本发明属于水产养殖病害防治技术领域，具体涉及25-羟基胆固醇(25-hydroxycholesterol，25hc)在制备水产生物病害防治制剂中的应用。
背景技术：
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
对虾是重要的经济养殖品种，对虾养殖业也在我国水产养殖中占有重要地位，但水产病害频发，使得水产养殖业蒙受巨大的损失。其中白斑综合征病毒(whitespotsyndromevirus，wssv)，是迄今为止危害最为严重的一种对虾病毒，它存在着爆发快，无有效的药物治疗方法等问题。目前主要采用综合预防的、优化对虾生长环境等方法减少白斑综合征病毒感染对虾的可能性。因此，迫切需要疗效可靠并且对养殖环境没有副作用的药物，来减少对虾感染的风险。
25-羟基胆固醇(25-hydroxycholesterol，25hc)，一种氧固醇，是由胆固醇25-羟化酶催化胆固醇产生的，在降低胆固醇积累并且其在调节脂质代谢，调节免疫反应和抑制病毒病原体方面起着关键作用。据现有研究表明，25hc在哺乳动物中具有广谱的抗病毒作用，可抑制丙型肝炎病毒，人类免疫缺陷病毒，埃博拉病毒在内的多种病毒。其可以通过改变细胞膜脂质，拮抗病毒融合和进入；抑制病毒复制；拮抗可能参与病毒复制和组装的病毒和内源性蛋白的酰化；改变内膜中的胆固醇分布，以对抗参与病毒组装和包装等多种方式来对抗病毒。
技术实现要素：
本发明研究提供了25-羟基胆固醇对白斑综合征病毒的抑制作用，将其应用于对虾等甲壳类水产生物的饲喂，阻止wssv在体内的复制与传播，能够有效提高对虾等水产生物的存活率，，可用于对虾等水生甲壳动物在养殖生产中的病害防治。
基于上述研究结果，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供25-羟基胆固醇在制备水产养殖病害防治制剂中的应用。
本发明所述的25hc，可以减少白斑综合征病毒对对虾的复制，降低对虾的死亡率。该发明所验证的25hc在对虾免疫防御反应中的功能的思路和方法都是由本发明首次报道。本发明证实了将25hc喂食对虾后，对虾经口感染白斑综合征病毒，可以下调对虾血细胞、鳃和小肠中的白斑综合征病毒囊膜蛋白在mrna水平以及蛋白水平的表达量，阻止病毒在体内的增殖。基于该结论，利用本发明验证的25hc可用于抗病毒药物开发，为白斑综合征病毒引发的水产病害提供了有利的防治手段。
本发明第二方面，提供一种对虾饲料添加剂，所述对虾饲料添加剂中包括25-羟基胆固醇。
本发明第三方面，提供一种对虾病害防治药物，所述防治药物中，包括25-羟基胆固醇。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
1、本发明提供了一种具有广谱抗病毒的氧化胆固醇25hc，通过分析对虾的存活率、多种组织中外源性wssv的囊膜蛋白在mrna和蛋白质水平上的变化，表明25hc可帮助对虾抵抗白斑综合征的感染，可用于对虾等水生甲壳动物在养殖生产中的病害防治，为对虾白斑综合症的防治提供了有效的治疗手段。
2、本发明所验证的25hc具有广谱抗病毒作用，是食品中最常见的侧链胆固醇氧化产物。25hc在对虾体内也存在，通过将25hc添加到对虾的饲料中喂食对虾，可以提高对虾中25hc的浓度，对对虾本身的正常生命活动没有不良影响，但可以提高对虾应对wssv侵染的免疫能力，抑制对虾体内wssv，提高对虾的存活率。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述感染wssv对虾饲喂25hc后成活率。
图2为实施例2中饲喂25hc降低wssv囊膜蛋白在mrna水平以及蛋白水平表达量结果图；
其中图2a为对虾多种组织中病毒囊膜蛋白vp28在mrna水平上的表达量图2b为病毒囊膜蛋白vp28的表达量。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供25hc在对虾养殖中感染白斑综合征病毒病害中的应用，为对虾等甲壳类水生动物养殖中白斑综合征病毒病害的防治提供思路和方法。
本发明第一方面，提供25-羟基胆固醇在制备水产养殖病害防治制剂中的应用。
本发明请求保护的25-羟基胆固醇，包括25-羟基胆固醇纯品、其溶剂化物及对其进行常规化学修饰后的物质。其中，常规的化学修饰方式包括为了改善其溶解性连接常规的化学基团使其成盐等方式。
因此，优选的，所述25-羟基胆固醇包括25-羟基胆固醇纯品、其溶剂化物及对其进行常规化学修饰后的物质。
优选的，所述水产生物病害为白斑综合征病毒(whitespotsyndromevirus，wssv)引发的疾病。
本发明的研究结论证实了，25hc能够降低白斑综合征病毒引发的致死率，抑制病毒囊膜蛋白vp28的表达，根据本领域的常规研究思路，25hc能够用于防治白斑综合征病毒引发的疾病，如该病毒作为对虾病害的病原体的具体疾病为对虾白斑综合征。
