本发明涉及辅助生殖技术领域，特别涉及一种细胞玻璃化冷冻处理系统，以及一种细胞玻璃化冷冻处理方法。
背景技术：
在辅助生殖领域中，玻璃化冷冻法在人卵细胞和胚胎的冷冻存储中应用越来越多，玻璃化冷冻处理工艺主要是根据不同的细胞类型，准备不同浓度梯度的冷冻保护剂，如平衡液、玻化液，在渗透压作用条件下，去除细胞体内和细胞外壁的水分，将其置换成一种可以抗冷冻的保护剂，然后快速放置于液氮中进行存储。目前，细胞玻璃化冷冻处理工艺主要采用手动方法，具体操作如下：1)首先准备一定体积的平衡液(es)和玻化液(vs)置于25-27℃的环境中，并准备好细胞冷冻载体；2)吸取一定量的平衡液(es)和玻化液(vs)置于四孔培养皿的对应位置中；3)在显微镜的条件下，使用已经拉丝成合适管径的巴氏玻璃管将卵母细胞/胚胎分别依次转移到平衡液(es)及玻化液(vs)中，轻轻的搅动液体，并精确控制细胞浸泡时间，其中平衡液(es)中的浸泡时间为9-12min，玻化液(vs)中的浸泡时间为30-60s；4)将换液完成的细胞转移到冷冻载体上，吸取细胞周围剩余的液体，并迅速投入到液氮中进行玻璃化冷冻、装管、记录并完成操作。在此过程中，需要使用的冷冻试剂用量较多，大约为500μl，且该实验过程中会消耗较多的培养皿和冷冻载杆，且在此实验过程中需要多次转移细胞，可能导致细胞损伤和丢失。将细胞至于以上两个浓度液体中，会对细胞会形成较大的渗透压冲击，此工艺过程对操作者的劳动强度要求较大且要求操作者需要具备较高的专业技能。因此，针对以上问题，急需要一些自动化、高集成、低风险和便操作的自动化系统及装置。
技术实现要素：
本申请的目的在于解决现有技术的不足，提出了一种细胞玻璃化冷冻处理系统及方法，以实现细胞玻璃化冷冻技术的自动化操作，进而达到减少细胞渗透压冲击以及提高细胞玻璃化冷冻降温速度的效果，具体包括如下技术方案：
一种细胞玻璃化冷冻处理系统，包括壳体和冷冻载杆，所述冷冻载杆包括平面膜片，所述平面膜片用于承载内含细胞的基础液滴；
所述壳体具有开口，所述壳体内还收容有显微相机、注液器和吸液器，所述注液器包括用于向基础液滴注射平衡液和玻化液的注液针；所述吸液器包括用于吸收基础液滴中液体的吸液针；
当所述冷冻载杆从所述开口送入所述壳体内时，所述平面膜片位于所述显微相机的下方，所述注液器和所述吸液器分别移动至基础液滴的相对两侧，并使得所述注液针和所述吸液针分别伸入基础液滴中，以对基础液滴进行换液操作，所述吸液器还用于对基础液滴进行单独吸液操作，所述显微相机用于实时监控基础液滴的状态。
可选地，所述平面膜片上设置有涂胶层和围设于所述涂胶层外围的疏水层，所述涂胶层用于承载和固定基础液滴。
可选地，所述涂胶层的直径d满足：100μm≤d≤500μm。
可选地，所述注液器包括分别连通所述注液针的第一注射泵和第二注射泵，所述第一注射泵用于对所述注液针泵入平衡液，所述第二注射泵用于对所述注液针泵入玻化液。
可选地，所述吸液器包括连通所述吸液针的第三注射泵，所述第三注射泵用于泵出基础液滴内的液体。
可选地，所述吸液针与所述壳体之间转动连接，所述吸液针在换液操作过程中处于平行于所述平面膜片的第一姿态，所述吸液针在单独吸液操作过程中相对于所述壳体转动，进而与所述平面膜片形成倾斜的第二姿态。
可选地，所述细胞玻璃化冷冻处理系统中还设有报警装置，所述报警装置用于在换液操作和/或单独吸液操作过程中，监测到基础液滴和/或细胞丢失时提示故障信息。
本申请还涉及一种细胞玻璃化冷冻处理方法，包括如下步骤：
将带有基础液滴的冷冻载杆放入处理装置中，其中基础液滴内还收容有细胞；
将注液针沿平行于所述冷冻载杆的平面膜片的方向从一端伸入基础液滴中，将吸液针沿平行于所述平面膜片的方向从另一端伸入基础液滴中，以对基础液滴进行换液操作；
调整所述吸液针相对于所述平面膜片的角度和/或高度，对基础液滴进行吸液操作，以减少所述平面膜片上残留的基础液滴容量。
可选地，所述将带有基础液滴的冷冻载杆放入处理装置中，包括：
基础液滴的体积v满足：3μl≤v≤5μl，且基础液滴的直径d满足：1.5mm≤d≤2.5mm。
可选地，所述将注液针沿平行于所述冷冻载杆的平面膜片的方向从一端伸入基础液滴中，将吸液针沿平行于所述平面膜片的方向从另一端伸入基础液滴中，包括：
所述注液针和所述吸液针之间的最小距离l满足1.0mm≤l≤1.4mm。
可选地，所述对基础液滴进行换液操作，包括：
所述注液针的注液速度介于3μl/min-6μl/min之间，所述吸液针的吸液速度介于3μl/min-6μl/min之间。
可选地，所述对基础液滴进行换液操作，还包括：
所述注液针的注液速度与所述吸液针的吸液速度相同，用以维持基础液滴在换液操作过程中的形态稳定。
