本发明属于纳米抗菌材料技术领域，具体涉及一种纳米银/度米芬复合抗菌剂及其制备方法与应用。
背景技术：
市场上流通的抗菌剂种类繁多，然而大部分都含有有毒化学试剂，如次氯酸、过氧乙酸、戊二醛等，使用时存在一定的安全隐患。在这样的背景下，天然安全并且具有广谱抗菌性的抗菌剂是市场亟需的。
每一种抗菌剂对不同种类细菌的抗菌效果不同，例如，亲水性抗菌剂对大肠杆菌的抗菌效率较高，亲油性抗菌剂对金黄色葡萄球菌的抗菌率较高。为了发挥广谱抗菌效果，将两种或两种以上的抗菌剂经过通过物理共混或化学反应的手段复配，往往能够发挥这些抗菌剂的所长，从而达到既提高抗菌能力、又降低抗菌剂使用剂量的目的。所以，抗菌剂的协同使用一直是人们关注的热点和方向。
纳米抗菌材料是在无机抗菌材料和纳米材料基础上发展起来的一类新型材料。其中，纳米银具有抗菌性能高效，耐热性好，不易产生抗药性和安全性高等优点，更是抗菌材料领域研究和应用的热点。度米芬(称消毒宁)具有灭菌效果好、用量少和毒副作用低的优点，对革兰氏阳性、阴性细菌及真菌都有杀灭作用，是应用范围广、使用方便、安全有效的广谱型灭菌剂。而纳米银和度米芬联合使用的抗菌剂，还未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种纳米银/度米芬复合抗菌剂的制备方法，步骤简单。
本发明的目的之二是提供上述方法制备的复合抗菌剂，在较低的用量下具有较好的抗菌效果。
本发明的目的之三是提供上述复合抗菌剂在卫生抗菌制品方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种纳米银/度米芬复合抗菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别称取一定量的硝酸银以及艾叶提取物，并溶于水中，在95～100℃条件下水浴搅拌30～60min，制备得到一定浓度的纳米银溶液，并将其避光干燥保存备用；
(2)称取一定量的度米芬，并溶于水中，配制成一定浓度的度米芬溶液，并将其避光干燥保存备用；
(3)将步骤(1)得到的纳米银溶液和步骤(2)得到的度米芬溶液按比例混合，即得到纳米银/度米芬复合抗菌剂。
优选的，步骤(1)中硝酸银浓度为1.5～1.8mg/ml，艾叶提取物浓度为1～3mg/ml。
优选的，步骤(3)中所述纳米银溶液的浓度不低于0.5ppm，所述度米芬溶液的浓度不低于1ppm。
优选的，步骤(3)中所述纳米银溶液与度米芬溶液的体积比为1～99：99～1。
本发明还提供由上述制备方法制备得到的复合抗菌剂。
本发明还提供上述复合抗菌剂在卫生抗菌制品方面的应用。
本发明制备的复合抗菌剂对鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌均具有显著的抗菌效果，在较低用量的情况下即可实现良好的抗菌效果；且由于用量减少，纳米银、度米芬的毒副作用大大降低，该复合抗菌剂可以用于卫生抗菌制品。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明将纳米银与度米芬联合用药具有协同抗菌作用，相比于单独用药，大大减少了药物剂量，同时也减少了药物的毒副作用；
2.本发明制备的复合抗菌剂对鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌均具有显著的抗菌效果，在较低用量的情况下即可实现良好的抗菌效果。
附图说明
图1为纳米银及度米芬抑菌环试验结果：生理盐水control组及60ppm纳米银组对(a)金黄色葡萄球菌、(b)大肠杆菌及(c)鲍曼不动杆菌的抑菌环试验结果。生理盐水control组及60ppm度米芬组对(d)金黄色葡萄球菌、(e)大肠杆菌及(f)鲍曼不动杆菌的抑菌环试验结果。右向箭头指示的为60ppm抗菌剂组，左向箭头指示的为生理盐水对照组。
图2为control组及不同浓度纳米银组对(a)鲍曼不动杆菌、(b)金黄色葡萄球菌、(c)大肠杆菌及(d)白色念珠菌的mic试验结果。
图3为control组及不同浓度度米芬组对(a)鲍曼不动杆菌、(b)金黄色葡萄球菌、(c)大肠杆菌及(d)白色念珠菌的mic试验结果。
图4为control组及不同浓度纳米银组对(a)鲍曼不动杆菌、(b)金黄色葡萄球菌、(c)大肠杆菌及(d)白色念珠菌的mbc试验结果。
