本发明属于鱼类杂交育种
技术领域：
，特别是指一种耐低氧青石斑鱼杂交育种方法。
背景技术：
：石斑鱼是世界上主要的海水养殖和捕捞鱼类。2019年，我国石斑鱼养殖和捕捞产量分别达到183127吨和97411吨，产量位于海水养殖鱼类第二位，产值达200亿元以上。青石斑鱼(epinephelusawoara)在分类学上属鲈形目(perciformes)、石斑鱼科(epinephelidae)、石斑鱼属(epinephelus)，俗名为土斑。青石斑鱼是一种栖息在海暖水性中下层的上等名贵鱼类，常分布于北太平洋西部海域，在我国多分布于南海海域及东海南部。青石斑鱼营养价值高，味道鲜美，市场价格高。青石斑鱼肌肉中不饱和脂肪酸的含量达到66.38％以上，二十二碳六烯酸(dha)含量达到6.49-14.14％，dha被称为脑黄金，对心血管疾病有预防作用。青石斑鱼成鱼形状为长椭圆形，并稍微侧扁，鱼体表面鳞片为细栉鳞，鱼体散布着黄褐色斑点，体背部为深褐色，体腹部为浅褐色，体侧部分长有五条粗细不等的褐色条纹。青石斑鱼的活动水域水深常在2-30m，最适生长温度为22-28℃。但是，青石斑鱼生长速度较慢，当年生长可达到120g以上，在市场上养殖总量相对较低。技术实现要素：本发明的目的是提供一种耐低氧青石斑鱼杂交育种方法，旨在解决现有技术中的青石斑鱼生长慢而导致其养殖效益低的问题。为了解决上述技术问题，本发明主要是通过以下技术方案加以实现的：本发明的一种耐低氧青石斑鱼杂交育种方法，包括以下步骤：1)蓝身大斑石斑鱼亲鱼培育和精子的获取选择体长50-70cm、体重20-30kg的雄性蓝身大斑石斑鱼，在工厂化养殖环境中培育，培育条件是：溶解氧7-10mg/l，水流交换量3-4m3/h，自然光，培育时间5-9个月，培育温度18-25℃；第一年10月份开始培育，水温23-24℃，到12月份，水温逐渐下降至18-20℃，再到次年3月份，水温又逐渐升高至25-26℃；在4月份至6月份水温达到25-26℃时，选择体型较大、成熟的雄性蓝身大斑石斑鱼，挤压腹部采集精液；2)精子冷冻保存将步骤1)所得的精液，置于冷冻保存液中，于3-4℃下平衡5-8min，然后，置于液氮蒸汽中平衡10-12min，最后，置于液氮中低温保存；3)青石斑鱼亲鱼培育和卵子的获取选择体长20-25cm、体重0.5-1.0kg的雌性青石斑鱼，在工厂化养殖环境中的培育，培育条件是：溶解氧5-9mg/l，盐度25-31‰，水流交换量2-3m3/h，水温12-29℃，培育时间为5-9个月；当4月份水温达到23-26℃时，选择发育良好、腹部膨大的雌性青石斑鱼，采用ms-222麻醉，并在其胸鳍基部注入绒毛膜促性腺激素和促性腺激素释放激素类似物，注射48-60h之后，挤压雌性青石斑鱼的腹部，获得卵子；4)人工授精取步骤2)所得的蓝身大斑石斑鱼冷冻精液，在36-37℃下，解冻，倒入步骤3)所得的卵子中，加入海水，使精液和卵子混合均匀受精；然后，加入高盐度海水，收集上浮卵，清洗，孵化；5)孵化管理孵化6-10h，置于高盐度海水中，再次上浮，收集上浮受精卵，置于养殖池中孵化培育，培育条件为：放卵密度30-45g/m3、盐度29-30‰、温度25-27℃、溶解氧6-10mg/l；6)后期培育在2-4日龄，卵黄囊即将完全吸收时，投喂牡蛎受精卵和小球藻；3-16日龄，投喂s轮虫；13-35日龄，投喂l形轮虫；25-45日龄，投喂卤虫无节幼体；从40-55日龄开始，投喂成年卤虫，然后，逐渐过渡到配合颗粒饲料；及时筛苗，黑暗条件下养殖，获得青石斑鱼杂交育鱼。本发明的青石斑鱼杂交育鱼是以青石斑鱼为母本以蓝身大斑石斑鱼为父本培育而成的一种新的青石斑鱼杂交育鱼，这种青石斑鱼杂交育鱼的受精率与孵化率与纯种相近。