本发明涉及龙牙百合培养技术领域，尤其涉及龙牙百合脱毒方法。
背景技术：
龙牙百合，鳞茎球形，横径2-2.4厘米，鳞片披针形，白色，曝晒时呈黄白色或稍带粉红色。淀粉含量高，营养丰富，味淡不苦，地上茎高约100厘米，叶散生，倒披针形。花乳白色有香气，能结实产生种子。分布于我国湖南、湖北、江西、浙江、河南、河北、陕西等省海拔200-390米处。龙牙百合产品是历朝历代的贡品，其更是白花百合中的优良品种。
国内外市场对百合产品的需求缺口极大，产业发展潜力巨大。但在产业发展中始终存在一个核心科学问题阻碍其健康发展：即几百年来自留种生产方式导致病毒、病菌积累，种球退化，品质产量下降。这个问题已成为制约百合产业发展的瓶颈问题，解决这关键瓶颈问题最直接有效的途径是提供最优良的健康无毒生产种球。因此，生产脱毒百合种球迫在眉睫，从源头上改良种球退化、控制种球病菌、提高种球安全意义重大，为此我们提出了龙牙百合脱毒方法。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的龙牙百合脱毒方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
龙牙百合脱毒方法，包括以下步骤：
组培室消毒灭菌：用84消毒液稀释至1000倍或75%乙醇喷洒洗涤组培室地面，保持室内清洁，每30d用高锰酸钾及次氯酸混合熏蒸，在接种室接种前15d用紫外灯照射30min，超净工作台接种前用紫外灯照射30min，随后关闭紫外灯通风20min以上，用湿拖把轻轻打扫超净工作台四周，降低尘埃，接着用75％乙醇擦拭台面操作区域；
s2、培养基配制与处理：a、培养基配制，基本培养基为ms培养基，初代培养附加糖80g/l，其余培养基配方除特殊说明均附加糖80g/l，琼脂粉浓度为7g/l；b、ph值的调整，用酸度计或精密ph试纸进行调试，ph值为5.8，当ph<5.8时用1m的naoh调节，ph>5.8时用1m的hci调节；c、培养基的分装，配制好的培养基趁热分装，200ml组培瓶每瓶装40-50ml，厚度1cm左右，分装后立即封口，做好标记；d、培养基的灭菌与储藏，将装入培养基的组培瓶放入高压灭菌锅内，压力0.11mpa，温度121℃，灭菌30min，灭菌后取出培养基放置于培养室中冷却待用，放置时间为3天，以便观察培养基灭菌情况，无污染后进行接种使用，灭菌后的培养基可在无菌或洁净实验宣内储藏不超过30d；
s3、外植体诱导成球：a、外植体选取，以龙牙百合鳞片为外植体，选取完整无病虫害且周径≥12cm的龙牙百合种球，剔除外层带病斑的鳞片，由外向内完整地剥取中层鳞片，浸泡于清水中10min，用流水冲洗鳞片表面泥垢30min以上，保证鳞片洁净无瑕；b、外植体消毒灭菌，用75％乙醇灭菌20s，再用0.1％的升汞溶液浸泡15min，每隔30s进行摇动，使鳞片充分与溶液混合，最后用无菌水冲洗5次，沿鳞片切除周围1mm的外围部分，然后选取外层下部与鳞茎盘相连的部分为最佳外植体，横切约为1cm厚的小块；c、愈伤培养，1）鳞片接种，将准备好的切片底部带伤口面向上轻轻按压于诱导愈伤培养基上；2）培养条件，将接种好的组培瓶放置于25℃士2℃培养室中，暗培养30-40d，鳞片顶部伤口处即形成淡黄色的愈伤，在培养期间，每隔25-30d更换1次培养基，3）、愈伤培养基配方，ms 1.0mg/l6-ba 1.0mg/l2,4-d 蔗糖80.0g/l 琼脂7g/l，ph5.8；d、小鳞茎培养，1）愈伤接种，将鳞片上的愈伤取出并切成黄豆粒大小，平放于诱导愈伤培养基上；2）培养条件，愈伤及成鳞茎诱导均放置于培养室中，置于25℃士2℃，进行光照与黑暗比例为16h/8h条件下培养，光照强度为3000lx-5000lx，培养期间，每隔25-30d更换一次培养基；3）培养基配方，ms 1mg/l6-ba 80g/l蔗糖 7g/l琼脂，ph5.8；