图5为control组及不同浓度度米芬组对(a)鲍曼不动杆菌、(b)金黄色葡萄球菌、(c)大肠杆菌及(d)白色念珠菌的mbc试验结果。
图6为control组及不同浓度纳米银组对(a)鲍曼不动杆菌、(c)金黄色葡萄球菌、(e)大肠杆菌及(g)白色念珠菌的生物膜活性抑制结果。
图7为control组及不同浓度度米芬组对(b)鲍曼不动杆菌、(d)金黄色葡萄球菌、(f)大肠杆菌及(h)白色念珠菌的生物膜活性抑制结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
以下实施例中所使用的原料和试剂如无特殊说明，均为市售商品。
实施例1：制备纳米银和度米芬溶液
1.1纳米银溶液的制备：称取硝酸银8.5mg及艾叶提取物10mg，溶解于5ml蒸馏水中，100℃沸水水浴40min，制备得到1000ppm的纳米银溶液，并将其避光干燥保存备用。
采用化学还原法，艾草提取物作为还原剂，将制备得到的1000ppm纳米银溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，粒径仪测得粒径为100nm左右。
1.2度米芬溶液的配制：称取10mg度米芬，将其倒入10ml容量瓶中，蒸馏水定容，配制成浓度为1000ppm的度米芬溶液，并将其避光干燥保存备用。
实施例2：纳米银和度米芬联合使用的抗菌性能测试
2.1抑菌环试验
利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。试验通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。
1)抑菌片的制备：取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加不同浓度纳米银/度米芬溶液20μl，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置温箱(37℃)中烤干，或置室温下自然干燥后备用。
直径为5mm，厚不超过4mm圆片，每4片一组。
2)阴性对照样片的制备：取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水20μl，干燥后备用。
阴性对照样本，应取同种材质不含纳米银的样品，制成与试验组大小相同的样片。
3)试验菌的接种：用无菌棉拭子蘸取浓度为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml鲍曼不动杆菌菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5min。
4)抗菌剂样片贴放：每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片，1片阴性对照样片，共5片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置37℃温箱，培养16h～18h观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片)并记录。
测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。
抑菌环直径大于7mm者，判为有抑菌作用；抑菌环直径小于或等于7mm者，判为无抑菌作用；阴性对照组应无抑菌环产生，否则试验无效。
纳米银对金色葡萄球菌(atcc6538)、大肠杆菌(8099)、鲍曼不动杆菌(atcc19606)的mic试验以及度米芬对以上三个菌的mic试验步骤同上。
表1纳米银及度米芬抑菌环直径
由图1可以看出，与control组相比，60ppm纳米银组对金黄色葡萄球菌(atcc6538)、大肠杆菌(8099)、鲍曼不动杆菌(atcc19606)的抑菌环显著增大，这表明60ppm纳米银对金黄色葡萄球菌(atcc6538)、大肠杆菌(8099)、鲍曼不动杆菌(atcc19606)的抑菌效果明显；此外，与control组相比，60ppm度米芬组对金黄色葡萄球菌(atcc6538)、大肠杆菌(8099)、鲍曼不动杆菌(atcc19606)的抑菌环较大，这表明60ppm度米芬对金黄色葡萄球菌(atcc6538)、大肠杆菌(8099)、鲍曼不动杆菌(atcc19606)的抑菌效果显著。
