本发明涉及冻存液技术领域，尤其涉及一种细胞冻存液及其冻存造血干细胞的方法和干细胞制剂。
背景技术：
细胞冻存液可以防止细胞在冷冻过程中受损伤，传统的造血干细胞冻存液采用10％dmso 90％胎牛血清冻存的造血干细胞，经复苏清洗后活率较低，凋亡细胞裂解物包裹未凋亡的细胞形成絮状物甚至细胞成团且细胞不稳定，成团的细胞输入到人体内后容易引起病人发热。因此，有效的控制造血干细胞冻存后的活率以及稳定性至关重要。
技术实现要素：
本发明提供了一种细胞冻存液及其冻存造血干细胞的方法，解决了传统的造血干细胞冻存液冻存的造血干细胞经复苏后，细胞活率较低，细胞易成团的问题。
其具体技术方案如下：
本发明提供了一种细胞冻存液，由以下组分组成：
dmso；
人血白蛋白注射液；
勃脉力a注射液。
本发明提供的细胞冻存液组成简单，细胞冻存液中各组分相互配合，具有协同效应，可以显著提升细胞的冻存效果，使冻存的造血干细胞复苏后活率较高，且细胞稳定性好。
本发明中dmso为临床级dmso。
本发明中，所述dmso、所述人血白蛋白注射液和所述勃脉力a注射液的体积比为(1-2)：(4-6)：(2-5)。在各组分该配比范围内，更有利于提升细胞冻存液的冻存效果，体积比优选为1：5：4、1：4：5或2：6：2。
本发明中，所述人血白蛋白注射液中人血白蛋白的质量浓度为20％；
所述勃脉力a注射液为复方电解质溶液，其组分为：每1000ml勃脉力a注射液中含有氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g、氯化镁0.30g；
本发明还提供了上述细胞冻存液在冻存造血干细胞中的应用。
造血干细胞较间充质干细胞更脆弱，体外分离保存较难，且易成团，将上述细胞冻存液应用在造血干细胞的冻存中，可以提高冻存的造血干细胞复苏后的活率，从而减少或避免细胞成团的问题。
本发明还提供了一种冻存造血干细胞的方法，将造血干细胞冻存于所述细胞冻存液中。
所述冻存具体为：将所述造血干细胞加入所述细胞冻存液中，进行程序降温后，置于液氮中保存；
所述细胞冻存液为4℃预冷的细胞冻存液。
本发明还提供了一种干细胞制剂，包括造血干细胞和上述细胞冻存液。
本发明提供的干细胞制剂在冻存8h后，仍可保持较高的细胞活率，有利于该干细胞制剂对疾病的治疗。
本发明中，所述干细胞制剂还包括：勃脉力a注射液。所述勃脉力a注射液与所述细胞冻存液的体积比为1：1。
本发明中，所述干细胞制剂的制备具体为：采用勃脉力a注射液重悬造血干细胞，调整细胞密度(2-3)×107个/ml，再以1：1的体积比加入细胞冻存液，得到干细胞制剂。本发明干细胞制剂制备好即可使用，也可以冻存后使用。
本发明中，所述造血干细胞在所述干细胞制剂中的密度为(1-1.5)×107个/ml，优选为1.2×107个/ml。
从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种细胞冻存液，由dmso、人血白蛋白注射液和勃脉力a注射液组成。该细胞冻存液成分简单安全，各组分相互配合，具有协同效应，可以显著提升细胞的冻存效果，使冻存的造血干细胞复苏后活率较高，且细胞稳定性好，有利于疾病的治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例和对比例造血干细胞冻存的流程图。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中使用的试剂需为市购。
为了更详细的说明本发明，下面结合实施例对本发明进行具体地描述。
实施例1
细胞冻存液的制备
每10ml细胞冻存液：于离心管中加入4ml勃脉力a注射液，5ml20wt％人血白蛋白注射液，1ml临床级dmso，轻轻吹打混匀。按每10-15ml脐带血体积冻存3-5管的量配制冻存液，放4℃冰箱预冷。
实施例2
细胞冻存液的制备
本实施例与实施例1的区别在于：每10ml冻存液中含5ml勃脉力a注射液、4ml人血白蛋白、1ml临床级dmso。
实施例3
细胞冻存液的制备
本实施例与实施例1的区别在于：每10ml冻存液中含2ml勃脉力a注射液、6ml人血白蛋白、2ml临床级dmso。
对比例1
细胞冻存液的制备
每10ml细胞冻存液：于离心管中加入8ml胎牛血清及2mldmso无菌细胞级，轻轻吹打混匀。按每10-15ml脐带血体积冻存3-5管的量配制冻存液，放4℃冰箱预冷。
对比例2
细胞冻存液的制备
本对比例与实施例1的区别仅在于：采用0.9％氯化钠注射液替换冻存液中的勃脉力a注射液。
