本发明属于生物技术领域，具体设计一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法及其应用。
背景技术：
二型糖尿病（t2dm）的特征是胰岛β细胞功能异常和靶器官的胰岛素抵抗（insulinresistance）引起的相对胰岛素缺乏，即机体对胰岛素产生了耐受性。二型糖尿病患者占全球糖尿病患者群体的90％，是糖尿病治疗的重点研究方向。降糖治疗是目前主要的控制t2dm危害的方法，但治疗二型糖尿病的重点是缓解胰岛素抵抗症状。当胰岛素作用与胰岛素分泌无法维持动态平衡时，胰岛素在胰岛素敏感性组织（如肝脏，肌肉和脂肪组织）中的作用及胰腺胰岛β细胞功能会受到影响产生障碍，导致血液中葡萄糖水平异常。当胰岛素抵抗和β细胞功能障碍发展到一定程度，糖耐量不断降低，t2dm就会产生。
类胰岛素生长因子受体（insulingrowthfactorreceptor，igfr）通路，也称胰岛素受体（insulinreceptor，ir）通路，在人体内，该信号网络由激活胰岛素和igf-1的两个紧密相关的酪氨酸激酶受体，胰岛素受体（ir）和igf-1受体（igf1r）下游的细胞内信号级联组成，是胰岛素和类胰岛素生长因子发挥作用的主要方式，涉及细胞生长、增殖、分化、凋亡及代谢调节等，不仅是营养代谢过程的核心，还与寿命甚至肿瘤的发生有密切联系。igfr通路下游包括了一系列著名的营养代谢及细胞功能调控基因，如irs、pi3k、akt、mtor、mek、erk、pdk-1、glut-4、foxo、jnk等，是影响胰岛β细胞功能及胰岛素信号作用的重要因素。胰岛素通过胰岛素受体结合激活胰岛素受体底物（irs），然后将信号发送至pi3k/akt通路、erk1/2通路及mtor通路等，激活葡萄糖转运及转化功能，从而促进葡萄糖摄取、细胞增殖和存活，同时脂质和蛋白质的代谢也与这一系列信号通路的激活相关，从而使胰岛素同时参与到葡萄糖、脂质、蛋白质的代谢中。异常的胰岛素信号转导会引发糖尿病和肥胖症等代谢型疾病，还可能会引发癌症。
近年来，秀丽线虫已经应用到现代生物学的众多领域的研究，特别是真核细胞的基本功能和相互作用，成为研究人类疾病发生过程的重要模式生物。由于秀丽线虫体积小，生命周期短，成本低，具有透明性，基因组已解明，这些特征使其成为一个出色的模式生物。秀丽线虫的人类胰岛素受体基因同源物是daf-2基因，能够以类似胰岛素受体的形式接受类胰岛素信号，调节线虫的生长发育和代谢。当daf-2基因失活时，会导致胰岛素信号大幅度削弱，引发类似于胰岛素抵抗的状态，而当药物对于daf-2基因或其通路下游基因有刺激或兴奋效果时，这个状态会得到缓解或治愈。
本发明采用对特定daf-2基因突变体秀丽隐杆线虫施加温度调节，使秀丽隐杆线虫体内daf-2类胰岛素受体基因的正常工作受到抑制，结合高糖饮食诱导的体内高糖环境，建立以兼具高糖及胰岛素抵抗为特征的秀丽隐杆线虫为基础的动物模型，该秀丽隐杆线虫模型稳定可重复，可模拟以高血糖及高胰岛素抵抗为特征的二型糖尿病所造成的体内代谢异常，用于研究高糖胰岛素抵抗状态对机体各种生理生化代谢过程的影响，为研究二型糖尿病相关生理生化影响的科研工作者提供一种工具，用于研究发病机制及筛选相关药物。
技术实现要素：
本发明主要提供一种简单易行、成本低廉的构建秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的方法，可以在秀丽隐杆线虫体内塑造高糖及胰岛素抵抗状态，可模拟以高血糖及高胰岛素抵抗为特征的二型糖尿病所造成的体内代谢异常，用于研究高糖胰岛素抵抗状态对机体各种生理生化代谢过程的影响，可作为高糖胰岛素抵抗动物模型用于高血糖、胰岛素抵抗及二型糖尿病发病机制研究和相关药物的开发。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供的秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法为：采用对特定daf-2基因突变体秀丽隐杆线虫施加温度调节，使秀丽隐杆线虫体内daf-2类胰岛素受体基因的正常工作受到抑制，结合高糖饮食诱导的体内高糖环境，模拟以高血糖及高胰岛素抵抗为特征的二型糖尿病所造成的体内代谢异常。