s4、小鳞茎增大培养：a、小鳞茎接种，将分化的小鳞茎接种到鳞茎增大培养基上进行培养；b、培养条件，将接种的鳞茎，置于25℃士2℃条件下，暗培养50-60d即可长成直径大于0.5cm以上的鳞茎，在培养期间，每隔20d更换一次培养基；c、培养基配方，ms 1.0ml/giba 蔗糖80.0g/l 7g/l琼脂，ph5.8；d、打破休眠，将长成的组培鳞茎，整瓶转至4℃暗培养的冷藏室内，培养50-60d打破休眠；e、热处理，将解除休眠的百合鳞茎，整瓶置于人工气候箱中，45℃恒温培养箱中进行7d；
s5、茎尖培养成鳞茎：a、茎尖接种，把热处理过的百合组培鳞茎，在40倍的解剖镜下，用解剖刀剥除外部鳞片漏出生长点，用解剖针挑取0.6mm-0.8mm大小的茎尖生长点接种到诱导愈伤培养基上；b、培养条件，将接种的茎尖至于25℃条件下，遮光暗箱培养60d-80d，每25-30d更换一次培养基；c、培养基配方，ms 2.5mg/lpicloram 6-8mg/l病毒唑 80g/l糖 7g/l琼脂，ph为5.8；d、愈伤诱导成球，按s3与s4的步骤进行百合籽球的培养；
s6、病毒检测：将通过茎尖最终诱导成球的百合组培鳞茎，采用多重rt—pcr法进行百合主要病毒，如百合潜隐病毒、异名百合斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、百合无症病毒、郁金香碎花病毒和百合丛簇病毒主要病毒检测，检测结果为阴性，说明组培鳞茎不带病毒可作为百合无病毒种源继续扩繁，如果为阳性，说明脱毒不够彻底，不能作为百合无病毒种源；
s7、档案记载：详细记载龙牙百合脱毒技术中各个组培阶段的培养基配方与培养环境条件。
优选的，所述脱毒设备参照《东方百合脱毒技术规程》（db32t3372-2018）中设备准备及执行。
优选的，所述配制培养基使用的水应按照《生活饮用水卫生标准》（gb57492018）执行。
本发明提出的健康脱毒的百合种球，进行商品化、规模化生产，在降低生产成本的同时可以有效解决种球带毒、退化、品质下降的难题，促进百合增产、农民增收。
附图说明
图1为本发明提出的龙牙百合脱毒方法的流程示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例
龙牙百合脱毒方法，包括以下步骤：
组培室消毒灭菌：用84消毒液稀释至1000倍或75%乙醇喷洒洗涤组培室地面，保持室内清洁，每30d用高锰酸钾及次氯酸混合熏蒸，在接种室接种前15d用紫外灯照射30min，超净工作台接种前用紫外灯照射30min，随后关闭紫外灯通风20min以上，用湿拖把轻轻打扫超净工作台四周，降低尘埃，接着用75％乙醇擦拭台面操作区域；
s2、培养基配制与处理：a、培养基配制，基本培养基为ms培养基，初代培养附加糖80g/l，其余培养基配方除特殊说明均附加糖80g/l，琼脂粉浓度为7g/l；b、ph值的调整，用酸度计或精密ph试纸进行调试，ph值为5.8，当ph<5.8时用1m的naoh调节，ph>5.8时用1m的hci调节；c、培养基的分装，配制好的培养基趁热分装，200ml组培瓶每瓶装40-50ml，厚度1cm左右，分装后立即封口，做好标记；d、培养基的灭菌与储藏，将装入培养基的组培瓶放入高压灭菌锅内，压力0.11mpa，温度121℃，灭菌30min，灭菌后取出培养基放置于培养室中冷却待用，放置时间为3天，以便观察培养基灭菌情况，无污染后进行接种使用，灭菌后的培养基可在无菌或洁净实验宣内储藏不超过30d；
s3、外植体诱导成球：a、外植体选取，以龙牙百合鳞片为外植体，选取完整无病虫害且周径≥12cm的龙牙百合种球，剔除外层带病斑的鳞片，由外向内完整地剥取中层鳞片，浸泡于清水中10min，用流水冲洗鳞片表面泥垢30min以上，保证鳞片洁净无瑕；b、外植体消毒灭菌，用75％乙醇灭菌20s，再用0.1％的升汞溶液浸泡15min，每隔30s进行摇动，使鳞片充分与溶液混合，最后用无菌水冲洗5次，沿鳞片切除周围1mm的外围部分，然后选取外层下部与鳞茎盘相连的部分为最佳外植体，横切约为1cm厚的小块；c、愈伤培养，1）鳞片接种，将准备好的切片底部带伤口面向上轻轻按压于诱导愈伤培养基上；2）培养条件，将接种好的组培瓶放置于25℃士2℃培养室中，暗培养30-40d，鳞片顶部伤口处即形成淡黄色的愈伤，在培养期间，每隔25-30d更换1次培养基，3）、愈伤培养基配方，ms 