本发明属于干细胞
技术领域：
，尤其涉及一种人脐带、羊膜和胎盘样本的通用保存液及其制备方法。
背景技术：
：间充质干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，又称多潜能基质细胞，简称mscs，是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，包括：骨髓、脐带、脂肪、羊膜、牙髓、胎盘等。在适宜条件下可分化为脂肪、骨、软骨等多种组织细胞。与骨髓来源的msc相比，脐带、羊膜和胎盘来源的间充质干细胞因其取材方便，无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、增殖能力强、免疫调节作用大，分泌细胞生长因子的总量也非常高，便于扩增和传代，同时又没有配型、排异等问题，极其适合用于临床研究和应用，是间充质干细胞的理想来源。但是，间充质干细胞需要通过样本在gmp实验室中制备分离、高效提纯和快速扩增后，才能产出符合标准的细胞。所以，样本的安全保存就成为了间充质干细胞产出的基本要求。而样本从医院产房到gmp实验室，少则需要数小时，多则需要数天，这其中样本会受到诸如时间、温度、营养等因素的影响，导致样本中的细胞数量少，活力低。因此，寻求一种能长时间保存脐带、羊膜和胎盘的通用保存液一直是本领域技术人员亟待解决的问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种人脐带、羊膜和胎盘样本的通用保存液及其制备方法，本通用保存液可用于长时间保存脐带、羊膜和胎盘，获取的间充质干细胞数量多、活率高。本发明的具体技术方案如下：一种人脐带、羊膜和胎盘样本的通用保存液，所述通用保存液由dmem基础培养基、胰岛素、人血白蛋白、维生素c、egf、青霉素、链霉素和肝素钠组成；所述通用保存液的ph值为7.5～7.8。优选的，所述胰岛素在所述通用保存液中的浓度为10-20mg/l；所述人血白蛋白在所述通用保存液中的浓度为10-15g/l；所述维生素c在所述通用保存液中的浓度为100-200mg/l；所述egf在所述通用保存液中的浓度为10-50μg/l。优选的，所述胰岛素在所述通用保存液中的浓度为10mg/l；所述人血白蛋白在所述通用保存液中的浓度为10g/l；所述维生素c在所述通用保存液中的浓度为100mg/l；所述egf在所述通用保存液中的浓度为10μg/l。优选的，所述青霉素在所述通用保存液中的浓度为50000-100000u/l；所述链霉素在所述通用保存液中的浓度为50-100mg/l；所述肝素钠在所述通用保存液中的浓度为6250-12500u/l。优选的，所述青霉素在所述通用保存液中的浓度为100000u/l；所述链霉素在所述通用保存液中的浓度为100mg/l；所述肝素钠在所述通用保存液中的浓度为6250u/l。本发明还提供了上述技术方案所述通用保存液的制备方法，包括以下步骤：在dmem基础培养基中加入人血白蛋白和肝素钠，再依次分别加入青霉素、链霉素、胰岛素、维生素c和egf，然后采用滤膜过滤，得到所述通用保存液。本发明还提供了一种保存样本的方法，包括以下步骤：采用上述技术方案所述通用保存液对样本进行保存；所述样本为人脐带、羊膜和/或胎盘。优选的，所述样本的目的细胞为间充质干细胞。优选的，所述保存的时间为72h以下。综上所述，本发明提供了一种通用保存液，所述通用保存液由dmem基础培养基、胰岛素、人血白蛋白、维生素c、egf、青霉素、链霉素和肝素钠组成；所述通用保存液的ph值为7.5～7.8。本发明中，dmem基础培养基为样本的间充质干细胞提供最基础的营养；胰岛素能促进样本间充质干细胞对通用保存液中的糖分进行吸收和利用，维持细胞活性；人血白蛋白为间充质干细胞提供动态平衡，维持细胞渗透压；维生素c能防止长时间的氧化产生的自由基对间充质干细胞造成损伤；egf能促进间充质干细胞增殖，维持细胞原有形态；青霉素和链霉素可以防止细菌滋生导致的样本污染；肝素钠可以防止血凝结成血块降低新陈代谢；通用保存液的ph值为7.5～7.8，为间充质干细胞提供合适的酸碱环境。实验结果表明，该通用保存液可用于长时间保存脐带、羊膜和胎盘，获取的间充质干细胞数量多、活率高，并且，人血白蛋白、胰岛素、维生素c和egf在提高保存脐带中间充质干细胞数和间充质干细胞活率具有协同作用。另外，该通用保存液的保质时间可长达半年，可一次性大量配制，控制成本。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本发明实施例2采用不同保存方法保存脐带24h、48h、72h后的间充质干细胞活率图。具体实施方式本发明提供了一种人脐带、羊膜和胎盘样本的通用保存液及其制备方法，该通用保存液可用于长时间保存脐带、羊膜和胎盘，获取的间充质干细胞数量多、活率高。