但是，这种青石斑鱼杂交育鱼的成活率高，在相同饲养条件下，其纯种青石斑鱼在第11天时存活率仅为5％，而此杂交种的存活率为40％；这种青石斑鱼具有显著的生长优势，培育至13月龄时杂交种体重是纯种体重的3.16倍，至17个月龄时杂交种体重为纯种的体重的2.52倍；这种青石斑鱼杂交育鱼耐低温，杂交种在冬季北方工厂化车间可正常养殖，16-18℃左右正常摄食和生长；青石斑鱼杂交育鱼耐低氧，耗氧率明显低于纯种青石斑鱼，窒息点也明显低于纯种青石斑鱼；这种青石斑鱼杂交育鱼的形态和体色均一，与母本较相似，市场接受程度高，经济效益可观。作为一种优选的实施方案，所述步骤2)中，冷冻保存液为els-3冷冻稀释液，els-3冷冻稀释液的组成为：每升蒸馏水中含葡萄糖10g、nacl10g、nahco30.5g和小牛血清10ml。蓝身大斑石斑鱼(epinephelustukula)俗名金钱斑，是一种生活在暖温性海域中的中大型礁栖性鱼类，是已知最大的石斑鱼之一，生长速度快，成年鱼体长至少200cm，体重至少100kg，多分布于印度-太平洋区域，在我国的分布范围通常在台湾北部以及南部海域。蓝身大斑石斑鱼成鱼形状呈长椭圆形、侧扁，鱼体表面鳞片为栉鳞；鱼体灰白色，除头部分布着黑色小斑点外，其余各部覆盖着大小形状不等的褐色斑块。蓝身大斑石斑鱼生长速度快，但是，雄鱼产精量很少，并且，人工养殖条件下雌鱼难于产卵，因此，蓝身大斑石斑鱼的人工育苗很难开展。由于地理分布、生活环境和繁殖水温等原因，蓝身大斑石斑鱼和青石斑鱼具有生殖隔离，因此，在自然条件下不可能进行自然交配。因此，通过蓝身大斑石斑鱼精子保存技术和杂交育种相结合，可以实现两种鱼的杂交优势性状的结合，达到优良新品种育种。因此，本发明蓝身大斑石斑鱼的精液先进行收集并置于els-3冷冻稀释液中冷冻保存，不仅解决了蓝身大斑石斑鱼雄鱼产精量少的问题，还解决了青石斑鱼和蓝身大斑石斑鱼的生殖隔离，实现了青石斑鱼和蓝身大斑石斑鱼的杂交育种。作为一种优选的实施方案，所述步骤2)中，冷冻保存液与精液的体积比1:1。本发明蓝身大斑石斑鱼的精液先储存在冷冻保存液中，控制精液与冷冻保存液的体积比；通常情况下，蓝身大斑石斑鱼的采精方法是：采用ms-222全池将蓝身大斑石斑鱼麻醉，用手挤压蓝身大斑石斑鱼的腹部，选择有精液流出，体型较大且成熟的雄性，挤压腹部采集精液。采精过程中，用手挤压腹部通过塑料吸管收集精液，放于2ml冷冻管中，每管约1.5ml精液，应及时用卫生纸擦除排泄孔流出的尿液，以减少对后续冷冻精子操作的负面影响；在控制好温度和营养的情况下可产精至八月中旬；在挤精过程中应避免有海水混入，否则会提前激活精子，使精子冷冻保存失败；提前解冻观察精子活力，选择精子活力强的那一批冷冻精子运至目的地与卵子授精。作为一种优选的实施方案，所述步骤3)中，绒毛膜促性腺激素的用量为200-300iu/kg，促性腺激素释放激素类似物的用量为35μg/kg。本发明将绒毛膜促性腺激素和促性腺激素释放激素类似物注入胸鳍基部，控制绒毛膜促性腺激素和促性腺激素释放激素类似物的用量，使其用量适宜，避免额外伤害。作为一种优选的实施方案，所述步骤3)中，绒毛膜促性腺激素和促性腺激素释放激素类似物是共同溶解在质量浓度为0.9％的生理盐水中。本发明中可以将绒毛膜促性腺激素和促性腺激素释放激素类似物均溶解在0.9％的生理盐水中制成均一的溶液，然后，一次性的注入胸鳍基部，操作方便，便于注射；通常情况下，每条鱼约注射混合好的绒毛膜促性腺激素和促性腺激素释放激素类似物生理盐水溶液1ml。作为一种优选的实施方案，所述步骤4)和所述步骤5)中，高盐度海水的质量浓度为33-35‰。本发明采用高盐度海水使受精率上浮并收集上浮卵，石斑鱼卵为上浮卵，高盐度海水才会把好的上浮受精卵筛选出来，沉底的为过熟卵和死卵。作为一种优选的实施方案，所述步骤4)中，清洗是采用盐度为33-35‰的高盐度海水清洗。本发明还采用海水清洗上浮卵，清洗的目的是为了避免孵化过程中其他污染物的干扰，由于在挤卵过程中亲鱼的血液和排泄物也会一起挤出，所以要把这些污染物清洗掉。