抑菌环直径测量结果见表1，可知60ppm纳米银组对金黄色葡萄球菌(atcc6538)、大肠杆菌(8099)、鲍曼不动杆菌(atcc19606)的抑菌环直径分别为19±2mm、16±1mm、13±1mm；60ppm度米芬组对金黄色葡萄球菌(atcc6538)、大肠杆菌(8099)、鲍曼不动杆菌(atcc19606)的抑菌环直径分别为12±3mm、10±3mm、11±3mm。
以上实验结果表明，纳米银及度米芬对金黄色葡萄球菌(atcc6538)、大肠杆菌(8099)、鲍曼不动杆菌(atcc19606)等常见致病菌均能起到良好的抗菌效果。
2.2单药药敏试验
根据临床和实验室标准协会(clsi)所制定方法测定纳米银的最小抑菌浓度(mic)，具体步骤如下：
(1)制备0.5麦氏比浊(菌浓度约为1×108cfu/ml)的鲍曼不动杆菌(atcc19606)菌液，用无菌蒸馏水稀释100倍(菌悬液浓度约为1×106cfu/ml)；
(2)准备7支灭菌试管并编号，1号管加入mueller-hinton肉汤培养基(mhb)4ml，2-7号试管等量加入mhb1ml，1号管中加入64μl1000ppm的纳米银溶液，震荡混匀后从1号试管取1ml加入到2号试管，按此方法倍比稀释至6号试管，6号管吸取1ml弃去，此时1-7号管纳米银浓度为32、16、8、4、2、1、0ppm，7号试管为阴性对照管；
(3)在上述7支试管中分别加入50μl菌液，放入37℃恒温培养箱中培育24h；
(4)比较各试管中液体浑浊情况，无细菌生长(明显清澈)的最低纳米银浓度即为纳米银作用于鲍曼不动杆菌的mic；
纳米银对金色葡萄球菌(atcc6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌(atcc10231)的mic试验以及度米芬对以上四种受试菌的mic试验步骤同上。
由微量稀释法分别测定纳米银和度米芬对鲍曼不动杆菌(atcc19606)、金黄色葡萄球菌(atcc6538)、大肠杆菌(8099)和白色念珠菌(atcc10231)的mic结果依据clsi标准判读，均在质控范围内。
如图2a所示，鲍曼不动杆菌菌液在不加入纳米银时呈浑浊状态，在纳米银溶液浓度为2ppm或以上时，鲍曼不动杆菌菌液明显清澈，由此可以看出，无细菌生长(明显清澈)的最低纳米银浓度2ppm即为纳米银作用于鲍曼不动杆菌的mic；以此方法类推，如图2b-2d所示，纳米银作用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的mic分别为2ppm、2ppm和4ppm；如图3a-3d所示，度米芬作用于鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的mic分别为2ppm、4ppm、8ppm和4ppm。
2.2联合药敏试验
利用微量棋盘稀释法测定纳米银和度米芬联合用药的协同mic，具体步骤如下：
(1)制备0.5麦氏比浊(菌浓度约为1×108cfu/ml)的鲍曼不动杆菌菌液，用蒸馏水稀释100倍；
(2)纳米银和度米芬最高从8倍mic浓度开始用无菌mhb倍比稀释，取6个稀释度，各取50μl分别排列在无菌96孔板的行与列上，然后在无菌96孔板中加入100μl菌液，使最终细菌接种量为5×105cfu/ml，最终药物浓度为2倍mic，放入37℃恒温培育箱中培育24h；
(3)无细菌生长(明显清澈)的最低药物浓度为mic’；
(4)通过计算部分抑菌浓度指数
fic≤0.5、0.5<fic≤1、1<fic<2、2≤fic时分别表示协同、相加、无关、拮抗作用。
金色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的协同mic试验步骤同上。
表2纳米银及度米芬联合药敏试验
采用棋盘微量稀释法测定了纳米银和度米芬在不同浓度下，对四株菌的联合药敏试验，以fic判断结果表现为协同、相加、拮抗及无关四种效应，具体数据如表2所示。