下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1本实施例进行通用保存液的制备，包括以下步骤：在950mldmem基础培养基中加入50ml20％人血白蛋白(人血白蛋白浓度为10g/50ml)和1ml肝素钠注射液，混匀，再依次分别加入100000u青霉素、100mg链霉素、10mg胰岛素、100mg维生素c和10μgegf，搅拌溶解，然后采用0.22μm无菌滤膜过滤去除细菌，得到通用保存液，标注生产日期，置于4℃下保存。其中，肝素钠注射液的浓度为6250u/ml。对比例1本对比例进行对照通用保存液1的制备，制备方法同实施例1，但对照通用保存液1以等体积的pbs替换50ml20％人血白蛋白。对比例2本对比例进行对照通用保存液2的制备，制备方法同实施例1，但对照通用保存液2以等质量的pbs替换胰岛素。对比例3本对比例进行对照通用保存液3的制备，制备方法同实施例1，但对照通用保存液3以等质量的pbs替换维生素c。对比例4本对比例进行对照通用保存液4的制备，制备方法同实施例1，但对照通用保存液4以等质量的pbs替换egf。实施例2在无菌条件下，取剖宫的手术健康、无传染病的新生儿脐带24cm，均匀分成8份，分别保存在实施例1通用保存液、生理盐水、dmem培养基、无菌容器、对照通用保存液1、对照通用保存液2、对照通用保存液3和对照通用保存液4中，在4℃恒温保存24h、48h、72h后取相同长度的脐带组织使用胶原酶消化法分离脐带间充质干细胞，过滤离心后，使用台盼蓝计数，并计算细胞活率。请参阅图1、表1和表2，图1为本发明实施例2采用不同保存方法保存脐带24h、48h、72h后的间充质干细胞活率图，表1为采用不同保存方法保存脐带24h、48h、72h后的间充质干细胞数，表2为采用不同保存方法保存脐带24h、48h、72h后的间充质干细胞活率。结果表明，实施例1通用保存液能在72h内对脐带进行保存，能够在72h内保证分离得到的间充质干细胞有90％以上的活率，能最大限度的保持脐带间充质干细胞的高活性，提高脐带间充质干细胞的提取度，对间充质干细胞后期培养和节约成本有极大的提升。而生理盐水和dmem基础培养基能在24h内保存脐带，但随着时间的延长，获取的脐带间充质干细胞数量和活率逐步下降；保存在无菌容器中的脐带因为失去液体环境，细胞间大量缺水，导致脐带间充质干细胞快速凋亡，在48h时已经无法分离出活的脐带间充质干细胞。并且，与对照通用保存液1、对照通用保存液2、对照通用保存液3和对照通用保存液4相比，采用实施例1通用保存液保存的脐带中间充质干细胞数和间充质干细胞活率明显更高，表明人血白蛋白、胰岛素、维生素c和egf在提高保存脐带中间充质干细胞数和间充质干细胞活率具有协同作用。表1采用不同保存方法保存脐带24h、48h、72h后的间充质干细胞数保存方法24h48h72h实施例1通用保存液7.17×1066.78×1066.36×106生理盐水8.02×1057.88×1055.65×105dmem培养基4.32×1063.01×1061.94×106无菌容器3.86×10300对照通用保存液14.77×1064.02×1063.29×106对照通用保存液24.02×1063.76×1063.17×106对照通用保存液34.57×1062.99×1061.88×106对照通用保存液44.98×1064.19×1063.67×106表2采用不同保存方法保存脐带24h、48h、72h后的间充质干细胞活率实施例3在无菌条件下，取剖宫手术的健康、无传染病的新生儿胎盘一例，将胎盘羊膜剥下，均匀分成8份，分别保存在实施例1通用保存液、生理盐水、dmem培养基、无菌容器、对照通用保存液1、对照通用保存液2、对照通用保存液3和对照通用保存液4中，在4℃恒温保存24h、48h、72h后取相同质量的羊膜组织使用胶原酶消化法分离羊膜间充质干细胞，过滤离心后，使用台盼蓝计数。结果请参阅表3，结果表明实施例1通用保存液对羊膜有较好的保存效果，在72h仍能分离大量的间充质干细胞，而生理盐水和dmem基础培养基中的羊膜会随时间的延长细胞数量降低；因羊膜中含有大量的水分，在无菌容器中仍能保存至72h，但间充质干细胞数量会大幅度下降。与对照通用保存液1、对照通用保存液2、对照通用保存液3和对照通用保存液4相比，采用实施例1通用保存液保存的羊膜中间充质干细胞数量明显更大，表明人血白蛋白、胰岛素、维生素c和egf在提高保存羊膜中间充质干细胞数量具有协同作用。表3采用不同保存方法保存羊膜24h、48h、72h后的间充质干细胞数保存方法24h48h72h实施例1通用保存液6.66×1066.17×1065.83×106生理盐水4.12×1061.59×1067.98×105dmem培养基5.52×1063.07×1061.50×106无菌容器3.23×1051.14×1043.04×103对照通用保存液15.12×1064.73×1062.01×106对照通用保存液24.98×1063.33×1061.45×106对照通用保存液35.56×1064.90×1061.99×106对照通用保存液45.88×1064.91×1062.49×106实施例4在无菌条件下，取剖宫手术的健康、无传染病的新生儿胎盘一例，将胎盘均匀分成8份，分别保存在实施例1通用保存液、生理盐水、dmem培养基、无菌容器、对照通用保存液1、对照通用保存液2、对照通用保存液3和对照通用保存液4中，在4℃恒温保存24h、48h、72h后取相同质量的胎盘组织使用胶原酶消化法分离胎盘间充质干细胞，过滤离心后，使用台盼蓝计数。