1.0mg/l6-ba 1.0mg/l2,4-d 蔗糖80.0g/l 琼脂7g/l，ph5.8；d、小鳞茎培养，1）愈伤接种，将鳞片上的愈伤取出并切成黄豆粒大小，平放于诱导愈伤培养基上；2）培养条件，愈伤及成鳞茎诱导均放置于培养室中，置于25℃士2℃，进行光照与黑暗比例为16h/8h条件下培养，光照强度为3000lx-5000lx，培养期间，每隔25-30d更换一次培养基；3）培养基配方，ms 1mg/l6-ba 80g/l蔗糖 7g/l琼脂，ph5.8；
s4、小鳞茎增大培养：a、小鳞茎接种，将分化的小鳞茎接种到鳞茎增大培养基上进行培养；b、培养条件，将接种的鳞茎，置于25℃士2℃条件下，暗培养50-60d即可长成直径大于0.5cm以上的鳞茎，在培养期间，每隔20d更换一次培养基；c、培养基配方，ms 1.0ml/giba 蔗糖80.0g/l 7g/l琼脂，ph5.8；d、打破休眠，将长成的组培鳞茎，整瓶转至4℃暗培养的冷藏室内，培养50-60d打破休眠；e、热处理，将解除休眠的百合鳞茎，整瓶置于人工气候箱中，45℃恒温培养箱中进行7d；
s5、茎尖培养成鳞茎：a、茎尖接种，把热处理过的百合组培鳞茎，在40倍的解剖镜下，用解剖刀剥除外部鳞片漏出生长点，用解剖针挑取0.6mm-0.8mm大小的茎尖生长点接种到诱导愈伤培养基上；b、培养条件，将接种的茎尖至于25℃条件下，遮光暗箱培养60d-80d，每25-30d更换一次培养基；c、培养基配方，ms 2.5mg/lpicloram 6-8mg/l病毒唑 80g/l糖 7g/l琼脂，ph为5.8；d、愈伤诱导成球，按s3与s4的步骤进行百合籽球的培养；
s6、病毒检测：将通过茎尖最终诱导成球的百合组培鳞茎，采用多重rt—pcr法进行百合主要病毒，如百合潜隐病毒、异名百合斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、百合无症病毒、郁金香碎花病毒和百合丛簇病毒主要病毒检测，检测结果为阴性，说明组培鳞茎不带病毒可作为百合无病毒种源继续扩繁，如果为阳性，说明脱毒不够彻底，不能作为百合无病毒种源；
s7、档案记载：详细记载龙牙百合脱毒技术中各个组培阶段的培养基配方与培养环境条件。
本实施例中，脱毒设备参照《东方百合脱毒技术规程》（db32t3372-2018）中设备准备及执行。
本实施例中，配制培养基使用的水应按照《生活饮用水卫生标准》（gb57492018）执行。
本发明通过对种子的脱毒，这样实现从源头上改良种球退化、控制种球病菌、提高种球安全意义重大，对于健康脱毒的百合种球，进行商品化、规模化生产，在降低生产成本的同时可以有效解决种球带毒、退化、品质下降的难题，促进百合增产、农民增收，将无菌种苗移栽至不同配比、不同种类基质中，进行炼苗驯化处理，筛选出最佳的种苗栽培条件，提高种苗成活率，将培养的鳞片茎尖接种于带有病毒唑的培养基上，通过设置不同浓度的病毒唑，筛选出脱毒率、成活率以及再生速率快的最佳配方，切实解决生产用种成本高、种球退化、种球繁殖数量少的问题。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
1.龙牙百合脱毒方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1、组培室消毒灭菌：用84消毒液稀释至1000倍或75%乙醇喷洒洗涤组培室地面，保持室内清洁，每30d用高锰酸钾及次氯酸混合熏蒸，在接种室接种前15d用紫外灯照射30min，超净工作台接种前用紫外灯照射30min，随后关闭紫外灯通风20min以上，用湿拖把轻轻打扫超净工作台四周，降低尘埃，接着用75％乙醇擦拭台面操作区域；