可选地，所述对基础液滴进行换液操作，还包括如下步骤：
对换液操作进行实时监控；
调整换液操作中的液体量、排出量以及动作时序。
可选地，所述对换液操作进行实时监控，还包括如下步骤：
接收换液操作中拍摄到的图片数据；
对所述图片数据进行预处理，以提取细胞的面积轮廓尺寸特征；
计算所述面积轮廓尺寸特征的变化率，并结合所述变化率计算得出细胞换液各阶段的结束时间；
输出所述面积轮廓尺寸的变化曲线。
可选地，所述对基础液滴进行换液操作包括通过所述注液针注入平衡液和/或玻化液的操作，所述调整换液操作中的液体注入，包括：
通过所述注液针对基础液滴进行注入平衡液的操作；
若计算得到的所述变化率在第一预设时段内介于预设的第一阈值范围之间，所述注液针停止注入平衡液，并对基础液滴进行注入玻化液的操作。
可选地，所述对基础液滴进行注入玻化液的操作，还包括：
当计算得到的所述变化率在第二预设时段内介于预设的第二阈值范围之间，或，
所述注液针向基础液滴内注入玻化液的时长超过的预设的玻化液注入时段时，停止所述换液操作。
可选地，所述对基础液滴进行吸液操作后，还包括如下步骤：
将承载有残留基础液滴的所述冷冻载杆放置于液氮中，细胞收容于残留基础液滴中，且残留基础液滴量小于0.1μl。
本申请提供的细胞玻璃化冷冻处理系统，通过调整所述注液器和所述吸液器的位置，使得所述注液器和所述吸液器分别移向基础液滴的两侧，并将所述注液针和所述吸液针伸入基础液滴中对基础液滴进行换液操作。在完成换液操作后，使用所述吸液器单独对基础液滴进行吸液操作。该所述细胞玻璃化冷冻处理系统能够有效降低人工操作强度以及减少人工操作过程中的失误和试剂使用量，减少细胞的转移次数，实现细胞玻璃化冷冻技术的自动化操作，进而达到减少细胞渗透压冲击以及提高细胞玻璃化冷冻降温速度的效果。
本申请提供的细胞玻璃化冷冻处理方法，用于上述细胞玻璃化冷冻处理系统中，通过该所述细胞玻璃化冷冻处理方法有效降低人工操作强度、减少人工操作过程中的失误和试剂使用量，以及减少细胞的转移次数，实现细胞玻璃化冷冻技术的自动化操作，进而达到减少细胞渗透压冲击以及提高细胞玻璃化冷冻降温速度的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的细胞玻璃化冷冻处理装置的结构示意图；
图2是本发明提供的细胞玻璃化冷冻处理系统的系统原理图；
图3是本发明提供的细胞玻璃化冷冻处理系统中一种实施例的结构示意图；
图4是本发明提供的细胞玻璃化冷冻处理系统中冷冻载杆的结构示意图；
图5是本发明提供的细胞玻璃化冷冻处理方法的流程图；
图6是本发明提供的细胞玻璃化冷冻处理方法的系统流程示意图；
图7-图11是本发明提供的细胞玻璃化冷冻处理方法中其余实施例的流程图；
图12是本发明提供的细胞玻璃化冷冻处理方法的细胞轮廓尺寸的变化曲线图；
图13是本发明提供的细胞玻璃化冷冻处理方法中对应的细胞玻璃化冷冻处理装置的动作流程示意。
附图标记说明：
1-细胞玻璃化冷冻处理装置；01-细胞玻璃化冷冻处理系统；02-机架；03-抽屉模组；04-温控系统；05-液路系统；06-显微成像系统；07-嵌入式系统；10-冷冻载杆；20-显微相机；30-注液器；40-吸液器；50-基础液滴；11-平面膜片；12-手柄；31-注液针；41-吸液针51-细胞；111-涂胶层；112-疏水层；121-凹台；122-凸台；123-连接部；301-第一注射泵；302-第二注射泵；401-第三注射泵；001-第一姿态；002-第二姿态。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
此外，以下各实施例的说明是参考附加的图示，用以例示本发明可用以实施的特定实施例。本发明中所提到的方向用语，例如，“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“内”、“外”、“侧面”等，仅是参考附加图式的方向，因此，使用的方向用语是为了更好、更清楚地说明及理解本发明，而不是指示或暗指所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
请参见图1所示的是一种细胞玻璃化冷冻处理装置1，细胞玻璃化冷冻技术是将人卵细胞/胚胎组织完成培养处理工艺后，在快速降温(>2000℃/min)过程中，使得已经置换至细胞体内的冷冻保护剂(平衡液/玻化液)快速由液体转变为粘度很高的玻璃态，避免细胞体内形成冰晶，达到冷冻保护的作用，并以此来提高细胞/胚胎解冻后的存活率。
