本发明涉及细胞保护液技术领域，特别涉及一种细胞株冻存复苏的保护液及制备方法。
背景技术：
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。细胞株的冻存和复苏是细胞生物学最常见的实验技术之一，广泛应用于生命科学和医学的各项科学研究或技术应用中。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候又可以再复苏细胞用于实验。而且，冻存一定量的细胞，可防止因正在培养的细胞被污染或其他原因而使细胞丢种，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。
细胞冻存的关键是向培养基中加入冷冻保护剂，一般常用二甲基亚砜(dmso)，使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。常用的细胞冻存液的配方有：传统细胞冻存液的配制比例主要为30％的血清 60％的细胞培养基 10％dmso；而融合瘤细胞、淋巴细胞一般采用90％细胞培养基 10％dmso等。
dmso此类渗透性保护剂，可以有效减少冻存过程中冰晶形成对细胞的损伤。但是，复苏过程中冻存液里的dmso和复苏后细胞培养基里的残留dmso往往对细胞会有一定的毒性作用，影响复苏后细胞的活性和后续试验的开展复苏过程中冻存液里的dmso和复苏后细胞培养基里的残留dmso往往对细胞会有一定的毒性作用，影响复苏后细胞的活性和后续试验的开展。另外有些重要的细胞对于dmso非常敏感(造血干细胞、原代培养神经细胞等)，使用含dmso的细胞冷冻液可能会影响细胞的功能。更重要的是，随着临床上细胞疗法使用的逐渐增加，dmso的潜在毒性如引起dna突变、蛋白变性等，可能带来dmso冻存的细胞在临床应用中的副作用，如腹泻以及神经系统、呼吸系统等组织损伤。
由于在冻存液中，dmso的浓度为10％；复苏后，如不进行离心处理除去dmso，而直接使用培养瓶或培养板培养细胞，残留的dmso浓度也达到1％-3％；为降低dmso的毒性，通常采用降低冻存液中dmso的含量以及复苏后洗涤离心除去dmso残留这两种办法。但降低dmso含量有可能影响冻存效果，增加冻存中细胞死亡；而通过洗涤离心除去dmso的操作对新复苏细胞的状态会有较大影响，并且可能导致细胞结块或细胞污染，且无法去除细胞内的dmso，残留的细胞内dmso仍然可能影响细胞状态。目前，市场上无dmso的细胞冻存液价格高昂、配方保密。因此，我们希望能为设计一种新型冻存液提供新思路——既不影响dmso在冻存时保护细胞的功能，同时减少复苏冻存细胞时dmso的毒性作用。
技术实现要素：
为了至少解决或部分解决上述问题，提供一种细胞株冻存复苏的保护液及制备方法，该保护液通过在常温条件下快速清除细胞冻存液中残余的二甲基亚砜，消除二甲基亚砜对复苏后细胞株的损伤，可显著提升细胞株冻存后复苏的活性，提高实验的成功率。
为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
本发明一种细胞株冻存复苏的保护液，由含有重组大鼠源性或人源性蛋氨酸亚砜还原酶a0.001％-0.005％；二硫苏糖醇0.0005-0.002％；余量为rpmi-1640培养基组成。
本发明一种细胞株冻存复苏的保护液的制备方法，包括以下步骤：将rpmi-1640培养基按溶液体积每200ml加入0.005g重组人源性蛋氨酸亚砜还原酶a和15mg二硫苏糖醇，得到0.005％的蛋氨酸亚砜还原酶a溶液的保护液。
作为本发明的一种优选技术方案，将配置好的保护液在无菌条件下过滤后分装保存，冻存细胞复苏后，按1:100–1:50比例加入细胞株冻存液和复苏细胞的培养基中。
作为本发明的一种优选技术方案，所述保存的温度为低于负20摄氏度的环境下。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明利用酶清除细胞冻存液内的dmso以保护冻存细胞为改良传统细胞冻存液提供了新思路；通过生物酶技术和科学配方，得到一种安全有效的新型细胞冻存液，使用便捷，价格经济——不仅在医学研究中有重要意义，对临床细胞治疗的安全开展也有重要的价值。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的整体结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