由表2可知，纳米银和度米芬联合使用时，对以上四种菌都有协同作用(fic≤0.5)，尤其对金色葡萄球菌(atcc6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌(atcc10231)的协同杀灭作用效果更为突出。以上结果表明，纳米银和度米芬联合应用时，对鲍曼不动杆菌(atcc19606)、金黄色葡萄球菌(atcc6538)、大肠杆菌(8099)和白色念珠菌(atcc10231)的抗菌效果具有协同作用，可增强抗菌药物发挥更强的效力，不仅减少药物剂量，也可减少药物的毒副作用。
2.3最小杀菌浓度试验(mbc)
(1)制备0.5麦氏比浊(菌悬液浓度约为1×108cfu/ml)的鲍曼不动杆菌(atcc19606)菌液，用无菌蒸馏水稀释100倍(菌悬液浓度约为1×106cfu/ml)；
(2)根据细菌的mic设置本试验药物浓度，准备8支灭菌试管并编号，1号管加入mueller-hinton肉汤培养基(mhb)2ml，2-8号试管等量加入mhb1ml，1号管中加入适量1000ppm的纳米银溶液；
(3)震荡混匀后从1号试管取1ml加入到2号试管，按此方法倍比稀释至6号试管，7号管吸取1ml弃去，此时1-8号管纳米银浓度为64mic、32mic、16mic、8mic、4mic、2mic、mic、0ppm，放入37℃恒温培育箱中培育18h～24h；
(4)18h～24h后，使用无菌棉签蘸取适量试管内溶液，均匀涂抹在含tsa培养基的培养皿上，放入37℃恒温培育箱中培育18～24h；
(5)18h～24h后，观察代表不同药物浓度的培养皿中的菌落数，以小于5个菌落的最小浓度作为mbc。
纳米银对金色葡萄球菌(atcc6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌(atcc10231)的mbc试验以及度米芬对以上四个菌的mbc试验步骤同上。
将大于mic的试管内溶液均匀涂抹在含tsa培养基的培养皿上，孵育24h后，得到试验结果如图4、图5，菌落数小于5个或无菌落生长的最小浓度为mbc。
如图4a所示，control组有大量鲍曼不动杆菌生长，与control组相比，8ppm纳米银处理组处理的培养皿无菌落生长，因此，纳米银对鲍曼不动杆菌的mbc为8ppm；以此方法类推，如图4b-4d所示，纳米银作用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的mbc分别为32ppm、32ppm和32ppm；如图5a-5d所示，度米芬作用于鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的mbc分别为8ppm、16ppm、256ppm和512ppm。
由此可以看出，纳米银和度米芬均可对鲍曼不动杆菌产生很好的杀灭效果，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的杀灭效果次之。
2.4纳米银联合度米芬的抗生物膜形成机制
2.4.1生物被膜根除浓度-2试验(bec-2)
生物被膜根除浓度-2：导致生物被膜代谢活性降低2倍的化合物的最小浓度。
(1)制备0.5麦氏比浊(菌悬液浓度约为1×108cfu/ml)的鲍曼不动杆菌菌液，用mhb稀释100倍(菌悬液浓度约为1×106cfu/ml)；
(2)在无菌96孔板实验孔中加入100μl鲍曼不动杆菌稀释菌液，放入37℃恒温培育箱培育1h，使生物被膜黏附在孔中；
(3)吸除菌液，并用pbs清洗除去浮游菌；
(4)纳米银最高从4倍mic浓度开始用无菌mhb倍比稀释，取7-9个稀释度，按照从小到大的药物浓度依次加入100μl于无菌96孔板中，放入37℃恒温培育箱培育18h～24h；
(5)吸除纳米银溶液，pbs清洗除去残留纳米银溶液，加入100μl甲醇固定15min；
(6)吸除甲醇，晾干，结晶紫染色10min；
(7)吸除结晶紫溶液，pbs清洗3遍；
(8)酶标仪595nm测定od值，小于阴性对照列od值的1/2的最小纳米银浓度即纳米银作用于鲍曼不动杆菌的bec-2；
纳米银对金色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的bec-2试验以及度米芬对以上四个菌的bec-2试验步骤同上。