本申请所涉及的细胞玻璃化冷冻处理系统01位于该细胞玻璃化冷冻处理装置1中，且该细胞玻璃化冷冻处理装置1中还包括机架02，抽屉模组03，温控系统04，液路系统05，显微成像系统06以及嵌入式系统07。其中，机架02主要用于液路器件、硬件板卡和抽屉模组03的安装固定。抽屉模组03应用于支持细胞玻璃化冷冻处理系统01中的冷冻载杆10的快速放入和取出，同时能够实现冷冻载杆10的压紧，并能够调整细胞玻璃化冷冻处理系统01中的注液针31、吸液针41与冷冻载杆10的相对位置。温控系统04主要用于给细胞提供一个恒温环境，获得目标细胞适宜的生存环境。液路系统05主要用于精确控制细胞玻璃化冷冻处理系统01中注液针31和吸液针41的流量，维持液滴的大小近似不变和执行液滴浓度的梯度变化。显微成像系统06主要用于对细胞换液过程进行过程监控，并实时记录和反馈细胞换液过程中的形态变化，防止细胞51丢失。嵌入式系统07主要用于接收人机交互界面的指令，发送给下位机驱动控制单元执行相关的动作，并根据试剂类型和目标细胞设置换液时间和换液步骤，完成整个细胞51的换液操作。
请参见图2所示的本申请所涉及的细胞玻璃化冷冻处理系统01的原理图，细胞玻璃化冷冻处理系统01包括壳体(图中未示)和冷冻载杆10。其中，壳体为细胞玻璃化冷冻处理装置1上的部分结构，壳体用以对细胞玻璃化冷冻处理系统01实现遮蔽。壳体上具有开口(图中未示)，开口用于使得冷冻载杆10进入到细胞玻璃化冷冻处理装置1中。冷冻载杆10包括平面膜片11，平面膜片11用于承载内含细胞51的基础液滴50。壳体中还包括显微相机20、注液器30和吸液器40，其中，当冷冻载杆10从开口送入至壳体中时，显微相机20位于冷冻载杆10上的平面膜片11的上方，且显微相机20用于在细胞换液操作过程中，实现对基础液滴50的实时监控。在进行换液操作前，注液器30和吸液器40先朝向基础液滴50移动并移至基础液滴50的相对两侧，且注液器30上的注液针31伸入至基础液滴50中，同时，吸液器40上的吸液针41也伸入至基础液滴50中。当注液针31和吸液针41到达其指定位置后，细胞玻璃化冷冻处理系统01开启对基础液滴50的换液操作。可以理解的是，由于注液针31和吸液针41同时对基础液滴50分别进行注液和吸液操作，基础液滴50的形状能够大致保持不变。
在完成细胞换液操作过程后，请参见图3，调整吸液针41相对于平面膜片11的位置，使得吸液针41单独对基础液滴50进行吸液操作，且在进行单独吸液操作的过程中，基础液滴50的体积越来越小，因此需要实时调整吸液针41的针头与平面膜片11之间的距离，使其针头始终位于基础液滴50的内部对基础液滴50进行吸液操作，使得平面膜片11上的残留基础液滴50的容量尽可能的小。
在本实施例中，注液针31和吸液针41均采用毛细玻璃管制作，且均通过火焰拉丝工艺制备成锥形针，其锥形针的小端出口满足条件：锥形针的内径介于30μm-60μm之间，锥形针的外径介于80μm-120μm之间。注液针31和吸液针41的形状尺寸使其能够较容易的伸入基础液滴50中，并在保证注液针31和吸液针41的注液/吸液功能的同时，能够保证基础液滴50的形态维持不变，进而使得基础液滴50内流场的稳定，保证位于基础液滴50中的细胞51不会被冲走。
本申请提供的细胞玻璃化冷冻处理系统01，通过调整注液器30和吸液器40的位置，使得注液器30和吸液器40分别移向基础液滴50的两侧，并将注液针31和吸液针41伸入基础液滴50中对基础液滴50进行换液操作，在完成换液操作后，使用吸液器40单独对基础液滴50进行吸液操作，使得基础液滴50的形状能够大致保持不变。该细胞玻璃化冷冻处理系统01能够有效地降低人工操作强度以及减少人工操作过程中的失误和操作过程中所需要的试剂使用量，减少细胞51的转移次数，实现细胞玻璃化冷冻技术的自动化操作，进而达到减少细胞渗透压冲击以及提高细胞玻璃化冷冻降温速度的效果。
一种实施例请参见图4，平面膜片11上设置有涂胶层111和围设于涂胶层111外围的疏水层112，涂胶层111用于承载和固定基础液滴50。
具体的，在本实施例中，平面膜片11位于冷冻载杆10上，且冷冻载杆10还包括有手柄12，手柄12与平面膜片11具有连接部123，连接部123用于实现手柄12与平面膜片11之间的固定连接。在本实施例中，连接部123可以是螺钉连接或密封胶连接。手柄12的设置能够便于操作者将平面膜片11准确地送入细胞玻璃化冷冻处理系统01中。在本实施例中，手柄12为方形结构，采用cop或peek材料制作，且手柄12的长度介于60mm-70mm之间，宽度介于3mm-4mm之间，高度介于3mm-4mm之间。手柄12上方设置有一个凹台121和一个凸台122，凹台121位于手柄12的底部，用于区分平面膜片11的上下表面，凸台122位于凹台121与平面膜片11之间，用于限制冷冻载杆10在手柄12长度方向上的位置。
