本发明属于生物农业
技术领域：
，具体涉及曲酸在抑制核盘菌生长、治疗和/或预防毛豆菌核病中的应用。
背景技术：
：毛豆(glycinemax)，又叫菜用大豆，是大豆作物中专门鲜食嫩荚的蔬菜用大豆。毛豆起源于中国，在我国约有5000多年的栽培历史，富含植物性蛋白质，维生素b族和膳食纤维等营养物质。然而，由于气候和病害，毛豆在生长和收获期损失显著。核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)是一种真菌，可以侵染400多种植物，危害其茎、叶、果荚，病部表面产生棉絮状菌丝，严重可使全株枯死、腐烂。目前为止，市场上多在发病初期喷40％菌核净可湿性粉剂500倍液，或50％多菌灵可湿性粉剂800倍液等方法治理。但这些方法效果普通，且化学药剂的使用导致的农药残留问题和环境污染问题日益突出。因此，开发有效、安全、环保的杀真菌剂，对于防治毛豆菌核病，推进毛豆产业稳定发展具有重要意义。曲酸是一种有机酸，主要由丝状真菌和曲霉菌、青霉菌和醋杆菌属细菌产生，是最古老的天然抗生素之一。其在化妆品领域、食品加工领域有广泛的应用，但用曲酸防治植物病原真菌的研究仍是空白。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供曲酸的应用，采用曲酸抑制核盘菌生长效果显著，同时可用于相关药物的制备中。曲酸(kojicacid，ka)，5-羟基-2-羟甲基-1,4-吡喃酮，分子式为c6h6o4，结构式如下：本发明经过研究发现，曲酸可抑制植物病原真菌核盘菌的生长，故提出了曲酸在抑制核盘菌生长中的应用。根据应用，本发明提供了一种抑制核盘菌生长的制剂，该制剂的活性成分为曲酸。根据文献(dhjiang,ypfu,gqli,etal.virusesoftheplantpathogenicfungussclerotiniasclerotiorum.advancesinvirusresearch.2013,86:215-248.)的记载，核盘菌可以引起毛豆菌核病，因此，本发明进一步以曲酸作为毛豆菌核病的防治制剂，进行研究。本发明以水为对照，采用50mm曲酸喷洒后接种核盘菌菌饼的毛豆豆荚(预防组)和接种核盘菌菌饼后喷洒50mm曲酸溶液的毛豆豆荚(治疗组)作为试验组，24h后观测核盘菌的生长情况，发现预防组中对照毛豆豆荚接种部位病菌生长较严重，受侵害程度大，经曲酸溶液预防处理后，核盘菌生长受到显著抑制，核盘菌感染程度减轻；治疗组中对照毛豆豆荚接种核盘菌部位出现大面积感染，而经曲酸溶液治疗处理后，核盘菌的生长完全被抑制，说明曲酸可有效治疗菌核病。与现有技术相比，本发明将曲酸应用于抑制核盘菌生长，并提供了一种治疗和/或预防毛豆菌核病的制剂。本发明无需复杂分子操作，制剂中主要活性物质曲酸为天然来源，可以采用生物法生产，且曲酸在毛豆豆荚上会随着时间推移而降解，对环境友好。特别地，用于治疗和/或预防毛豆菌核病的制剂为50mm曲酸溶液，溶剂为水，相对于其他浓度制剂而言，治疗和/或预防效果最佳，且制备方法简单。附图说明图1为实施例1中采用0mm、5mm、10mm、15mm浓度曲酸制备得到的pda培养基培养得到的核盘菌菌落直径柱状图。图2为实施例1中核盘菌在含有0mm、5mm、10mm、15mm的曲酸的pda固体培养基上的生长情况图。图3为实施例2中在ph为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的yepd培养基中，含10mm曲酸和不含曲酸条件下，分生孢子聚集体计数柱状图。图4为实施例3中在有不同络合金属离子(fe2 、ni2 、zn2 、co2 、cu2 )的yepd培养基中，含曲酸和不含曲酸条件下，分生孢子聚集体计数柱状图。图5为实施例4中预防组对照实验和曲酸处理实验得到的毛豆豆荚核盘菌的生长情况图。图6为实施例4中治疗组对照实验和曲酸处理实验得到的毛豆豆荚核盘菌的生长情况图。图7为实施例5中毛豆豆荚中曲酸含量随时间变化折线图。具体实施方式本发明公开了曲酸的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明。实施例1曲酸的抗真菌活性检测菌饼制备：将斜面保存的核盘菌菌株接种于pda固体培养基中，于28℃恒温箱避光培养3天，用直径7mm的打孔器于菌落边缘切取，制备成菌饼备用。pda培养基配方如表1所示，按配方备料，煮沸约30min，待各组分溶解后采用湿热灭菌法于121℃灭菌15min。