结果请参阅表4，结果表明实施例1通用保存液对胎盘有较好的保存效果，在72h仍能分离大量的间充质干细胞，而生理盐水、dmem基础培养基和无菌容器中的胎盘都存在较大的间充质干细胞损失。与对照通用保存液1、对照通用保存液2、对照通用保存液3和对照通用保存液4相比，采用实施例1通用保存液保存的胎盘中间充质干细胞数量明显更大，表明人血白蛋白、胰岛素、维生素c和egf在提高保存胎盘中间充质干细胞数量具有协同作用。表4采用不同保存方法保存胎盘24h、48h、72h后的间充质干细胞数保存方法24h48h72h实施例1通用保存液9.88×1069.12×1068.87×106生理盐水5.98×1051.26×1058.44×104dmem培养基7.32×1064.01×1062.45×106无菌容器4.22×1058.17×1042.01×103对照通用保存液17.08×1065.07×1063.81×106对照通用保存液26.89×1064.15×1062.74×106对照通用保存液37.88×1065.48×1063.91×106对照通用保存液47.46×1064.22×1062.31×106以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种人脐带、羊膜和胎盘样本的通用保存液，其特征在于，所述通用保存液由dmem基础培养基、胰岛素、人血白蛋白、维生素c、egf、青霉素、链霉素和肝素钠组成；
所述通用保存液的ph值为7.5～7.8。
2.根据权利要求1所述的通用保存液，其特征在于，所述胰岛素在所述通用保存液中的浓度为10-20mg/l；
所述人血白蛋白在所述通用保存液中的浓度为10-15g/l；
所述维生素c在所述通用保存液中的浓度为100-200mg/l；
所述egf在所述通用保存液中的浓度为10-50μg/l。
3.根据权利要求2所述的通用保存液，其特征在于，所述胰岛素在所述通用保存液中的浓度为10mg/l；
所述人血白蛋白在所述通用保存液中的浓度为10g/l；
所述维生素c在所述通用保存液中的浓度为100mg/l；
所述egf在所述通用保存液中的浓度为10μg/l。
4.根据权利要求1所述的通用保存液，其特征在于，所述青霉素在所述通用保存液中的浓度为50000-100000u/l；
所述链霉素在所述通用保存液中的浓度为50-100mg/l；
所述肝素钠在所述通用保存液中的浓度为6250-12500u/l。
5.根据权利要求4所述的通用保存液，其特征在于，所述青霉素在所述通用保存液中的浓度为100000u/l；
所述链霉素在所述通用保存液中的浓度为100mg/l；
所述肝素钠在所述通用保存液中的浓度为6250u/l。
6.权利要求1至5任意一项所述人脐带、羊膜和胎盘样本的通用保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在dmem基础培养基中加入人血白蛋白和肝素钠，再依次分别加入青霉素、链霉素、胰岛素、维生素c和egf，然后采用滤膜过滤，得到所述通用保存液。
7.一种保存样本的方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用权利要求1至5任意一项所述通用保存液对样本进行保存；
所述样本为人脐带、羊膜和/或胎盘。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述样本的目的细胞为间充质干细胞。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述保存的时间为72h以下。
技术总结本发明属于干细胞技术领域，尤其涉及一种人脐带、羊膜和胎盘样本的通用保存液及其制备方法。本申请的通用保存液中，DMEM基础培养基为样本的间充质干细胞提供最基础的营养；胰岛素能促进样本间充质干细胞对通用保存液中的糖分进行吸收和利用，维持细胞活性；人血白蛋白为间充质干细胞提供动态平衡，维持细胞渗透压；维生素C能防止长时间的氧化产生的自由基对间充质干细胞造成损伤；EGF能促进间充质干细胞增殖，维持细胞原有形态。实验结果表明，本保存液可用于长时间保存脐带、羊膜和胎盘，获取的间充质干细胞数量多、活率高，且人血白蛋白、胰岛素、维生素C和EGF在提高保存脐带中间充质干细胞数和间充质干细胞活率具有协同作用。
技术研发人员：张玲洁;吴基伟;郑婕
受保护的技术使用者：杜德(江门)生物科技有限公司
技术研发日：2020.12.10
技术公布日：2021.03.12