在本实施例中，平面膜片11上设置有较大面积的疏水层112以及被疏水层112围设的涂胶层111，疏水层112为多个高密度微型柱状凸台结构并形成超疏水界面。涂胶层111用于承载基础液滴50，使得基础液滴50能够粘附在涂胶层111上并形成近似球形的超疏水结构，并使得基础液滴50不容易出现滚动或滑移，防止细胞51在换液操作过程中的丢失。平面膜片11通过光刻和纳米压印工艺制备成薄膜，然后通过切割工艺形成给定尺寸，并通过coc材料或者cop材料制作，平面膜片11的厚度介于0.07mm-0.12mm之间，宽度介于3mm-4mm之间，长度介于10mm-20mm之间。其中，coc材料和cop材料为不同的环烯烃类共聚物。在本实施例中，疏水层112为超疏水层，用以使得基础液滴50实现超疏水效果。
一种实施例，涂胶层111的直径d满足：100μm≤d≤500μm。
具体的，在本实施例中，平面膜片11上设置有涂胶层111，该涂胶层111为无柱状凸台平面结构，并设置于平面膜片11的端部，即位于远离手柄12的位置。涂胶层111可以为圆形、方形、多边形或其他不规则形状，且该涂胶层111的直径d满足条件：100μm≤d≤500μm。可以理解的是，当涂胶区111的形状为方形时，直径d包括小于对角线的所有长度，当涂胶区111的形状为不规则图形时，直径d包括小于两点之间距离最远的所有长度。
需要提出的是，涂胶区111上含有0.05μl-0.2μl的生物胶水，该生物胶水采用点样方式设置在涂胶区111上，材料可以为多聚赖氨酸或水凝胶，且在涂胶区111上加入该生物胶水后，需自然风干1min-2min使得该生物胶水固化。
一种实施例请继续参见图2，注液器30还包括分别连通注液针31的第一注射泵301和第二注射泵302，第一注射泵301用于对注液针31泵入平衡液，第二注射泵302用于对注液针31泵入玻化液。
具体的，在本实施例中，第一注射泵301内装有平衡液，且第一注射泵301与注液针31管道连接，用于在换液操作中向注液针31内泵入平衡液，进而实现向基础液滴50注入平衡液。同样的，第二注射泵302内装有玻化液，且第二注射泵302也与注液针31管道连接，用于在结束向基础液滴50中注入平衡液后向注液针31内泵入玻化液，进而实现向基础液滴50注入玻化液。可以理解的是，第一注射泵301与第二注射泵302为换液操作提供换液原料，并通过注液针31实现注液功能。
一种实施例请再次参见图2，吸液器40还包括连通吸液针41的第三注射泵401，第三注射泵401用于泵出吸液针41内的液体。
具体的，在本实施例中，第三注射泵401与吸液针41管道连接，在换液操作中，当吸液针41吸出基础液滴50内的液体时，第三注射泵401将吸液针41内部的液体泵出，使得吸液针41内部具有足够的空间并能够较好的实现其吸液功能。可以理解的是，由于在换液操作中，第一注射泵301和第二注射泵302分别向基础液滴50中注入不同的液体，因此，第三注射泵401泵出的液体为平衡液和/或玻化液。
一种实施例请配合参见图2和图3，吸液针41与壳体之间转动连接，吸液针41在换液操作过程中处于平行于平面膜片11的第一姿态001，吸液针41在单独吸液操作过程中相对于壳体转动，进而与平面膜片11形成倾斜的第二姿态002。
具体的，在本实施例中，换液操作过程中，吸液针41与注液针31设置于基础液滴50的相对两侧，并通过注液针31注液以及吸液针41吸液共同来实现换液操作。为保证较好的换液效果，此时注液针31与吸液针41均平行于平面膜片11，也即，此时注液针31与吸液针41均处于第一姿态001。在吸液针41单独吸液操作过程中，吸液针41相对于壳体转动，使其由平行于平面膜片11转动与平面膜片11形成倾斜角度，也即，此时吸液针41相对于壳体转动形成第二姿态002。当吸液针41位于第二姿态002时，吸液针41的针头能够较好的接近平面膜片11的表面对基础液滴50进行吸液，同时能够保证吸液针41不会触碰到平面膜片11。在本实施例中，第二姿态002为吸液针41与平面膜片11垂直的姿态，即吸液针41与平面膜片11的倾斜角度为90°。
一种实施例，细胞玻璃化冷冻处理系统01中还设有报警装置(图中未示)，报警装置用于在换液操作和/或单独吸液操作过程中，监测到基础液滴50和/或细胞丢失时提示故障信息。
具体的，在本实施例中，由于在换液操作或单独吸液操作过程中，基础液滴50以及细胞51均有存在丢失的异常情况，且会由于操作不当而导致基础液滴50中易出现气泡。上述情况均表明换液操作和/单独吸液操作过程出现了错误，此时，设置于细胞玻璃化冷冻处理系统01中的报警装置对换液操作或单独吸液操作进行实时监测，当监测到上述错误的发生后，提示故障信息，并告知操作者需要停止操作。