其中，所用特定daf-2基因突变体为daf-2(m41)（cgc编号dr1564）或daf-2(e1370)（cgc编号cb1370）及其他近似的秀丽隐杆线虫daf-2突变株。
其中，所述调节温度为15-26℃。
其中，所用高糖饮食为40mmol/ld-葡萄糖。
所述对daf-2基因突变体秀丽隐杆线虫施加温度调节之前，还包括秀丽隐杆线虫的培养与同步化。
所述培养与同步化具体为ngm培养基进行培养后，通过次氯酸钠法完成秀丽隐杆线虫同步化后，于26℃下完成dauer同步，而后进行产卵法同步化，于26℃培养完成生长周期同步，而后完成模型构建。
进一步地，将所述构建方法获得的模型构建应用于筛选治疗二型糖尿病药物中。所述二型糖尿病包含高血糖及胰岛素抵抗等特征。
进一步地，将所述构建方法获得的模型构建应用于筛选治疗高血糖药物中。所述高血糖是由高糖饮食引发，且体内糖浓度在12mmol/l以上。
进一步地，将所述构建方法获得的模型构建应用于筛选治疗胰岛素抵抗药物中。所述胰岛素抵抗是由哺乳动物胰岛素受体同源基因daf-2的工作异常引发。
进一步地，将所述构建方法获得的模型构建应用于研究高血糖及胰岛素抵抗并存的类二型糖尿病状态对机体各种生理生化代谢过程的影响中。
同现有技术相比，本发明存在以下优势：
本发明以秀丽隐杆线虫daf-2突变体为基础，添加特定浓度d-葡萄糖到培养基中塑造高糖环境，并配合特定的温度控制使之呈现类胰岛素抵抗状态，两者同时展现，分子水平变化与人二型糖尿病状态下的高糖氧化应激兼胰岛素抵抗状态类似。
并且，在通过次氯酸钠法完成秀丽隐杆线虫同步化后，于26℃下完成dauer生长期同步，而后进行产卵法同步化，于26℃培养完成生长周期同步，而后完成模型构建，实现了污染清除、生长周期同步、消除环境压迫干扰等目的，以最佳虫体状态开启后续实验。
该秀丽隐杆线虫动物模型稳定可重复，可作为高糖胰岛素抵抗动物模型用于研究高糖、胰岛素抵抗及二型糖尿病发病机制的研究和相关药物的筛选。
目前研究虽有少数针对高糖或胰岛素抵抗的相关秀丽隐杆线虫动物模型的构建方法，但均存在缺陷，只进行片面性的指标测试。单纯高血糖模型不能直观反映胰岛素抵抗状态下的糖代谢机制，单纯胰岛素抵抗模型完全不能反映高血糖导致的强氧化伤害，这些模型均不能建立全面反映高血糖兼胰岛素抵抗状态下机体情况的模型，也尚未有将高糖模型及胰岛素抵抗模型结合并进行优化的报道。同时，旧模型缺乏造模过程中的反干扰操作，实验结果具有不稳定性，需要进行优化设计。对于高糖胰岛素抵抗模型的设计，需要筛选合适的基底线虫种株，反复测试不同种类、不同用量的高糖饮食的效果，并对触发所需模型状态的条件进行摸索，同时通过实验条件和操作手段的优化避免不必要的因素干扰，使模型稳定可重复，且不产生明显的基础指标偏移，才能完成一个较为成熟的高糖胰岛素抵抗模型，需要反复探索，这是前人未能完成的工作。本发明所述模型，是以从大量秀丽隐杆线虫突变体库中筛选而出的特殊种株，配合经过多次测试的糖饮食方案，结合该秀丽隐杆线虫突变体特性进行造模方案设计，并添加了多个步骤进行优化，最大化排除非相关因素干扰，使模型拥有一致的初始条件，并最大程度贴近真实二型糖尿病状态下高血糖兼强胰岛素抵抗的状态。经相关实验数据分析，该模型实现了单纯高血糖模型所不能实现的对于胰岛素抵抗强度的直观量化分析，同时实现了胰岛素抵抗模型所不能体现的高血糖状态下机体糖代谢通路工作情况的分析，并且在底层基因水平上与旧模型有极大区别，更贴近于二型糖尿病的真实状态，完成了对旧有模型的有效改进。
附图说明
图1为造模成功后秀丽隐杆线虫的成虫率，其与胰岛素信号强度近似对等。
图2为造模成功后秀丽隐杆线虫体内糖浓度。
图3为造模成功后秀丽隐杆线虫体内部分糖代谢相关基因的mrna表达情况。
具体实施方式