作为一种优选的实施方案，所述步骤6)中，牡蛎受精卵的投喂量为20个/ml，小球藻的投喂量为50×104个/ml，s轮虫的投喂量为12-15个/ml，轮虫的投喂量为12-15个/ml，卤虫无节幼体的投喂量为3-4个/ml，成年卤虫的投喂量为3-4个/ml。本发明的受精率从出膜之后，依次投喂小球藻、牡蛎受精卵、s轮虫、l轮虫、卤虫幼体、卤虫成体、不同规格配合颗粒饲料，利用生物饵料进行培育；并根据石斑鱼的生长状况，调整投喂量和投喂时间。当鱼苗规格不同时，应及时筛苗，避免自残。本发明中黑暗条件是指室内养殖，除了喂食及清污时开灯外，其余时间关闭所有灯光以避免互残。本发明的鱼苗在生长过程中存在着大鱼吃小鱼的现象，导致大鱼和小鱼同时死亡；为了避免这种情况，当个体间的大小差异明显时，将不同大小的鱼放入不同的池塘；另外，除了喂食之外，保持车间处于黑暗状态，这样，鱼苗长期在黑暗状态下生长，降低了鱼苗的攻击性，进一步避免了大鱼吃小鱼的现象。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的青石斑鱼杂交育鱼是以青石斑鱼为母本以蓝身大斑石斑鱼为父本培育而成的一种新的青石斑鱼杂交种，这种青石斑鱼杂交种的受精率与孵化率与纯种相近。但是，这种青石斑鱼杂交种成活率高，在相同饲养条件下，纯种青石斑鱼在第11天时存活率仅为5％，而此杂交种的存活率为40％；这种青石斑鱼具有显著的生长优势，培育至13月龄时杂交种体重是纯种体重的3.16倍，至17个月龄时杂交种体重达到了纯种的体重的2.52倍；这种青石斑鱼杂交育鱼耐低温，杂交种在冬季北方工厂化车间可正常养殖，16-18℃左右正常摄食和生长；青石斑鱼杂交种耐低氧，耗氧率明显低于纯种青石斑鱼，窒息点也明显低于纯种青石斑鱼；这种青石斑鱼杂交育鱼的体形特征与母本青石斑鱼相似，杂交后代形态和体色一致，市场接受程度高，经济效益可观。附图说明图1为本发明所得的青石斑鱼与蓝身大斑石斑鱼杂交后代的染色体核型图；图2为本发明所得的青石斑鱼与蓝身大斑石斑鱼杂交后代的外观照片图；图3为纯种青石斑鱼的外观照片图。具体实施方式下面将结合本发明的具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明的一种耐低氧青石斑鱼杂交育种方法，包括以下步骤：1)蓝身大斑石斑鱼亲鱼培育和精子的获取选择体长50-70cm、体重20-30kg的雄性蓝身大斑石斑鱼，在工厂化养殖环境中的培育，培育条件是：溶解氧7-10mg/l，水流交换量3-4m3/h，自然光，培育时间5-9个月，培育温度18-25℃；第一年10月份开始培育，水温23-24℃，到12月份，水温逐渐下降至18-20℃，再到次年3月份，水温又逐渐升高至25-26℃；在4月份至6月份水温达到25-26℃时，选择体型较大、成熟的雄性蓝身大斑石斑鱼，挤压腹部采集精液；2)精子冷冻保存将步骤1)所得的精液，置于冷冻保存液中，于3-4℃下平衡5-8min，然后，置于液氮蒸汽中平衡10-12min，最后，置于液氮中低温保存；3)青石斑鱼亲鱼培育和卵子的获取选择体长20-25cm、体重0.5-1.0kg的雌性青石斑鱼，在工厂化养殖环境中的培育，培育条件是：溶解氧5-9mg/l，盐度25-31‰，水流交换量2-3m3/h，水温12-29℃，培育时间为5-9个月；当4月份水温达到23-26℃时，选择发育良好、腹部膨大的雌性青石斑鱼，采用ms-222麻醉，并在其胸鳍基部注入绒毛膜促性腺激素和促性腺激素释放激素类似物，注射48-60h之后，挤压雌性青石斑鱼的腹部，获得卵子；4)人工授精取步骤2)所得的蓝身大斑石斑鱼冷冻精液，在36-37℃下，解冻，倒入步骤3)所得的卵子中，加入海水，使精液和卵子混合均匀；然后，加入高盐度海水，收集上浮卵，清洗，孵化；5)孵化管理孵化6-10h，置于高盐度海水中，再次上浮，收集上浮受精卵，置于养殖池中养殖，养殖条件为：密度30-45g/m3、盐度29-30‰、温度25-27℃、溶解氧6-10mg/l；6)后期培育在2-4日龄，卵黄囊即将完全吸收时，投喂牡蛎受精卵和小球藻；3-16日龄，投喂s轮虫；13-35日龄，投喂l形轮虫；25-45日龄，投喂卤虫无节幼体；从40-55日龄开始，投喂成年卤虫，然后，逐渐过渡到配合颗粒饲料；及时筛苗，黑暗条件下养殖，获得青石斑鱼杂交育鱼。