另一种实施例，在细胞玻璃化冷冻处理系统01内部或外部还设置有存储装置(图中未示)，该存储装置中放置有液氮，用于在对基础液滴50完成换液操作以及单独吸液操作后，将带细胞51的基础液滴50连同冷冻载杆10放入该存储装置中，实现对基础液滴50及细胞51的玻璃化冷冻。
请参见图5所示的本申请提出的一种细胞玻璃化冷冻处理方法的流程图以及图6中所示的细胞玻璃化冷冻处理方法的系统流程示意图，且图6中包括有a-h以表示细胞玻璃化冷冻处理方法的系统流程，具体包括如下步骤：
s10、将带有基础液滴50的冷冻载杆10放入处理装置(图中未示)中，其中基础液滴50内还收容有细胞51；
具体的，请配合参见图6中的a和b，在本实施例中，通过手动地使用移液器将基础液滴50加入至冷冻载杆10的涂胶层111上，在完成基础液滴50的放置后，手动地使用玻璃巴斯管将细胞51转移至基础液滴50中。在此过程中，细胞51会缓慢地在基础液滴50中沉降，最后降落在涂胶层111上，等待10s-30s的时长后，细胞51会轻轻地粘附在涂胶层111的表面。待基础液滴50以及收容在基础液滴50中的细胞51稳定后，将带有基础液滴50的冷冻载杆10放入处理装置中。
s20、将注液针31沿平行于冷冻载杆10的平面膜片11的方向从一端伸入基础液滴50中，将吸液针41沿平行于平面膜片11的方向从另一端伸入基础液滴50中，以对基础液滴50进行换液操作；
具体的，请配合参见图6中的c和d，在本实施例中，将带有基础液滴50的冷冻载杆10放入处理装置后，需要调整注液针31、吸液针41与基础液滴50的相对位置，使得注液针31和吸液针41分列于基础液滴50的两侧，并将注液针31和吸液针41的针头分别浸入基础液滴50中，以保证注液针31的注液效果以及吸液针41的吸液效果，且注液针31的注液以及吸液针41的吸液同时进行。
一种实施例，注液针31和吸液针41位于基础液滴50的两端对称位置，且水平高度相等，调整注液针31和吸液针41的位置，使得注液针31和吸液针41缓慢地浸入基础液滴50中并位于基础液滴50高度的中间位置。可以理解的是，当注液针31和吸液针41的针头位于基础液滴50高度的中间位置时，能够较好地保证换液操作过程中的换液效果。
s30、调整吸液针41相对于平面膜片11的角度和/或高度，对基础液滴50进行吸液操作，以减少平面膜片11上残留的基础液滴容量。
具体的，请配合参见图6中的e、f和g，在本实施例中，换液操作结束后，注液针31停止注液，并调整吸液针41的角度，调整好吸液针41的角度后，吸液针41继续执行吸液操作，减少基础液滴50的体积。在进行吸液操作过程中，实时调整吸液针41的高度，使得吸液针41的针头逐渐趋近于平面膜片11的表面，以此来使得基础液滴50的残留体积达到尽可能的少，且由于平面膜片11的超疏水特性，能够使得基础液滴50在平面膜片11上残留的液体体积小于0.1μl。一种实施例，吸液针41相对于平面膜片11的角度为90°，即吸液针41与平面膜片11垂直。
需要提出的是，完成单独吸液操作后，需将冷冻载杆10连同细胞51放入液氮中进行玻璃化冷冻，图6中的h即表示将冷冻载杆10放入液氮中进行玻璃化冷冻的示意。
本申请提供的细胞玻璃化冷冻处理方法，用于上述细胞玻璃化冷冻处理系统01中，通过该细胞玻璃化冷冻处理方法能够有效地降低人工操作强度、减少人工操作过程中的失误和操作过程中所需要的试剂使用量，以及减少细胞51的转移次数，实现细胞玻璃化冷冻技术的自动化操作，进而达到减少细胞渗透压冲击以及提高细胞玻璃化冷冻降温速度的效果。
一种实施例请参见图7，在本申请提供的一种细胞玻璃化冷冻处理方法中的步骤s10“将带有基础液滴50的冷冻载杆10放入处理装置中”，还包括：
s10a、基础液滴50的体积v满足：3μl≤v≤5μl，且基础液滴50的直径d满足：1.5mm≤d≤2.5mm。
具体的，在本实施例中，通过手动地使用移液器将3μl-5μl的基础液滴50加入至冷冻载杆10的涂胶层111上，基础液滴50会在平面膜片11的涂胶层111上形成直径约为1.5mm-2.5mm的近球形液滴，该近球形液滴具有超疏水效果，使得基础液滴50被粘附住且不易移动。
一种实施例请继续参见图7，在本申请提供的一种细胞玻璃化冷冻处理方法中的步骤s20“将注液针31沿平行于冷冻载杆10的平面膜片11的方向从一端伸入基础液滴50中，将吸液针41沿平行于平面膜片11的方向从另一端伸入基础液滴50中”，还包括：
s20a、注液针31和吸液针41之间的最小距离l满足：1.0mm≤l≤1.4mm。