以下提供具体实施例以实现本发明所述的秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法，但不限于这些实施例。
实施例1秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的建立
1.材料
1.1菌种
e.coliop50，购自cgc（caenorhabditisgeneticscenter）。
1.2秀丽隐杆线虫
dr1564，购自cgc（caenorhabditisgeneticscenter）。
1.3培养基
lb固体培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gnacl，17g琼脂，定容至1l，高压灭菌。
lb液体培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gnacl，定容至1l，高压灭菌。
ngm（nematodegrowthmedium）培养基：①蛋白胨2.5g，nacl3g，琼脂17g，加水至975ml，高压灭菌，冷却至55-60℃；②磷酸盐（k2hpo4-kh2po4）缓冲液（ph=6.0），k2hpo435.6g，kh2po4108.3g，加水至1l，高压灭菌，长期保存；③1mol/lmgso4溶液，高压灭菌，长期保存；④1mol/lcacl2溶液，高压灭菌，长期保存；⑤5mg/ml胆固醇-乙醇溶液（不可高压灭菌），长期保存。往灭菌后的①中添加25ml②，1ml③，1ml④，1ml⑤，以及1ml青霉素-链霉素（100x）溶液混匀。
m9缓冲液：3gkh2po4，15.14gna2hpo4·12h2o（或6gna2hpo4），5gnacl，1ml1mmgso4，加水定容至1l，高压灭菌。
1.4其他材料
d-葡萄糖；氢氧化钠；4%次氯酸钠溶液；线虫用picker（铂金丝制）。
2.大肠杆菌op50的培养
在lb固体培养基上以划线法培育op50单克隆菌落作为菌种保存，用时，划取单克隆菌株，于lb液体培养基中37℃振荡过夜得足量op50菌体。或复苏冻存的op50菌株进行扩增，复苏后于37℃lb培养基中进行活化，活化后挑取单克隆菌落或菌液到新lb培养基进行扩增。扩增后的op50菌液在调整od值后保存至4℃备用。op50使用前需检测纯度，若有污染应进行纯化，重新培养。
3.秀丽隐杆线虫的培养与同步化
秀丽隐杆线虫使用ngm培养基进行培养。
配制好ngm培养基溶液，在凝固之前倒入平板之中，将新制ngm平板于操作台放置风干并紫外灭菌。制作含糖培养基时，则在灭菌ngm培养基后准备倒平板之前把葡萄糖等加入培养基中，摇匀后再加入培养皿中凝固。
喂食op50前，调节菌液浓度至1.5od。滴加适量菌液至平板中央，均匀涂布，且op50所占区域不超过平板半径的70%。非给药过程中，op50添加不进行灭活。给药过程中，药物混合至菌液中，滴加至ngm培养基表面。
线虫的转移主要通过picker挑针法进行。
dr1564虫株主要于16-20℃进行扩增培养，培养箱为标准生化培养箱且只用于秀丽线虫培养。
使用次氯酸钠同步法进行第一阶段同步和污染清理。首先配制足量m9缓冲液，1mol/lnaoh溶液及4%naclo溶液，而后用m9缓冲液吹洗含虫平板。以灭菌的1.5ml离心管收集含虫洗液，加水至1.5ml，3000rpm离心1min弃上清，加m9重悬，重复操作至液体澄清后弃上清。将0.5mlnaoh溶液与1mlnaclo溶液及3.5mlm9缓冲液混合，现用现配，加入含虫离心管中，轻摇离心管，直至大部分虫体断裂或溶解。将离心管于6000rpm离心1min，弃上清，加m9缓冲液洗涤，重复约3-4次，至无次氯酸气味。将管底虫卵转移到接种有op50的清洁ngm平板边缘，并镜检。次日，虫卵孵化，将幼虫转移到新的接种有op50的清洁ngm平板。次氯酸钠法处理后的幼虫可能仍携带有污染，需于ngm培养基中观察数日确保无携带杂菌污染。