表1pda培养基配方(1l)试剂质量马铃薯200g葡萄糖20g琼脂粉15g不同浓度的曲酸水溶液1l分别制备含有0mm、5mm、10mm、15mm曲酸的pda培养基，将菌饼接种于pda培养基中心位置，每种浓度设置三组平行。于28℃避光培养，三天后测定各平板中的菌落直径。测定结果如图1所示，图1为含有不同浓度曲酸的pda培养基培养得到的核盘菌菌落直径柱状图。根据图1可以发现浓度为15mm的曲酸水溶液制备的pda培养基培养得到的核盘菌菌落直径最小，说明曲酸水溶液的浓度越高，对核盘菌的抑制效果越明显。观察核盘菌在其中一组浓度为0mm、5mm、10mm、15mm的曲酸水溶液制备pda培养基上的生长情况。结果如图2所示，图2为核盘菌在含有0mm、5mm、10mm、15mm的曲酸的pda固体培养基上的生长情况图。根据该图可以发现随着曲酸水溶液浓度的增加，核盘菌菌落直径越小，说明抑菌效果越好。实施例2不同ph环境下10mm曲酸溶液的抗核盘菌性能核盘菌菌饼制备方法同实施例1。大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基配方如表2所示，备料后于121℃湿热法灭菌1h。表2大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基配方(40ml)试剂质量大麦100mg蜂蜜600mg蛋白胨200mg蒸馏水40ml诱导分生孢子产生并提取：将新鲜的核盘菌菌饼接种于40ml大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基中，28℃，200rpm震荡培养12h后将菌液均分为20份。于4℃以5000rpm离心5min，弃上清，保留菌体。每管加入1ml灭菌水重悬真菌后再次离心弃上清液，此步骤重复两次，得到新鲜分生孢子。将分生孢子分别用1mlph为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的yepd溶液重悬，每个ph梯度设置两瓶，一瓶中加入71.05mg曲酸配置成终浓度为10mm曲酸的yepd液体培养基，另一瓶作为对照组(control)。于28℃，200rpm摇床培养12h后用移液枪吸取0.5μl菌液在显微镜下对分生孢子凝集形成的聚集体进行计数。yepd培养液配方如表3所示，依靠hcl和na2co3调节yepd培养基的ph。表3yepd培养液配方(50ml)试剂质量酵母提取物150mg胰蛋白胨500mg葡萄糖1g蒸馏水50ml计数结果如图3所示，图3为对照组和实验组核盘菌经ph为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0培养后，0.5μl菌液中的分生孢子聚集体计数柱状图。根据图3可以发现，随着ph的增加，分生孢子聚集体的数量减少，当ph为3、4时分生孢子聚集体数量较多，而在碱性条件下核盘菌几乎不生长。此外，在核盘菌能生长的酸性及中性条件下，即ph＝3.0、4.0、5.0、6.0、7.0时，计算曲酸对核盘菌生长的抑制率(抑制率＝(对照组聚集体总数-10mm曲酸组聚集体总数)/对照组聚集体总数)。ph为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0时，抑制率分别为42％、43％、57％、47％和38％，曲酸对核盘菌的生长抑制能力在不同的ph之间的差异不大。说明在核盘菌能生长的ph环境中，曲酸抑制核盘菌生长的能力受ph的影响较小。实施例3不同络合金属离子对曲酸抗核盘菌性能的影响核盘菌菌饼制备方法同实施例1，诱导分生孢子产生并提取同实施例2。将分生孢子分别用50mlph为4.0的yepd溶液重悬，共准备12瓶，两瓶作为对照组，不添加金属离子，fe2 、zn2 、ni2 、co2 、cu2 ，每种金属离子设置2瓶，通过加入fecl2、nicl2、zncl2、cocl2、cucl2控制各金属离子在yepd培养液中的终浓度为1mm。2瓶含同种金属离子的yepd培养液，一瓶中加入71.05mg曲酸配置成终浓度为10mm曲酸的yepd液体培养基，另一瓶作为对照组。置于28℃，200rpm培养12h后用移液枪吸取0.5μl菌液在显微镜下对分生孢子凝集形成的聚集体进行计数。结果如图4所示，图4为在有不同络合金属离子(fe2 、ni2 、zn2 、co2 、cu2 )的yepd培养基中，含曲酸和不含曲酸条件下，分生孢子聚集体计数柱状图。