具体的，在本实施例中，调整注液针31、吸液针41与基础液滴50的相对位置，使得注液针31和吸液针41分列于基础液滴50的两侧，并使得注液针31和吸液针41的针头之间的距离介于1.0mm-1.4mm之间，由于基础液滴50的直径位于1.5mm-2.5mm之间，能够使得注液针31和吸液针41的针头均位于基础液滴50的内部，并以此来同时实现注液针31的注液操作以及吸液针41的吸液操作。且注液针31和吸液针41采用玻璃拉丝工艺制备而成，针尖内径介于30μm-60μm之间，外径介于80μm-120μm之间。可以理解的是，注液针31和吸液针41的针头之间的距离范围均能够实现基础液滴50中较好的换液效果。
一种实施例请继续参见图7，在本申请提供的一种细胞玻璃化冷冻处理方法中的步骤s20“对基础液滴50进行换液操作”，还包括：
s20b、注液针31的注液速度介于3μl/min-6μl/min之间，吸液针41的吸液速度介于3μl/min-6μl/min之间。
具体的，在本实施例中，启动换液操作后，由于注液操作和吸液操作同时进行，为保证基础液滴50内部较好的换液效果，需对注液针31和吸液针41的速度进行限定，即注液针31的注液速度与吸液针41的吸液速度均介于3μl/min-6μl/min之间。注液针31和吸液针41的速度能够使得基础液滴50中的浓度能够实现缓慢地线性增加，使得基础液滴50内部具有较好的换液效果。
一种实施例请继续参见图7，在本申请提供的一种细胞玻璃化冷冻处理方法中的步骤s20“对基础液滴50进行换液操作”，还包括：
s20c、注液针31的注液速度与吸液针41的吸液速度相同，用以维持基础液滴50在换液操作过程中的形态稳定。
具体的，在本实施例中，为更好地保证换液操作过程中的换液效果，以及实现基础液滴50内部浓度的梯度变化，使得注液针31的注液速度与吸液针41的吸液速度保持一致，即注液流量与吸液流量一致，以此来使得基础液滴50的形状保持不变。
需要提出的是，在换液操作过程中，注液针31向基础液滴50中先后注入平衡液和玻化液，同时吸液针41吸出基础液滴50中的平衡液和/或玻化液，换液操作过程持续时间大约为8min-12min。可以理解的是，在换液操作过程中，吸液针41还可能在某一时段吸出的液体为平衡液和玻化液的混合液。
一种实施例请参见图8，在本申请提供的一种细胞玻璃化冷冻处理方法中的步骤s20“对基础液滴50进行换液操作”，还包括以下步骤：
s21、对换液操作进行实时监控；
s22、调整换液操作中的液体注入量、排出量以及动作时序。
具体的，在本实施例中，当将带有基础液滴50的冷冻载杆10放入至处理装置中，调整显微相机20的相对位置，即调整显微相机20的高度位置，使得平面膜片11能够位于显微相机20的下方，此时显微相机20能够清晰地对基础液滴50和基础液滴50内部的细胞51进行实时拍摄。同时对基础液滴50进行换液操作，注液针31先后分别向基础液滴50内注入平衡液或玻化液，并通过显微相机20对换液操作过程的实时监控来自动调整注入基础液滴50内的液体，即从注入平衡液调整为注入玻化液。
一种实施例请参见图9，对于上述步骤s21“对换液操作进行实时监控”，还包括以下步骤：
s211、接收换液操作中拍摄到的图片数据；
s212、对图片数据进行预处理，以提取细胞51的轮廓尺寸特征；
s213、计算轮廓尺寸特征的变化率，并结合变化率计算得出细胞换液各阶段的结束时间；
s214、输出轮廓尺寸的变化曲线。
具体的，在本实施例中，在换液操作过程中，细胞51将经历皱缩-恢复-皱缩的形态变化过程。此时，显微相机20将拍摄到的图片实时上传给主控制单元，主控制单元根据图像处理算法对图像进行滤波、降噪、增强等预处理，提取出细胞51的面积轮廓尺寸特征，并根据细胞51的面积轮廓尺寸特征的变化率，并结合设置的动作时间参数，综合得出细胞换液操作过程中各阶段的结束时间，最后输出轮廓尺寸的变化曲线(请参见图12)。
一种实施例请参见图10并配合参见图12所示的细胞面积轮廓尺寸的变化曲线图，对基础液滴50进行换液操作包括通过注液针31注入平衡液和/或玻化液的操作，对于上述步骤s22“调整换液操作中的液体注入量、排出量以及动作时序”，还包括以下步骤：
s221、通过注液针31对基础液滴50进行注入平衡液的操作；
s222、若计算得到的变化率在第一阈值范围内的时长达到第一预设时段时，31注液针停止注入平衡液，并对基础液滴50进行注入玻化液的操作。