对比例3
细胞冻存液的制备
本对比例与实施例1的区别仅在于：每10ml冻存液中含7ml勃脉力a注射液、2ml人血白蛋白注射液、1ml临床级dmso。
实施例4
干细胞制剂的制备
1、准备试剂耗材，开启超净工作台并用酒精纱布消毒；
2、将脐带血放至洁净工作台中，用无菌纱布擦拭消毒管路并小心用50ml注射器吸取脐带血，准确量取血液并转移至储液瓶中，抽取少量送检；
3、向储液瓶中加入等量6％羟乙基淀粉注射液重悬沉淀，旋松瓶盖透气，静置30min；
4、待储液瓶中的液体明显分成两层，且上层与下层的体积比为4:1时，吸取上层清液至50ml离心管中，600g离心10min；
5、离心结束后，吸弃上清液；下层沉淀加入rpmi-1640培养基至40ml，重悬细胞，吸取200μl细胞悬液进行计数和活力检测，600g离心10min；
6倒掉离心后上清液，根据计数结果取适量勃脉力a注射液重悬细胞沉淀，调整细胞密度为2.4×107个/ml。缓慢加入等体积配制好的实施例1～3和对比例1～3任意一种细胞冻存液(分为实验组1、实验组2、实验组3、对照组1、对照组2和对照组3)，混匀后分装至冻存管中，冻存细胞的终密度为1.2×107个/ml，冻存量为1.5ml/管；
7、将冻存管于1.5h内程序降温至-80℃，后保存于液氮中。
试验例
1、将实施例4冻存管在液氮中冻存一周后液氮中取出，每组复苏7管，将冻存管迅速转移至37℃水浴锅中进行复苏，复苏后转移至超净工作台中，分别用巴氏吸管将两组细胞转移至两支装有30mlrpmi-1640培养基的离心管中，混匀后600g离心5min；
2、弃上清，分别用40ml含0.5％人血白蛋白的0.9％氯化钠注射液轻轻吹打重悬细胞，600g离心5min，此步骤重复一次；
3、离心后分别重悬于40ml人血白蛋白中，并加入40ml氯化钠注射液，混匀后取200μl细胞悬液进行计数和活力检测，并观察细胞悬液能否吹散。将其余的造血干细胞悬液至于4℃保存。然后再每隔0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h时，观察细胞是否成团、能否吹散并记录，另外从中抽取部分细胞进行计数以及活率检测，结果如表1和表2所示。
从表1的结果可知，相比于对比例1～3细胞冻存液制备的干细胞制剂，实施例1～3提供的制备的干细胞制剂冻存8h内，还可以使造血干细胞保持较高的细胞活率，且与对比例1～3差异显著。
从表2的结果可知，实施例1和实施例3提供的干细胞制剂在冻存4h后细胞才开始逐渐成团，实施例2提供的细胞冻存液在冻存2h后细胞开始成团，但成团趋势缓慢。而对比例1和对比例3提供的干细胞制剂在冻存1h后使开始成团，对比例2提供的干细胞制剂虽然在冻存4h后开始成团，但成团趋势较快。
表1和表2说明实验组1～3提供的干细胞制剂可以显著提升细胞的冻存效果，且干细胞制剂各组分在一定的配比范围内更有利于冻存效果的提升。
表1造血干细胞冻存复苏后细胞计数及活率结果
表2造血干细胞冻存复苏后成团时间结果
注： 代表成团，-代表未成团。
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
1.一种细胞冻存液，其特征在于，由以下组分组成：
dmso；
人血白蛋白注射液；
勃脉力a注射液。
2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述dmso、所述人血白蛋白注射液和所述勃脉力a注射液的体积比为(1-2)：(4-6)：(2-5)。
3.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述人血白蛋白注射液中人血白蛋白的质量浓度为20％。
4.权利要求1至3任意一项所述的细胞冻存液在冻存造血干细胞中的应用。
5.一种冻存造血干细胞的方法，其特征在于，将造血干细胞冻存于权利要求1至3任意一项所述的细胞冻存液中。
6.权利要求1至3任意一项所述的细胞冻存液在制备干细胞制剂中的应用。
7.一种干细胞制剂，其特征在于，包括造血干细胞和权利要求1至3任意一项所述的细胞冻存液。
8.根据权利要求7所述的干细胞制剂，其特征在于，还包括：勃脉力a注射液。
9.根据权利要求7所述的干细胞制剂，其特征在于，所述勃脉力a注射液与所述细胞冻存液的体积比为1：1。
10.根据权利要求7所述的干细胞制剂，其特征在于，所述造血干细胞在所述干细胞制剂中的密度为(1-1.5)×107个/ml。
技术总结