在正式试验开始前，对已清理污染的试验用虫株进行产卵同步。根据试验用虫量需求，以picker转移适量线虫至新的ngm培养基，于20℃放置培养基4小时，等待线虫产卵，而后去除所有成虫，只留虫卵。dr1564虫株在15℃以上会发生dauer停滞无法发育为成虫，饲养于26℃约48小时后去除成虫，将获得同步化dr1564虫株。
4.高糖胰岛素抵抗模型的建立与给药
按配方流程制作ngm培养基，并在倒平板之前，于培养基溶液中加入40mmd-葡萄糖，摇匀后制作成高糖ngm培养基。
将dr1564虫株同步化后，转移dauer虫到铺有op50的高糖培养基中，于22℃下培养36h，所得dr1564成虫即为高糖胰岛素抵抗秀丽隐杆线虫动物模型，该温度下的胰岛素信号强度约为20%。在15℃下，胰岛素信号强度为100%，在26%摄氏度下为接近0%，根据实验需要调整培养温度。
在高糖ngm培养基制作完成后，于给药前24h内配制药液。将所需药物与op50菌液混合，配制成特定浓度药物，而后滴加至培养基表面，等待菌液干燥后，用紫外交联仪进行灭菌10min以上，即可得含药平板，且大肠杆菌不会消耗药物。
实施例2秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗模型的验证
取实施例1构建的高糖胰岛素抵抗动物模型，设定温度为22℃，分别设无糖组（normal）、高糖溶剂组(model)、高糖二甲双胍组(metformin)、罗格列酮类似物组(vanadate)，分别给药纯op50菌液、纯op50菌液、200μg/ml二甲双胍/op50菌液、200μg/ml罗格列酮类似物/op50菌液，每24小时更换培养基和补充药物，持续给药120小时后进行后续检测。
(1)秀丽隐杆线虫胰岛素信号强度检测
计算给药后各组秀丽隐杆线虫的成虫所占比例，即成虫率，作为胰岛素信号强度量化值，并进行组间统计学分析（*p<0.05，**p<0.01，对比模型组；#p<0.05，##p<0.01，对比空白组）。
如附图1所示，阴性对照组和模型组拥有相近的约20%的成虫率，而使用了糖尿病治疗相关药物的阳性对照组则有更高的成虫率，体现了药物治疗效果。这种对于胰岛素抵抗情况的直观体现，是单纯高血糖模型所不能达到的效果。同时，模型组和阴性对照组的数据相似，成功避免了额外的造模步骤对于模型基础指标的干扰，使高糖胰岛素抵抗模型在评价胰岛素抵抗上依然维持较高的准确性。
(2)秀丽隐杆线虫体内葡萄糖含量检测
每组取30只以上秀丽线虫，用m9缓冲液清洗三次后转移至灭菌离心管，按5μl裂解液每虫的比例添加细胞裂解液，裂解完全后，4000rpm离心取上清，配合葡萄糖检测试剂盒于生化分析仪上进行糖含量检测，并进行统计学分析（*p<0.05，**p<0.01,对比模型组；#p<0.05，##p<0.01，对比空白组）。
如附图2所示，根据结果数据，正常组的糖含量约为4.2nmol/l，模型组的糖含量是空白组的3.27倍，约为14nmol/l，接近于糖尿病血糖临界值与正常血糖值的对比，在给药后，阳性对照组的糖含量明显下降，体现了药物降糖效果，因此，本模型可用于进行糖代谢相关分析，这是单纯胰岛素抵抗模型所不具备的优势。
(3)秀丽隐杆线虫体内糖代谢相关基因mrna表达检测
每组取30只以上秀丽线虫，用m9缓冲液清洗三次后转移至灭菌离心管，按总rna提取试剂盒（r6842,omega）说明书提取秀丽隐杆线虫的总rna，而后按照反转录试剂盒primescript™rtreagentkitwithgdnaeraser（takara）的说明书将提取的秀丽隐杆线虫总rna反转录为cdna，同时完成去除基因组dna和反转录反应两项操作。
通过wormbase数据库和ncbi（nationalcenterforbiotechnologyinformation）基因数据库中查找秀丽隐杆线虫糖代谢相关基因的mrna序列及哺乳动物同源基因匹配，并通过ncbiprimerblast工具进行特异性引物设计，本试验所设计的引物序列见表1。
表1实时荧光定量聚合酶链式反应所用引物序列