具体的，在本实施例中，在换液操作过程中，第一注射泵301向注液针31内注入平衡液，注液针31向基础液滴50内注入平衡液，此时，吸液针41同时从基础液滴50内吸出平衡液。通过显微相机20实时将细胞51的轮廓尺寸特征上传到主控制单元后，计算得出细胞51的轮廓尺寸特征的变化率，定义第一阈值范围φ1，使得当细胞51的轮廓尺寸特征的变化率的值位于第一阈值范围φ1内的时长达到第一预设时段△t1时，停止向基础液滴50中注入平衡液操作。在本实施例中，△t1的值为15～60s。
一种实施例请继续参见图10并配合参见图12所示的细胞轮廓尺寸的变化曲线图，对于上述步骤s222“对基础液滴50进行注入玻化液的操作”后，还包括以下步骤：
s223、当计算得到的变化率在预设的第二阈值范围内的时长达到第二预设时段时，或，注液针31向基础液滴50内注入玻化液的时长超过的预设的玻化液注入时段时，停止换液操作。
具体的，在本实施例中，在换液操作过程中，完成注入平衡液操作后，第二注射泵302向注液针31内注入玻化液，注液针31向基础液滴50内注入玻化液，此时，吸液针41同时从基础液滴50内吸出玻化液。并通过实时计算得出细胞51的面积轮廓尺寸特征的变化率，并定义第二阈值范围φ2，使得当细胞51的轮廓尺寸特征的变化率的值位于第二阈值范围φ2内的时长达到第二预设时段△t2时，停止向基础液滴50中注入玻化液操作。在本实施例中，△t2的值为5～20s。
另一种实施例，当注液针31向基础液滴50内注入玻化液的时长超过预设的注入时段时，注液针31停止向基础液滴50中注入玻化液。可以理解的是，若注入玻化液的时长达到预设的注入时段，但细胞51的面积轮廓尺寸特征的变化率的值位于第二阈值范围φ2内的时长未达到第二预设时段△t2时，也立即停止注入玻化液。若细胞51的轮廓尺寸特征的变化率的值位于第二阈值范围φ2内的时长达到第二预设时段△t2，但注入玻化液的时长未达到预设的注入时段时，同样停止注入玻化液。
一种实施例请参见图11，在本申请提供的一种细胞玻璃化冷冻处理方法中的步骤s30“对基础液滴50进行吸液操作”后，还包括：
s40、将承载有剩余基础液滴50的冷冻载杆10放置于液氮中，细胞51收容于残留基础液滴50中，且残留基础液滴容量小于0.1μl。
具体的，在本实施例中，完成换液操作和单独吸液操作后，需要将带有细胞51和剩余的基础液滴50的冷冻载杆10从处理装置中取出，并快速地放入液氮中进行保存，使得带有细胞51和残留的基础液滴50的冷冻载杆10能够进行玻璃化冷冻。此操作过程采用手动方式完成。
需要提出的是，请参见图13，本申请还示意了一种细胞玻璃化冷冻处理装置1的实际动作流程。该动作流程可以基于本申请提出的细胞玻璃化冷冻处理方法来实现，还可以基于本申请提供细胞玻璃化冷冻处理装置1实现其自动化操作。具体包括如下动作流程：
s001、处理装置开机并执行处理装置的系统初始化，进行软件和硬件系统的自检，确认各状态和通讯是否正常，进行机械模块复位，并使其运动至初始位置；
s002、液路系统05和温控系统04同步执行相关动作，且液路系统05执行相关的准备动作，包括手动连接管路和装载试剂，并确保管路中的气体被排出，注射泵回程差已经消除；温控系统04启动pid控制，确保抽屉模组03中的温度达到设置的目标值；
s003、待液路系统05和温控系统04显示处于正常状态后，处理装置整机进入空闲状态，并根据目标细胞和试剂类型设置相关参数，主要包括：注液流量、吸液流量、注液时长、吸液时长、等待时间以及阈值范围等参数；
s004、处理装置启动测试前，将自动打开抽屉模组03，并手动将已经装载了基础液滴50和细胞51的冷冻载杆10放置于抽屉模组03中；
s005、待上述工作都准备好后，启动换液操作流程，处理装置将自动关闭抽屉模组03，并压紧冷冻载杆10，根据设置的参数进行换液操作，提示换液倒计时以及正在执行的步骤，并实时上传显微相机20拍摄到的细胞51图像；
s006、在换液操作过程中，主控制单元将根据上传的图像数据，经过算法处理，自动得出细胞51面积轮廓尺寸特征的变化率，并结合设置的动作时间参数，综合计算细胞换液结束时间；
s007、待换液操作结束后，抽屉模组03自动快速打开，手动将冷冻载杆10快速取出，连同附着在其上面的细胞51快速放置到液氮中，执行细胞玻璃化冷冻过程。
以上是本发明实施例的实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
1.一种细胞玻璃化冷冻处理系统，其特征在于，包括壳体和冷冻载杆，所述冷冻载杆包括平面膜片，所述平面膜片用于承载内含细胞的基础液滴；
所述壳体具有开口，所述壳体内还收容有显微相机、注液器和吸液器，所述注液器包括用于向基础液滴注射平衡液和玻化液的注液针；所述吸液器包括用于吸收基础液滴中液体的吸液针；