优选地，所述步骤2)中，冷冻保存液为els-3冷冻稀释液，els-3冷冻稀释液的组成为：每升蒸馏水中含葡萄糖10g、nacl10g、nahco30.5g和小牛血清10ml。优选地，所述步骤2)中，冷冻保存液与精液的体积比1:1。优选地，所述步骤3)中，绒毛膜促性腺激素的用量为200-300iu/kg，促性腺激素释放激素类似物的用量为35μg/kg。进一步地，所述步骤3)中，绒毛膜促性腺激素和促性腺激素释放激素类似物是共同溶解在质量浓度为0.9％的生理盐水中。优选地，所述步骤4)和所述步骤5)中，高盐度海水的质量浓度为33-35‰。进一步地，所述步骤4)中，清洗是采用质量浓度为33-35‰的高盐度海水清洗。优选地，所述步骤6)中，牡蛎受精卵的投喂量为20个/ml，小球藻的投喂量为50×104个/ml，s轮虫的投喂量为5-10个/ml，轮虫的投喂量为5-10个/ml，卤虫无节幼体的投喂量为3-4个/ml，成年卤虫的投喂量为3-4个/ml。实施例一蓝身大斑石斑鱼和青石斑鱼培育蓝身大斑石斑鱼养殖环境为工厂化养殖，养殖池大小为6m×6m×3m，每池放养30尾蓝身大斑石斑鱼，共80尾蓝身大斑石斑鱼，全长50-70cm，体重20-30kg。池内溶解氧(do)为7-10mg/l，水流交换量为3-4m3/h，采用自然光。水温在第一年10月份时为23-24℃，到12月份时水温逐渐下降至18-20℃，再到次年3月份时水温逐渐升高至25-26℃；当4月份至9月份水温稳定于25-26℃时，可选择成熟雄鱼采集精液。其中，亲本投喂饵料为鲐鱼、鲅鱼的任一种或者两种的任意比例混合投喂，投喂量约为亲鱼体重的2-3％。日常定期倒池，保持水质清新。青石斑鱼为网箱养殖，网箱尺寸为5m×5m×3m，每个网箱放养50尾青石斑鱼，全长20-25cm，体重0.5-1.0kg。饵料投以鳀鱼或冻、鲜杂鱼为饵料，投饵率为体重的2-3％，日投两次。溶解氧为5-9mg/l，盐度25-31‰，温度为福建附近海域外海水温度，水温范围为12-29℃；当4月份水温达到23-26℃时，选择成熟雌鱼采集卵子。实施例二蓝身大斑石斑鱼精子冷冻保存(1)成熟精子的获取蓝身大斑石斑鱼在人工调控环境下，产精时间从4月延续至9月中旬，此时，通过冷冻精子技术可以长期保存珍贵且量少的蓝身大斑石斑鱼精子，可用于次年与青石斑鱼卵授精。生殖季节每隔半个月采一次精液，采完精液的雄鱼放入另一水质清新的鱼池。采精前采用ms-222全池麻醉，将雄鱼置于产床，用手挤压腹部，选择有精液流出的成熟的雄性，挤压腹部获得精液。在挤精过程中应避免有海水混入，否则会提前激活精子，在挤精过程中应及时用卫生纸擦除排泄孔流出的尿液，避免混入精液中。采精的步骤为：用手挤压腹部，通过塑料吸管收集精液，放于2ml冷冻管中，每管约装1.5ml精液，再将冷冻管置于事先准备好的保温盒中，盒内装碎冰块；同时利用显微镜检测精子活力，之后再进行分装。2020年繁殖期收集精液约50ml，精子活力达到90％以上。(2)精子冷冻保存将精液与冷冻稀释液els-3以1:1比例稀释，摇晃混匀。els-3的配方为每升蒸馏水中含葡萄糖10g，nacl10g，nahco30.5g，小牛血清10ml(体积比)。精子冷冻过程分三步，首先，将装有精子冷冻管在4℃冰箱中平衡5min，其次，放入10×10cm的布袋中，每袋6-8支，将布袋放在离液氮表面约10cm的液氮罐蒸汽中平衡10min；然后，将布袋投入液氮(-196℃)中冷冻保存。