s2、培养基配制与处理：a、培养基配制，基本培养基为ms培养基，初代培养附加糖80g/l，其余培养基配方除特殊说明均附加糖80g/l，琼脂粉浓度为7g/l；b、ph值的调整，用酸度计或精密ph试纸进行调试，ph值为5.8，当ph<5.8时用1m的naoh调节，ph>5.8时用1m的hci调节；c、培养基的分装，配制好的培养基趁热分装，200ml组培瓶每瓶装40-50ml，厚度1cm左右，分装后立即封口，做好标记；d、培养基的灭菌与储藏，将装入培养基的组培瓶放入高压灭菌锅内，压力0.11mpa，温度121℃，灭菌30min，灭菌后取出培养基放置于培养室中冷却待用，放置时间为3天，以便观察培养基灭菌情况，无污染后进行接种使用，灭菌后的培养基可在无菌或洁净实验宣内储藏不超过30d；
s3、外植体诱导成球：a、外植体选取，以龙牙百合鳞片为外植体，选取完整无病虫害且周径≥12cm的龙牙百合种球，剔除外层带病斑的鳞片，由外向内完整地剥取中层鳞片，浸泡于清水中10min，用流水冲洗鳞片表面泥垢30min以上，保证鳞片洁净无瑕；b、外植体消毒灭菌，用75％乙醇灭菌20s，再用0.1％的升汞溶液浸泡15min，每隔30s进行摇动，使鳞片充分与溶液混合，最后用无菌水冲洗5次，沿鳞片切除周围1mm的外围部分，然后选取外层下部与鳞茎盘相连的部分为最佳外植体，横切约为1cm厚的小块；c、愈伤培养，1）鳞片接种，将准备好的切片底部带伤口面向上轻轻按压于诱导愈伤培养基上；2）培养条件，将接种好的组培瓶放置于25℃士2℃培养室中，暗培养30-40d，鳞片顶部伤口处即形成淡黄色的愈伤，在培养期间，每隔25-30d更换1次培养基，3）、愈伤培养基配方，ms 1.0mg/l6-ba 1.0mg/l2,4-d 蔗糖80.0g/l 琼脂7g/l，ph5.8；d、小鳞茎培养，1）愈伤接种，将鳞片上的愈伤取出并切成黄豆粒大小，平放于诱导愈伤培养基上；2）培养条件，愈伤及成鳞茎诱导均放置于培养室中，置于25℃士2℃，进行光照与黑暗比例为16h/8h条件下培养，光照强度为3000lx-5000lx，培养期间，每隔25-30d更换一次培养基；3）培养基配方，ms 1mg/l6-ba 80g/l蔗糖 7g/l琼脂，ph5.8；
s4、小鳞茎增大培养：a、小鳞茎接种，将分化的小鳞茎接种到鳞茎增大培养基上进行培养；b、培养条件，将接种的鳞茎，置于25℃士2℃条件下，暗培养50-60d即可长成直径大于0.5cm以上的鳞茎，在培养期间，每隔20d更换一次培养基；c、培养基配方，ms 1.0ml/giba 蔗糖80.0g/l 7g/l琼脂，ph5.8；d、打破休眠，将长成的组培鳞茎，整瓶转至4℃暗培养的冷藏室内，培养50-60d打破休眠；e、热处理，将解除休眠的百合鳞茎，整瓶置于人工气候箱中，45℃恒温培养箱中进行7d；
s5、茎尖培养成鳞茎：a、茎尖接种，把热处理过的百合组培鳞茎，在40倍的解剖镜下，用解剖刀剥除外部鳞片漏出生长点，用解剖针挑取0.6mm-0.8mm大小的茎尖生长点接种到诱导愈伤培养基上；b、培养条件，将接种的茎尖至于25℃条件下，遮光暗箱培养60d-80d，每25-30d更换一次培养基；c、培养基配方，ms 2.5mg/lpicloram 6-8mg/l病毒唑 80g/l糖 7g/l琼脂，ph为5.8；d、愈伤诱导成球，按s3与s4的步骤进行百合籽球的培养；
s6、病毒检测：将通过茎尖最终诱导成球的百合组培鳞茎，采用多重rt—pcr法进行百合主要病毒，如百合潜隐病毒、异名百合斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、百合无症病毒、郁金香碎花病毒和百合丛簇病毒主要病毒检测，检测结果为阴性，说明组培鳞茎不带病毒可作为百合无病毒种源继续扩繁，如果为阳性，说明脱毒不够彻底，不能作为百合无病毒种源；
s7、档案记载：详细记载龙牙百合脱毒技术中各个组培阶段的培养基配方与培养环境条件。
2.根据权利要求1所述的龙牙百合脱毒方法，其特征在于，所述脱毒设备参照《东方百合脱毒技术规程》（db32t3372-2018）中设备准备及执行。
3.根据权利要求1所述的龙牙百合脱毒方法，其特征在于，所述配制培养基使用的水应按照《生活饮用水卫生标准》（gb57492018）执行。
技术总结