此外，如果已知技术的详细描述对于示出本发明的特征是不必要的，则将其省略。
本发明提供一种细胞株冻存复苏的保护液，由含有重组大鼠源性或人源性蛋氨酸亚砜还原酶a0.001％-0.005％；二硫苏糖醇0.0005-0.002％；余量为rpmi-1640培养基组成。
按上述的组成比例加入到细胞冻存和复苏专用的培养基和血清中，也可以1:100–1:50的比例，加入细胞株冻存液和复苏细胞的培养基中。
需要保存在-20摄氏度的低温条件下。
实施例1：
一种用于细胞株冻存复苏的保护液的配制方法：将rpmi-1640细胞培养基按溶液体积每200ml加入0.005g重组人源性蛋氨酸亚砜还原酶a，15mg二硫苏糖醇，得到0.005％的蛋氨酸亚砜还原酶a溶液。无菌条件下过滤后分装。低温保存。冻存细胞复苏后，按1:100–1:50的比例，加入细胞株冻存液和复苏细胞的培养基中。
观察按照本发明对dmso所致细胞损伤的保护作用。使用cho细胞株作为实验对象，用1％和0.5％的dmso处理细胞株，观察加入细胞保护液和不加入细胞保护液对细胞株活性的影响。
经试验发现，冻存的细胞复苏后加入培养瓶或培养板进行细胞培养，dmso的残余浓度大约在1.5％-3％。如进行离心处理后去除冻存液中残存的dmso，再转入培养瓶培养，dmso的残余浓度会显著降低，大约在0.1％-0.5％。0.5％以上浓度的dmso对部分细胞株会有明显的细胞毒性，0.5％的dmso处理cho细胞株24小时，会降低细胞活性10-20％。1％dmso处理cho细胞株24小时，会降低细胞活性30-40％，如图1所示。本发明可以显著降低dmso引起的细胞活性下降。
发明人发现，蛋氨酸亚砜还原酶a在细胞培养基的浓度为1-10nm时，对dmso引起的细胞损伤呈现出保护效果。
本发明的保护液是一种酶制剂，在细胞冻存的低温状态下，对dmso无任何清除作用，只有在细胞复苏过程和复苏以后，才会清除dmso。该酶制剂不能进入细胞内，对细胞活性无影响。
本发明具备以下三点创新优势：
提高骨髓移植安全性：临床上应用大剂量dmso对造血干细胞进行冻存以保持干细胞活性，应用于骨髓移植术移植术以治疗疾病。目前对于dmso在人体内的毒性尚不明确，并且骨髓移植术远期临床预后不明确，因此存在不可预见的临床风险。如果能够将细胞冻存液内的dmso以酶作用的方式相对温和的分解，则能够排除临床应用dmso对造血干细胞保存的远期预后的不确定性，提高临床治疗安全性甚至改善疾病预后。相比于广泛应用目前市场上无dmso的细胞冻存液,该方法能够极大程度的降低脐带血冻存的成本，为更多的临床患者带来福音。
改良生殖细胞的冻存方式：dmso对生殖细胞用较为明确的毒性，目前临床使用甘油代替dmso对生殖细胞进行冻存，但有多项数据显示dmso作为冷冻保护剂相比于甘油能够明显提高复苏后生殖细胞的活性。因此如果能够在复苏后立即将dmso分解可以减少甚至消除dmso在复苏过程中和复苏后对生殖细胞的毒性，将为更高效的冻存生殖细胞提供新的方法，为临床人工体外受精的成功率提供保障。
改良神经元冻存方式：如前所述，神经元对dmso敏感，而且不含dmso的细胞冻存液价格昂贵。如果能将本项目的改良方案作为神经元课题的冻存方法，即能够保护神经元免受dmso毒性的影响，又能够减少科研成本，更加经济高效。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种细胞株冻存复苏的保护液，其特征在于，由含有重组大鼠源性或人源性蛋氨酸亚砜还原酶a0.001％-0.005％；二硫苏糖醇0.0005-0.002％；余量为rpmi-1640培养基组成。
2.一种细胞株冻存复苏的保护液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将rpmi-1640培养基按溶液体积每200ml加入0.005g重组人源性蛋氨酸亚砜还原酶a和15mg二硫苏糖醇，得到0.005％的蛋氨酸亚砜还原酶a溶液的保护液。
3.根据权利要求2所述的一种细胞株冻存复苏的保护液的制备方法，其特征在于，将配置好的保护液在无菌条件下过滤后分装保存，冻存细胞复苏后，按1:100–1:50比例加入细胞株冻存液和复苏细胞的培养基中。
4.根据权利要求3所述的一种细胞株冻存复苏的保护液的制备方法，其特征在于，所述保存的温度为低于负20摄氏度的环境下。
技术总结