低温保存24小时后，随机抽取2个冷冻管解冻通过显微镜观察精子活力，精子存活率达75-85％以上。利用此方法建立了蓝身大斑石斑鱼精子冷冻库，冷冻保存精子达到100ml。在使用之前，解冻观察精子活力，选择精子活力强的冷冻精子与卵子授精。冷冻精子可以利用液氮罐在国内长途运输到任一养殖公司，与青石斑鱼雌鱼进行杂交育种。2020年在青石斑鱼繁殖季节，将蓝身大斑石斑鱼冷冻精子从山东某公司利用液氮罐运输到福建漳浦，与当地培育的青石斑鱼进行杂交苗种培育实施例三蓝身大斑石斑鱼冷冻精子与青石斑鱼卵人工授精(1)青石斑鱼催产当4月份水温达到23-26℃时，选择发育良好、腹部膨大的雌性青石斑鱼；将绒毛膜促性腺激素和促性腺激素释放激素类似物注入胸鳍基部，绒毛膜促性腺激素的剂量为200-300iu/kg，促性腺激素释放激素类似物的剂量为35μg/kg，二者混于0.9％的生理盐水中，每条鱼约注射1ml。注射48-60小时后，通过吸管吸出卵子观察发育状态，选择成熟雌鱼，置于产卵床上，挤压鱼的腹部收集卵子，然后，将卵子收集在干燥的塑料盆中，共获得卵子10kg。(2)冷冻精子与卵授精在青石斑鱼注射催产针后的48-60小时中，每隔3小时左右挤卵一次。卵子挤出之后，将蓝身大斑石斑鱼冷冻精子从液氮罐中取出，在37℃水浴锅中解冻，当冷冻精液刚刚解冻时及时从水浴锅中取出，以免温度过高对精子活力产生负面影响。然后，倒入盛有卵子的塑料盆中，大约1000ml卵子与1ml精液授精，之后用海水将冷冻管中的精液冲洗干净倒入塑料盆，边加海水边把精子和卵子混合均匀，使二者充分接触，随后将受精卵置于具有高盐度海水(盐度为33-35‰)的塑料盆中使其上浮，然后，将上浮卵用筛绢收集，用海水清洗后放入孵化池中孵化，孵化池体积3m3，池内不间断充气，微沸状，以避免受精卵沉底，温度28℃，盐度29-30‰。实施例四杂交受精卵的运输、孵化和苗种培育(1)受精卵运输和孵化：在孵化大约8小时之后，受精卵发育至囊胚期左右时，将受精卵置于具有高盐度海水的塑料盆中，再次上浮，高盐度海水为33-35‰。收集上浮受精卵，利用尼龙袋充氧、打包空运至目的公司，打包及运输过程中动作应轻柔，并尽量减少行程所用时间，共运回目的公司杂交种和纯种的受精卵各1kg。到达目的公司后将受精卵分别转移到7m3的养殖池中，每池放卵约200-300g进行孵化。养殖池的培养条件为盐度29-30‰、温度25-27℃、溶解氧6-10mg/l。(2)鱼苗培育孵化鱼苗在2-4日龄，卵黄囊即将完全吸收时，采用牡蛎受精卵(20个/ml)和小球藻(50×104个/ml)投喂；3-16日龄时，采用s轮虫(12-15个/ml)投喂；13-35日龄时，采用强化剂强化的l形轮虫(12-15个/ml)投喂；25-45日龄时，采用卤虫无节幼体(3-4个/ml)投喂；从40到55日龄开始，采用成年卤虫(3-4个/ml)投喂，然后，逐渐过渡到配合颗粒饲料，早晨8点和下午5点各投喂一次，利用生物饵料培育，从而获得青石斑鱼杂交育鱼。在其生长过程中，存在着大鱼吃小鱼的现象，导致大鱼和小鱼同时死亡。为了避免这种情况，当个体间的大小差异明显时，应及时分选和筛鱼，将不同大小的鱼放入不同的养殖池，避免自残。实施例五杂交种和纯种养殖对比(1)养殖过程同一批青石斑鱼的卵子分别与蓝身大斑石斑鱼冷冻精子和青石斑鱼新鲜精子授精，从而获得杂交种与纯种，二者的受精卵所处外界环境相同，在受精后3小时和出膜前，统计二者的受精率和孵化率；孵化苗种培育到11-20天时，对苗种成活率进行初步统计。杂交种和纯种在6月龄前于室内水泥池流水养殖，培育池内水体为7m3，溶解氧6-10mg/l，盐度29‰，温度25-26℃；5-6月龄时水温随外海水温度逐渐降低至约20-22℃，于6月龄从培育车间转移到养成车间，养成车间为工厂化流水养殖条件，养殖池内水体为24m3，分别放养1000尾杂交种和纯种鱼苗，夏秋季温度控制在20-24℃，冬春季温度16-20℃，每天早晨和下午各投喂一次配合颗粒饲料。