可以发现与无金属离子无曲酸组对比，fe2 、co2 单独存在时聚集体数量无显著差异，cu2 、zn2 和ni2 单独存在时聚集体数量减少。与无金属离子含曲酸组对比，fe2 与曲酸混合后聚集体数量无显著差异，co2 与曲酸混合后聚集体数量增多。说明，fe2 、co2 单独存在时对核盘菌生长无抑制作用，cu2 、zn2 和ni2 单独存在时对核盘菌生长有抑制作用；fe2 与曲酸混合后不改变曲酸的抗菌活性，co2 与曲酸混合后能降低曲酸的抗核盘菌活性。实施例4以曲酸为主要成分的药物对毛豆豆荚菌核病进行预防和治疗。核盘菌菌饼制备方法同实施例1。用纯净水分别配制50ml浓度为10mm、20mm、50mm的曲酸水溶液。取生长状况相似的采后毛豆豆荚，均分用于实验。预防组：分别将上述水溶液均匀喷洒在三组毛豆豆荚上(每组15个)，设置水喷洒为阴性对照。用牙签在豆荚表皮戳一直径约为2mm的小孔，每个孔上用已消毒的镊子接种菌饼，然后放入托盘，用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，三天后观察伤口感染情况。治疗组：用牙签在豆荚表皮戳一直径为7mm的小孔，在孔上用已消毒的镊子接种一核盘菌菌饼，然后放入托盘，用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，48h后去除菌饼。将50mm的曲酸溶液均匀喷洒至毛豆豆荚上，设置同体积水喷洒为阴性对照。24h后观察伤口感染情况。结果如图5、图6示，图5为预防组对照实验和曲酸处理实验得到的毛豆豆荚核盘菌的生长情况图；图6为治疗组对照实验和曲酸处理实验得到的毛豆豆荚核盘菌的生长情况图。由图5可以发现，预防组中，与对照实验(水喷洒)得到的毛豆豆荚相比，曲酸处理实验组毛豆豆荚接种核盘菌的部位伤口颜色更浅，且随着曲酸浓度的增加，伤口颜色越浅，说明曲酸可有效预防菌核病，且曲酸浓度越高，预防效果越好。由图6可以发现，治疗组中，对照实验组(水喷洒)毛豆豆荚接种核盘菌后，菌落侵染范围向接种部位外部扩散，而经50mm曲酸治疗处理后，核盘菌几乎完全不向外扩散，说明曲酸能有效控制病害扩散。实施例5曲酸在毛豆豆荚中的稳定性检测将25个毛豆豆荚于100ml含10mm的曲酸溶液中浸泡30min后取出置于托盘中，室温静置。于第0天、1天、3天、5天、10天，用小刀从5个毛豆豆荚上各切取0.5g，分别置于5个1.5ml离心管中，4℃保存。待所有毛豆豆荚样品准备完成后，每管加入200μl甲醇，涡旋震荡2min，用高效液相色谱仪(hplc)检测曲酸浓度。hplc方法，仪器为agilent1200(california,usa)，采用c18色谱柱(250mm×4.6mm，phenomenex)，紫外检测波长为283nm，以h2o为流动相，流速为1ml/min，洗脱时间为20min，柱温箱60℃。曲酸停留时间为5.9min。采用外标法对曲酸进行定量。结果如图7所示，图7为毛豆豆荚中曲酸含量随时间变化折线图。根据图7可以发现曲酸的浓度随着时间推移逐渐降低，且第十天时无法检测到曲酸存在，说明曲酸会随着时间推移而降解。可降解的特性可以避免曲酸持续存在对植物和环境产生不良影响。本发明的实施例中，单位符号mm为mmol/l，m为mol/l。以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3
技术特征：1.曲酸在抑制核盘菌生长中的应用。
2.一种抑制植物中的核盘菌生长的制剂，其特征在于：所述制剂的活性成分为曲酸。
3.一种治疗和/或预防毛豆菌核病的制剂，其特征在于：所述制剂的主要活性成分为曲酸。
4.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于：所述制剂为曲酸溶液。
5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于：所述曲酸溶液的浓度为50mm。
技术总结本发明公开了曲酸在抑制核盘菌生长中的应用，属于生物农业技术领域。本发明通过研究发现曲酸可抑制核盘菌生长，从而进一步将曲酸应用于治疗和/或预防毛豆菌核病的制剂中。本发明无需复杂分子操作，制剂中主要活性物质曲酸为天然来源，可以采用生物法生产，且曲酸在毛豆豆荚上会随着时间推移而降解，对环境友好。
技术研发人员：拉博德·佩德罗;施欣驰;祝桂洋;王苏妍
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：2020.12.03
技术公布日：2021.03.12