当所述冷冻载杆从所述开口送入所述壳体内时，所述平面膜片位于所述显微相机的下方，所述注液器和所述吸液器分别移动至基础液滴的相对两侧，并使得所述注液针和所述吸液针分别伸入基础液滴中，以对基础液滴进行换液操作，所述吸液器还用于对基础液滴进行单独吸液操作，所述显微相机用于实时监控基础液滴的状态。
2.如权利要求1所述的细胞玻璃化冷冻处理系统，其特征在于，所述平面膜片上设置有涂胶层和围设于所述涂胶层外围的疏水层，所述涂胶层用于承载和固定基础液滴。
3.如权利要求2所述的细胞玻璃化冷冻处理系统，其特征在于，所述涂胶层的直径d满足：100μm≤d≤500μm。
4.如权利要求1所述的细胞玻璃化冷冻处理系统，其特征在于，所述注液器包括分别连通所述注液针的第一注射泵和第二注射泵，所述第一注射泵用于对所述注液针泵入平衡液，所述第二注射泵用于对所述注液针泵入玻化液。
5.如权利要求1所述的细胞玻璃化冷冻处理系统，其特征在于，所述吸液器包括连通所述吸液针的第三注射泵，所述第三注射泵用于泵出基础液滴内的液体。
6.如权利要求1所述的细胞玻璃化冷冻处理系统，其特征在于，所述吸液针与所述壳体之间转动连接，所述吸液针在换液操作过程中处于平行于所述平面膜片的第一姿态，所述吸液针在单独吸液操作过程中相对于所述壳体转动，进而与所述平面膜片形成倾斜的第二姿态。
7.如权利要求1所述的细胞玻璃化冷冻处理系统，其特征在于，所述细胞玻璃化冷冻处理系统中还设有报警装置，所述报警装置用于在换液操作和/或单独吸液操作过程中，监测到基础液滴和/或细胞丢失时提示故障信息。
8.一种细胞玻璃化冷冻处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
将带有基础液滴的冷冻载杆放入处理装置中，其中基础液滴内还收容有细胞；
将注液针沿平行于所述冷冻载杆的平面膜片的方向从一端伸入基础液滴中，将吸液针沿平行于所述平面膜片的方向从另一端伸入基础液滴中，以对基础液滴进行换液操作；
调整所述吸液针相对于所述平面膜片的角度和/或高度，对基础液滴进行吸液操作，以减少所述平面膜片上残留的基础液滴容量。
9.如权利要求8所述的细胞玻璃化冷冻处理方法，其特征在于，所述将带有基础液滴的冷冻载杆放入处理装置中，包括：
基础液滴的体积v满足：3μl≤v≤5μl，且基础液滴的直径d满足：1.5mm≤d≤2.5mm。
10.如权利要求8所述的细胞玻璃化冷冻处理方法，其特征在于，所述将注液针沿平行于所述冷冻载杆的平面膜片的方向从一端伸入基础液滴中，将吸液针沿平行于所述平面膜片的方向从另一端伸入基础液滴中，包括：
所述注液针和所述吸液针之间的最小距离l满足1.0mm≤l≤1.4mm。
11.如权利要求8所述的细胞玻璃化冷冻处理方法，其特征在于，所述对基础液滴进行换液操作，包括：
所述注液针的注液速度介于3μl/min-6μl/min之间，所述吸液针的吸液速度介于3μl/min-6μl/min之间。
12.如权利要求8所述的细胞玻璃化冷冻处理方法，其特征在于，所述对基础液滴进行换液操作，还包括：
所述注液针的注液速度与所述吸液针的吸液速度相同，用以维持基础液滴在换液操作过程中的形态稳定。
13.如权利要求8所述的细胞玻璃化冷冻处理方法，其特征在于，所述对基础液滴进行换液操作，还包括如下步骤：
对换液操作进行实时监控；
调整换液操作中的液体注入量、排出量以及动作时序。
14.如权利要求13所述的细胞玻璃化冷冻处理方法，其特征在于，所述对换液操作进行实时监控，还包括如下步骤：
接收换液操作中拍摄到的图片数据；
对所述图片数据进行预处理，以提取细胞面积的轮廓尺寸特征；
计算所述面积轮廓尺寸特征的变化率，并结合所述变化率计算得出细胞换液各阶段的结束时间；
输出所述面积轮廓尺寸的变化曲线。
15.如权利要求13所述的细胞玻璃化冷冻处理方法，其特征在于，所述对基础液滴进行换液操作包括通过所述注液针注入平衡液和/或玻化液的操作，所述调整换液操作中的液体注入，包括：
通过所述注液针对基础液滴进行注入平衡液的操作；
若计算得到的所述变化率在第一阈值范围内的时长达到第一预设时段时，所述注液针停止注入平衡液，并对基础液滴进行注入玻化液的操作。
16.如权利要求15所述的细胞玻璃化冷冻处理方法，其特征在于，所述对基础液滴进行注入玻化液的操作，还包括：
当计算得到的所述变化率在预设的第二阈值范围内的时长达到第二预设时段时，或，
所述注液针向基础液滴内注入玻化液的时长超过的预设的玻化液注入时段时，停止所述换液操作。
17.如权利要求8所述的细胞玻璃化冷冻处理方法，其特征在于，所述对基础液滴进行吸液操作后，还包括如下步骤：
将承载有残留基础液滴的所述冷冻载杆放置于液氮中，细胞收容于残留基础液滴中，且残留基础液滴容量小于0.1μl。
技术总结