wssa由于不同学者研究方法及侧重点不同，对此病毒的叫法不一。分别为：“白斑杆状病毒(whitespotbaculovirus,wsbv)”、“皮下造血组织坏死杆状病毒(hypodermalandhematopoiericnecrosisbaculocirus,hhnbvv)”、“对虾白斑综合病毒(whitespotsyndromevirus,wssv)”、“对虾杆状dna病毒(prdv)”、“日本对虾核型杆状病毒(rood-shapednuclearvirusofpenaeusjaponics,rv_pj)”、“中国对虾杆状病毒病(penaeuschinensisbaculovirus,pcbv)”。上述表述方式与本发明所请求的内容，其涵盖范围一致，均在本发明请求保护的范围之内。
优选的，所述水产生物为鱼类及甲壳类水生生物。
进一步的，所述甲壳类水生生物包括但不限于蟹及虾类，更进一步的，所述虾包括但不限于对虾、克氏原螯虾。
根据目前了解的情况，白斑综合征病毒在多种水产生物中均有感染的情况发生，包括对虾及克氏原螯虾这两种经济养殖生物均有感染情况发生，特别是对虾，该病毒对对虾养殖的危害尤其严重。
优选的，所述防治制剂为具有预防及治疗作用的药物、环境杀菌剂或饲料添加。
另外，本发明提供的应用方式中，包括25-羟基胆固醇单独作为活性成分应用于相关疾病的防治，还包括25-羟基胆固醇与其他活性成分联合应用的方式。
因此，优选的，所述水产养殖病害防治制剂中，所述25-羟基胆固醇作为活性成分，包括必要的辅料。
优选的，所述水产养殖病害防治制剂中，包括25-羟基胆固醇及辅料，还包括其他活性成分。
进一步的，所述其他活性成分包括但不限于抗病毒成分、抗菌成分和/或提高免疫力成分。
本发明第二方面，提供一种对虾饲料添加剂，所述对虾饲料添加剂中包括25-羟基胆固醇。
本发明第四方面，提供一种对虾病害防治药物，所述防治药物中，包括25-羟基胆固醇。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案，以下实施例中所述试剂均为市售产品。
实施例1
实验方法(1)：将商品化的25hc(cas号:2140-46-7)溶解于dmso中，浓度为5mg/ml，使用灭菌pbs稀释，使终浓度为15μm。挑选大小相近的日本囊对虾分为两组。
实验组：喂食25hc，每只对虾喂食50μl25hc(15μm)。
对照组：喂食灭菌pbs组，每只对虾喂食50μlpbs。
1小时后，对虾注射白斑综合征病毒50μlwssv(1×105)。然后每12小时统计对虾的死亡数量，统计分析对虾的存活率。喂食25hc的实验组和喂食灭菌pbs的对照组进行比较，比较结果如附图1所示。从图1中可以看出，实验组的对虾存活率显著高于对照组，证明对虾食用25hc应对wssv的免疫力增强，25hc可以有效提高wssv感染后对虾的存活率。
实施例2
实验方法：挑选大小相近的日本囊对虾分为两组，每组15只。
实验组：喂食25hc，每只对虾喂食50μl25hc(10μm)。
对照组：喂食灭菌pbs组，每只对虾喂食50μlpbs。
1小时后，对虾经口感染白斑综合征病毒40μlwssv(1×106)。24小时后，提取对虾血细胞，解剖分离对虾的鳃和小肠。用trizolreagent分离提取实验组与对照组对虾血细胞、鳃和小肠的总rna，取4μl总rna，反转录第一链cdna，稀释10倍后用作实时定量pcr(qpcr)的模板，检测对虾中病毒囊膜蛋白vp28在mrna水平上的表达量变化。用蛋白裂解液(ripa)提取实验组和对照组对虾血细胞、鳃和小肠的总蛋白，利用westernblot对wssv囊膜蛋白vp28的蛋白水平进行检测，检测结果如附图2所示。将25hc喂食对虾，经口感染wssv，可以下调对虾多种组织中病毒囊膜蛋白vp28在mrna水平上的表达量(图2a)，在蛋白水平上，病毒囊膜蛋白vp28的表达量也有明显减少(图2b)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.25-羟基胆固醇在制备水产养殖病害防治制剂中的应用。
2.如权利要求1所述25-羟基胆固醇在制备水产养殖病害防治制剂中的应用，其特征在于，所述25-羟基胆固醇包括25-羟基胆固醇纯品、其溶剂化物及对其进行常规化学修饰后的物质。
3.如权利要求1所述25-羟基胆固醇在制备水产养殖病害防治制剂中的应用，其特征在于，所述水产生物病害为白斑综合征病毒引发的疾病。
4.如权利要求1所述25-羟基胆固醇在制备水产养殖病害防治制剂中的应用，其特征在于，所述水产生物为鱼类及甲壳类水生生物。
5.如权利要求4所述25-羟基胆固醇在制备水产养殖病害防治制剂中的应用，其特征在于，所述甲壳类水生生物包括但不限于蟹及虾类，优选的，所述虾包括但不限于对虾、克氏原螯虾。
6.如权利要求1所述25-羟基胆固醇在制备水产养殖病害防治制剂中的应用，其特征在于，所述防治制剂为具有预防及治疗作用的药物、环境杀菌剂或饲料添加。
7.如权利要求1所述25-羟基胆固醇在制备水产养殖病害防治制剂中的应用，其特征在于，所述水产养殖病害防治制剂中，所述25-羟基胆固醇作为活性成分，包括必要的辅料；
或，所述水产养殖病害防治制剂中，包括25-羟基胆固醇及辅料，还包括其他活性成分；优选的，所述其他活性成分包括但不限于抗病毒成分、抗菌成分和/或提高免疫力成分。
8.一种对虾饲料添加剂，其特征在于，所述对虾饲料添加剂中包括25-羟基胆固醇。
9.一种水产养殖环境杀菌剂，其特征在于，所述水产养殖环境杀菌剂中包括25-羟基胆固醇。
10.一种对虾病害防治药物，其特征在于，所述防治药物中，包括25-羟基胆固醇。
技术总结