乌饭树组织培养方法，包括以下步骤：
(1)芽诱导阶段：按实施例7的方法进行乌饭树芽诱导，获得乌饭树无菌芽；
(2)壮芽培养阶段：将所述萌发出的无菌新芽从外植体上切下，放入壮芽培养基上进行壮芽培养，生成无根试管苗；所述壮芽培养基配方为蔗糖40g/l 琼脂7.0g/l ms 2.0mg/l6-ba 0.5mg/lnaa 3.0mg/l碳纳米管；
(3)丛生芽诱导阶段：将所述无根试管苗切去部分叶片和下部茎段，保留顶端的2片叶片和2.0cm长的茎段，接种到丛生芽诱导培养基上，进行丛生芽诱导培养，至腋芽萌发出成从新生芽；所述丛生芽诱导培养基配方为：蔗糖30g/l 琼脂7.0g/l ms 2.0mg/lzt 1.0mg/l2,4-d 2.0mg/l碳纳米管；诱导率为86.67％；
(4)壮芽培养阶段：按步骤(2)再次进行壮芽培养，获得无根试管苗；
(5)生根培养阶段：将所述无根试管苗继代到生根培养基上进行生根培养，获得生根试管苗；所述生根培养基配方为：蔗糖40g/l 琼脂7.0g/l ms 1.0mg/l6-ba 0.5mg/liba 2.0g/l活性炭 2.0mg/l碳纳米管；生根率为93.25％；
(6)炼苗和移栽：炼苗在室内进行，将组培瓶松盖后，置于组培室缓冲间，放置2d，之后移入室内房间，置于自然散射光下，再放置2d；所述移栽为炼苗完成后，用镊子将试管苗取出，洗去根部的培养基，移栽到10×10的穴盘中，进行水肥管理；所述穴盘栽培基质为泥炭土：珍珠岩：田园土体积比＝1:1:1，所述栽培基质经700倍多菌灵消毒处理；成活率为85.33％。
实施例11
一种乌饭树组织培养方法，包括以下步骤：
(1)芽诱导阶段：按实施例8的方法进行乌饭树芽诱导，获得乌饭树无菌芽；
(2)壮芽培养阶段：将所述萌发出的无菌新芽从外植体上切下，放入壮芽培养基上进行壮芽培养，生成无根试管苗；所述壮芽培养基配方为蔗糖40g/l 琼脂7.5g/l ms 3.0mg/l6-ba 1.0mg/lnaa 5.0mg/l碳纳米管；
(3)丛生芽诱导阶段：将所述无根试管苗切去部分叶片和下部茎段，保留顶端的3片叶片和2.5cm长的茎段，接种到丛生芽诱导培养基上，进行丛生芽诱导培养，至腋芽萌发出成从新生芽；所述丛生芽诱导培养基配方为：蔗糖30g/l 琼脂7.5g/l ms 3.0mg/lzt 1.5mg/l2,4-d 5.0mg/l碳纳米管；诱导率为84.67％；
(4)壮芽培养阶段：按步骤(2)再次进行壮芽培养，获得无根试管苗；
(5)生根培养阶段：将所述无根试管苗继代到生根培养基上进行生根培养，获得生根试管苗；所述生根培养基配方为：蔗糖40g/l 琼脂7.5g/l ms 1.5mg/l6-ba 1.0mg/liba 5.0g/l活性炭 5.0mg/l碳纳米管；生根率为91.67％；
(6)炼苗和移栽：炼苗在室内进行，将组培瓶松盖后，置于组培室缓冲间，放置3d，之后移入室内房间，置于自然散射光下，再放置3d；所述移栽为炼苗完成后，用镊子将试管苗取出，洗去根部的培养基，移栽到10×10穴盘中，进行水肥管理；所述穴盘栽培基质为泥炭土：珍珠岩：田园土体积比＝1:1:1，所述栽培基质经900倍多菌灵消毒处理；成活率为85.33％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.一种乌饭树芽诱导培养基，其特征在于，以ms为基本培养基，添加有2.0～3.0mg/lzt和0.5～2.0mg/lnaa。
2.根据权利要求1所述的乌饭树芽诱导培养基，其特征在于，所述培养基配方为蔗糖30g/l 琼脂7.0～7.5g/l ms 2.0～3.0mg/lzt 0.5～2.0mg/lnaa 5.0～10.0mg/l碳纳米管。
3.根据权利要求1所述的乌饭树芽诱导培养基，其特征在于，所述培养基配方为蔗糖30g/l 琼脂7.5g/l ms 2.5mg/lzt 1.5mg/lnaa 10.0mg/l碳纳米管。
4.根据权利要求1～3所述任意一项乌饭树芽诱导培养基的应用，其特征在于，将乌饭树带芽茎段外植体接种至所述芽诱导培养基进行芽诱导培养。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述带芽茎段插入芽诱导培养基，插入深度为0.3～0.5cm。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述芽诱导培养条件为：培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光周期为光照16h/d，光源为led白光。
7.一种乌饭树组织培养方法，其特征在于，包括：利用权利要求1～3所述任意一项乌饭树芽诱导培养基诱导乌饭树无菌芽的萌发，经壮芽培养后，诱导产生丛生芽，丛生芽经过壮芽、生根阶段培养，生成生根试管苗。
8.根据权利要求7所述的乌饭树组织培养方法，其特征在于，所述壮芽培养基配方为：蔗糖40g/l 琼脂7.0～7.5g/l ms 2.0～3.0mg/l6-ba 0.5～1.0mg/lnaa 3.0～5.0mg/l碳纳米管。
9.根据权利要求7所述的乌饭树组织培养方法，其特征在于，所述丛生芽诱导培养基配方为：蔗糖30g/l 琼脂7.0～7.5g/l ms 2.0～3.0mg/lzt 1.0～1.5mg/l2,4-d 2.0～5.0mg/l碳纳米管。
10.根据权利要求7所述的乌饭树组织培养方法，其特征在于，所述生根培养基配方为：蔗糖40g/l 琼脂7.0～7.5g/l ms 1.0～1.5mg/l6-ba 0.5～1.0mg/liba 2.0～5.0g/l活性炭 2.0～5.0mg/l碳纳米管。
技术总结