按照ultrasybrmixture（上海康为世纪）试剂盒说明书进行实时荧光定量pcr，相关参数按说明书进行设置。而后，以act-1为内参，使用2-δδct法计算ct值，分析对应基因的表达情况，进行统计学分析（*p<0.05，**p<0.01，对比模型组；#p<0.05，##p<0.01，对比空白组）。
如图3所示，造模成功后，糖代谢相关基因出现了明显的变化，且高糖胰岛素抵抗组和无糖胰岛素抵抗组的基因表达有明显区别，更接近于真实二型糖尿病患者的相关基因表达情况，这是旧模型所不能实现的效果，为该模型的成功性作出佐证。给药后，阳性对照组的糖代谢相关基因表达出现变化，佐证了其治疗效果的来源，使本模型的数据可在分子生物学水平上获得相关证据支撑。
综上所述，采用本发明公开的方法成功构建的秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型，可以升高动物模型体内糖含量，加大胰岛素抵抗，模拟以高血糖及高胰岛素抵抗为特征的二型糖尿病所造成的体内代谢异常，相比单纯的高糖模型和胰岛素抵抗模型更接近于二型糖尿病真实情况。该模型稳定可重复，可用于研究高糖胰岛素抵抗状态对机体各种生理生化代谢过程的影响，为研究二型糖尿病相关生理生化影响的科研工作者提供一种工具，用于研究发病机制及筛选相关药物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
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<110>福建农林大学
<120>一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法及应用
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1.一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法，其特征在于，采用对daf-2基因突变体秀丽隐杆线虫施加温度调节，使秀丽隐杆线虫体内daf-2类胰岛素受体基因的正常工作受到抑制，结合高糖饮食诱导的体内高糖环境，模拟以高血糖及高胰岛素抵抗为特征的二型糖尿病所造成的体内代谢异常。
2.根据权利要求1所述的一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法，其特征在于，所述daf-2基因突变体包括daf-2(m41)或daf-2(e1370)中的任意一种，其cgc编号分别为dr1564、cb1370。
3.根据权利要求1所述的一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法，其特征在于，所述调节温度为15-26℃。
4.根据权利要求1所述的一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法，其特征在于，所用高糖饮食为40mmol/ld-葡萄糖。
5.根据权利要求1所述的一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法，其特征在于，所述对daf-2基因突变体秀丽隐杆线虫施加温度调节之前，还包括秀丽隐杆线虫的培养与同步化。
6.据权利要求5所述的一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法，其特征在于，所述培养与同步化具体为ngm培养基进行培养后，通过次氯酸钠法完成秀丽隐杆线虫同步化后，于26℃下完成dauer同步，而后进行产卵法同步化，于26℃培养完成生长周期同步，而后完成模型构建。
7.一种如权利要求1-6任一所述构建方法获得的模型构建在筛选治疗二型糖尿病药物中的应用。
8.一种如权利要求1-6任一所述构建方法获得的模型构建在筛选治疗高血糖药物中的应用。
9.一种如权利要求1-6任一所述构建方法获得的模型构建在筛选治疗胰岛素抵抗药物中的应用。
技术总结