(2)养殖结果在相同的条件下，杂交种受精率为83.4％，孵化率为75.3％；纯种受精率为87.6％，孵化率为78.7％，因此，杂交种的受精率与孵化率与纯种相近。杂交苗种培育到11-20天时，成活率为40％左右，而此时，纯种的成活率只有5％左右。在4月龄、13月龄和17月龄时，各取30-50尾杂交种和纯种，分别采用ms-222麻醉之后，对其体重、全长、体长、头长、体高等生长数据进行测量，测量结果列入表1。表1青石斑鱼(♀)×蓝身大斑石斑鱼(♂)杂交后代与青石斑鱼纯种鱼的生长特性对比由表1可以看出，在4个月的月龄时，青石斑鱼和蓝身大斑石斑鱼的杂交后代就显示出了生长快的优势，杂交后代(也简称杂交鱼)的体重开始大于纯种青石斑鱼的体重，杂交后代的全长也开始大于纯种青石斑鱼的全长，杂交后代的体长也大于纯种青石斑鱼的体长。在13个月的月龄时，青石斑鱼和蓝身大斑石斑鱼的杂交后代的体重是青石斑鱼纯种鱼的3.16倍，杂交后代的全长是纯种青石斑鱼全长的1.42倍，杂交后代的体长是纯种青石斑鱼体长的1.40倍。在17个月的月龄时，青石斑鱼和蓝身大斑石斑鱼的杂交后代的体重是青石斑鱼纯种鱼的2.52倍，杂交后代的全长比纯种青石斑鱼的全长大约长8cm，杂交后代的体长比纯种青石斑鱼的体长大约长6cm。因此，杂交种与纯种相比具有明显的生长优势。实施例六杂交种和纯种耐低氧养殖对比从实施例五中选取17个月月龄的纯种青石斑鱼和杂交后代，分别分成三组对照，每个对照4尾鱼，青石斑鱼共12尾，总重3139g，杂交种共12尾，总重6229g。在22℃条件下，进行耗氧率和窒息点测试，实验过程如下：将实验鱼放入三个透明箱子，每个箱子四尾鱼，加满水，用塑料薄膜贴在水面上并盖上盖子密封；取初始水样放于水样瓶中固定，一小时后取水样固定，当箱中有两尾鱼失去平衡倒下且鳃盖不动后取水样固定。24小时之内通过碘量法测溶解氧，并计算耗氧率和窒息点，测试结果列入表2。表2青石斑鱼(♀)×蓝身大斑石斑鱼(♂)杂交后代与青石斑鱼纯种鱼的耐氧特性对比鱼种耗氧率(mg/g·h)窒息点(mg/ml)青石斑鱼0.1438±0.02140.5269±0.0260青石斑鱼(♀)×蓝身大斑石斑鱼0.0976±0.00640.3903±0.0125由表2可以看出，相同条件下，青石斑鱼和蓝身大斑石斑鱼的杂交后代的耗氧率为0.0976±0.0064mg/g/h，然而，纯种青石斑鱼的耗氧率为0.1438±0.0214mg/g/h；通过spss独立样本t检验分析可知，杂交后代和纯种青石斑鱼的耗氧率之间有显著性差异；因此，杂交后代的耗氧率明显低于纯种青石斑鱼的耗氧率。另外，相同条件下，青石斑鱼和蓝身大斑石斑鱼的杂交后代的窒息点为0.3903±0.0125mg/ml，然而，纯种青石斑鱼的窒息点为0.5269±0.0260mg/ml；通过spss独立样本t检验分析可知，杂交后代和纯种青石斑鱼的窒息点之间有显著性差异；因此，杂交后代的窒息点明显低于纯种青石斑鱼的窒息点。所以，本发明所得的青石斑鱼和蓝身大斑石斑鱼的杂交后代较纯种青石斑鱼更耐低氧。实施例七遗传性测试实验通过头肾-秋水仙素法制备染色体，随机选取纯种青石斑鱼20尾，体重在10-19g/尾，随机选取青石斑鱼(♀)×蓝身大斑石斑鱼(♂)杂交后代20尾，体重在10-13g/尾。向样本胸腔内注射pha溶液，剂量为6μg/g；12h后，向样本胸腔同一位置内注射秋水仙素溶液，剂量为10μg/g；3小时后，利用ms-222(180mg/l)将样本麻醉，用剪刀从臀鳍基部斜向上剪至出血，放血10min后取出头肾，并用生理盐水洗涤三次。用剪刀将头肾完全剪碎，通过260目筛绢过滤，收集过滤液于四个刻度离心管中，并使离心管中的肾细胞液体积两两相同。