如图6a所示，与control组相比，1mic及以下浓度的纳米银处理组生物膜活性几乎不发生变化，而2mic及以上浓度的纳米银处理组生物膜活性明显下降到50％以下，由此可以看出，纳米银对鲍曼不动杆菌的bec-2(导致生物被膜代谢活性降低2倍的化合物的最小浓度)为2mic；以此方法类推，如图6c、6e、6g所示，纳米银对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的bec-2分别为2mic、1/4mic、1mic；如图7b、7d、7f、7h所示，度米芬对鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的bec-2分别为2mic、1/2mic、1mic和1mic。
2.4.2联合用药bec-2
为了确定纳米银与度米芬之间对生物被膜代谢活性影响的协同相互作用，在参考文献的基础上，对试验方法进行改进。
(1)制备0.5麦氏比浊(菌悬液浓度约为1×108cfu/ml)的鲍曼不动杆菌菌液，用mhb稀释100倍(菌悬液浓度约为1×106cfu/ml)；
(2)在无菌96孔板中加入100μl鲍曼不动杆菌稀释菌液，放入37℃恒温培育箱培育1h，使生物被膜黏附在孔底；
(3)吸除菌液，并用pbs清洗除去浮游菌；
(4)纳米银和度米芬最高从4倍bec-2浓度开始用无菌mhb倍比稀释，取6个稀释度，各取50μl分别排列在无菌96孔板的行与列上，放入37℃恒温培育箱培育24h；
(5)吸除纳米银溶液，pbs清洗除去残留纳米银溶液，加入100μl甲醇固定15min；
(6)吸除甲醇，晾干，结晶紫染色10min；
(7)吸除结晶紫溶液，pbs清洗3遍；
(8)酶标仪595nm测定od值，小于阴性对照列od值的1/2的最小纳米银浓度即纳米银作用于鲍曼不动杆菌的bec-2记作药物作用于鲍曼不动杆菌的bec-2’；
(9)通过计算部分抑菌浓度指数
fic≤0.5、0.5<fic≤1、1<fic<2、2≤fic时分别表示协同、相加、无关、拮抗作用；
金色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的协同bec-2协同试验步骤同上。
表3纳米银及度米芬抑制生物被膜代谢活性
由表3可知，纳米银和度米芬联合使用时，对以上四种菌的生物被膜都有协同抑制作用，尤其对鲍曼不动杆菌(atcc19606)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌(atcc10231)的生物被膜协同抑制作用效果突出。
实施例3：纳米银/度米芬复合抗菌剂
将实施例1制得的纳米银溶液稀释到0.5ppm，将度米芬溶液稀释到1ppm，然后将纳米银溶液与度米芬溶液按体积比1～99：99～1进行混合，即得到纳米银/度米芬复合抗菌剂。在此浓度下，该复合抗菌剂对鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌均具有显著的抗菌效果。
1.一种纳米银/度米芬复合抗菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别称取一定量的硝酸银以及艾叶提取物，并溶于水中，在95～100℃条件下水浴搅拌30～60min，制备得到一定浓度的纳米银溶液，并将其避光干燥保存备用；
(2)称取一定量的度米芬，并溶于水中，配制成一定浓度的度米芬溶液，并将其避光干燥保存备用；
(3)将步骤(1)得到的纳米银溶液和步骤(2)得到的度米芬溶液按比例混合，即得到纳米银/度米芬复合抗菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种纳米银/度米芬复合抗菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中硝酸银浓度为1.5～1.8mg/ml，艾叶提取物浓度为1～3mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种纳米银/度米芬复合抗菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述纳米银溶液的浓度不低于0.5ppm，所述度米芬溶液的浓度不低于1ppm。
4.根据权利要求1所述的制备方法制备得到的复合抗菌剂。
5.权利要求4所述的复合抗菌剂在制备卫生抗菌制品方面的应用。
技术总结