之后向细胞液中各加入3ml0.075mol/l的kcl溶液，室温下低渗处理30min，并用吸管轻轻吹打沉淀细胞，然后向细胞液中加入新配制的卡诺氏固定液(v(甲醇):v(冰醋酸)＝3:1)，补充至4.5ml，并放置在0℃的冰盒内，预固定10min，之后进行固定，将预固定后的细胞悬液离心10min(4000r/min)。倒去上清液，加卡诺氏固定液至4.5ml，并用吸管轻轻吹打沉淀细胞，室温下固定45min；再次离心后，进行第二次固定，室温下固定30min；再次离心后，进行第三次固定，室温下固定30min，固定过程中用吸管轻轻吹打沉淀细胞。第四次离心后，向细胞沉淀中加入1ml左右卡诺氏固定液，放入冰盒中待用。采用冷片法滴片，取干净载玻片(已在冰箱内盛有乙醇的烧杯中预冷半小时)，吸取细胞悬液并从15-20cm的高度在载玻片上滴1-2滴，使细胞铺展开，用酒精灯使载玻片燃起火焰，随后在室温下自然干燥。最后用磷酸缓冲液配制10％giemsa染液，对干燥后的载玻片染色45分钟，之后用蒸馏水冲洗，在室温下自然干燥，并在显微镜下观察拍照。由附图1可以看出，杂交种的染色体核型公式为核型公式为2n＝1sm 47t，nf＝49，具有一条不成对的异染色体，此现象除了拟青石斑鱼还未在别的石斑鱼中发现。因此，本发明的青石斑鱼和蓝身大斑石斑鱼杂交后代在遗传上具有独特性，杂交种的染色体核型公式为核型公式为2n＝1sm 47t，nf＝49；而其父本和母本都为2n＝48t，nf＝48。由图2和图3可以看出，本发明的青石斑鱼和蓝身大斑石斑鱼杂交后代个头大，身体胖，肉多；然而，纯种青石斑鱼个头小，身体细；因此，本发明的青石斑鱼和蓝身大斑石斑鱼杂交后代在体型和体长上明显大于纯种青石斑鱼。另外，本发明的这种青石斑鱼杂交种的体形特征与母本青石斑鱼相似，杂交后代形态和体色均一。因此，与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的青石斑鱼杂交种是以青石斑鱼为母本以蓝身大斑石斑鱼为父本培育而成的一种新的石斑鱼杂交种，这种石斑鱼杂交育鱼的受精率与孵化率与纯种相近。但是，这种青石斑鱼杂交育鱼的成活率高，在相同饲养条件下，纯种青石斑鱼在第11天时存活率仅为5％，而此杂交种的存活率为40％；这种青石斑鱼具有显著的生长优势，培育至13月龄时杂交种体重是纯种体重的3.16倍，至17个月龄时杂交种体重为纯种的体重的2.52倍；这种青石斑鱼杂交育鱼耐低温，杂交种在冬季北方工厂化车间可正常养殖，16-18℃左右正常摄食和生长；青石斑鱼杂交育鱼耐低氧，耗氧率明显低于纯种青石斑鱼，窒息点也明显低于纯种青石斑鱼；这种青石斑鱼杂交育鱼的体形特征与母本青石斑鱼相似，杂交后代形态和体色均一，市场接受程度高，经济效益可观。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种耐低氧青石斑鱼杂交育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)蓝身大斑石斑鱼亲鱼培育和精子的获取
选择体长50-70cm、体重20-30kg的雄性蓝身大斑石斑鱼，在工厂化养殖环境中培育，培育条件是：溶解氧7-10mg/l，水流交换量3-4m3/h，自然光，培育时间5-9个月，培育温度18-25℃；第一年10月份开始培育，水温23-24℃，到12月份，水温逐渐下降至18-20℃，再到次年3月份，水温又逐渐升高至25-26℃；
在4月份至6月份水温达到25-26℃时，选择体型较大、成熟的雄性蓝身大斑石斑鱼，挤压腹部采集精液；
2)精子冷冻保存
将步骤1)所得的精液，置于冷冻保存液中，于3-4℃下平衡5-8min，然后，置于液氮蒸汽中平衡10-12min，最后，置于液氮中冷冻保存；
3)青石斑鱼亲鱼培育和卵子的获取
选择体长20-25cm、体重0.5-1.0kg的雌性青石斑鱼，在工厂化养殖环境中的培育，培育条件是：溶解氧5-9mg/l，盐度25-31‰，水流交换量2-3m3/h，水温12-29℃，培育时间为5-9个月；
当4月份水温达到23-26℃时，选择发育良好、腹部膨大的雌性青石斑鱼，采用ms-222麻醉，并在其胸鳍基部注入绒毛膜促性腺激素和促性腺激素释放激素类似物，注射48-60h之后，挤压雌性青石斑鱼的腹部，获得卵子；
4)人工授精
取步骤2)所得的蓝身大斑石斑鱼冷冻精液，在36-37℃下，解冻，倒入步骤3)所得的卵子中，加入海水受精，使精液和卵子混合均匀，静置5min；然后加入高盐度海水，收集上浮卵，清洗，孵化；
5)孵化管理
孵化6-10h，置于高盐度海水中，再次上浮，收集上浮受精卵，置于养殖池中孵化培育，养殖条件为：密度30-45g/m3、盐度29-30‰、温度25-27℃、溶解氧6-10mg/l；
6)后期培育
在2-4日龄，卵黄囊即将完全吸收时，投喂牡蛎受精卵和小球藻；3-16日龄，投喂s轮虫；13-35日龄，投喂l形轮虫；25-45日龄，投喂卤虫无节幼体；从40-55日龄开始，投喂成年卤虫，然后，逐渐过渡到配合颗粒饲料；及时筛苗，黑暗条件下养殖，获得青石斑鱼杂交育鱼。
2.根据权利要求1所述的耐低氧青石斑鱼杂交育种方法，其特征在于：
所述步骤2)中，冷冻保存液为els-3冷冻稀释液，els-3冷冻稀释液的组成为：每升蒸馏水中含葡萄糖10g、nacl10g、nahco30.5g和小牛血清10ml。
3.根据权利要求2所述的耐低氧青石斑鱼杂交育种方法，其特征在于：
所述步骤2)中，冷冻保存液与精液的体积比1:1。
4.根据权利要求1所述的耐低氧青石斑鱼杂交育种方法，其特征在于：
所述步骤3)中，绒毛膜促性腺激素的用量为200-300iu/kg，促性腺激素释放激素类似物的用量为35μg/kg。
5.根据权利要求4所述的耐低氧青石斑鱼杂交育种方法，其特征在于：
所述步骤3)中，绒毛膜促性腺激素和促性腺激素释放激素类似物是共同溶解在质量浓度为0.9％的生理盐水中。
6.根据权利要求1所述的耐低氧青石斑鱼杂交育种方法，其特征在于：
所述步骤4)和所述步骤5)中，高盐度海水的质量浓度为33-35‰。
7.根据权利要求1所述的耐低氧青石斑鱼杂交育种方法，其特征在于：
所述步骤4)中，清洗是采用质量浓度为33-35‰的高盐度海水清洗。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的耐低氧青石斑鱼杂交育种方法，其特征在于：
所述步骤6)中，牡蛎受精卵的投喂量为20个/ml，小球藻的投喂量为50×104个/ml，s轮虫的投喂量为12-15个/ml，轮虫的投喂量为12-15个/ml，卤虫无节幼体的投喂量为3-4个/ml，成年卤虫的投喂量为3-4个/ml。
技术总结本发明公开了一种耐低氧青石斑鱼杂交育种方法。本发明包括以下步骤：1)蓝身大斑石斑鱼亲鱼培育和精子的获取；2)精子冷冻保存；3)青石斑鱼亲鱼培育和卵子的获取；4)人工授精取蓝身大斑石斑鱼冷冻精液，解冻后与卵子混匀，加入海水受精；静置，加入高盐度海水，收集上浮卵；5)孵化管理孵化6‑10h，置于高盐度海水中，再次收集上浮受卵，置于养殖池中孵化培育；6)后期培育，利用生物饵料培育，获得青石斑鱼杂交鱼苗。本发明的青石斑鱼杂交育种所得的育苗成活率高，生长速度快，耐低氧，耐低温，杂交后代形态和体色均一，染色体核型为2n＝1sm 47t，具有独特的遗传特征和显著杂交优势，市场接受程度高，经济效益可观。
技术研发人员：田永胜;陈帅;王林娜;李振通;李子奇;黎琳琳;刘阳
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院黄海水产研究所
技术研发日：2020.11.20
技术公布日：2021.03.12
