本发明涉及一种防治棉花枯黄萎病的组合物及制备方法和应用，具体涉及一种生物防治棉花枯黄萎病的组合物及制备方法和应用。
背景技术：
中国是世界主要的棉花产区之一，而作为棉花第一大病害，被称为棉花的“癌症”的棉花枯黄萎病的发生，大大的限制了中国棉花产量的提高。棉花枯黄萎病在主要植棉区均有发生，其中，北方棉区更重于长江流域棉区。在中国，棉花黄萎病是由棉花黄萎病病原菌——大丽轮枝菌引起、发生在棉花茎、枝、叶的病害。如何通过无污染的预防和控制，称为棉花保质增收需要研究的重要课题。
cn101747117a公开了一种转基因抗虫棉用抗棉花枯黄萎病、红叶茎枯病及害虫的埋施药肥，所述埋施药肥的主要成分为：3%克百威颗粒剂1.92～1.99%、枯饼48.10～49.40%、新克黄枯液剂0.37～0.39%、锌硼钾钙氨基酸液剂0.20～0.22%、尿素20.64～23.25%、磷酸一铵9.00～9.45%、氯化钾15.20～16.80%。但是，其中使用的百威颗粒剂和新克黄枯叶剂仍然属于农药范畴，不仅不满足无污染防治棉花枯黄萎病的需求，还会对土壤中的有益菌造成破坏。
cn101486916a公开了一种抗棉花枯黄萎病土壤修复剂及其制备方法，所述抗棉花枯黄萎病土壤修复剂的原料重量份为：黄腐植酸50至200份，腐植酸铵50至150份，腐植酸钾50至200份，敌磺钠2至10份，多菌灵10至20份，微量元素20至50份，重过磷酸钙100至200份，尿素50至200份，膨润土100至200份。但是，其中使用的敌磺钠和多菌灵仍然属于农药范畴，不仅不满足无污染防治棉花枯黄萎病的需求，还会对土壤中的有益菌造成破坏。
综上，由于棉花枯黄萎病传播途径多，包括患病的植株，种子，肥料等，除了需要在种植棉花的当季避免棉花枯黄萎病，还需要通过改良土壤抑制棉花枯黄萎病在后续种植中的传播和发生。因此，亟待找到一种能根除棉花枯黄萎病发生，增加产量，且能提高土壤有机质、培肥地力，环保绿色，成本低，实现土壤永续利用的生物防治棉花枯黄萎病的组合物及制备方法和应用。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种能根除棉花枯黄萎病发生，增加产量，且能提高土壤有机质、培肥地力，环保绿色，成本低，实现土壤永续利用的生物防治棉花枯黄萎病的组合物。
本发明进一步要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种简单，适宜于农业化生产的生物防治棉花枯黄萎病的制备方法和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种生物防治棉花枯黄萎病的组合物，主要包括以下组分：烟叶提取物、刺儿菜提取物、坚强芽孢杆菌制剂、淡紫拟青霉制剂、疮痂链霉菌制剂、γ-氨基丁酸和有机物料。烟叶提取物中含有的硫酸烟碱、毒藤碱、原烟碱等对大丽轮枝菌等病菌具有较强的杀灭和抑制作用，但是对作物无药害。而刺儿菜提取物中的主要成分黄酮类化合物，如芸香甙、蒙花甙等，环己烷和挥发油成分均对大丽轮枝菌等病菌也具有较强的杀灭和抑制作用，且可弥补烟叶提取物在温度和病菌药物抗性上的缺点，协同杀菌效果好，还可降低烟叶提取物的用量，降低成本并避免其在植物中的残留。坚强芽孢杆菌制剂除了能抑制棉花根结线虫病发病外，对造成棉花枯黄萎病的大丽轮枝菌菌丝的生长有较强的抑制作用，且明显优于地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，还具有耐热和抗逆性，对环境的适应性强。所述淡紫拟青霉在本发明组合物中的作用为：淡紫拟青霉是根结线虫与白色胞囊线虫卵的有效寄生菌，对多种线虫都有防治效能，其寄主有根结线虫、胞囊线虫、金色线虫、异皮线虫，是防治土壤中根结线虫的生防制剂，同时，本发明人研究发现，淡紫拟青霉繁殖过程中会产生一种脂肽类抗生素，具有抗细菌、抗真菌、抗锥形虫等生物活性，特别是能杀死大丽轮枝菌菌丝细胞、抑制孢子囊的形成和抑制孢子囊及孢子的萌发，将其应用于棉花种植过程中，除了可避免根结线虫危害导致降低棉花的产量和品质外，还可协同坚强芽孢杆菌防治棉花枯黄萎病病菌。所述疮痂链霉菌在本发明组合物中的作用为：马铃薯疮痂病（potatoscab）是由致病性细菌引起的较难防治的植物土传病害，被列为进出口检疫对象，若人们种植马铃薯后继续种植棉花，由于疮痂病菌的存在，土传病害同样影响棉花的健康生长和品质，疮痂链霉菌植入土壤能有效杀灭疮痂病，同时，本发明人研究发现，疮痂链霉菌繁殖过程中也会产生抗生素，这种抗生素能抑制棉花枯黄萎病菌丝和分生孢子生长，将其应用到棉花种植过程中，除了可防治疮痂病之外，还可协同防治棉花枯黄萎病病菌。本发明组合物通过组合使用坚强芽孢杆菌制剂、淡紫拟青霉和疮痂链霉菌，协同解决棉花种植过程中因枯黄萎病影响棉花产量和品质的问题：采用坚强芽孢杆菌特性产生的活性酶以及淡紫拟青霉和疮痂链霉菌产生的抗生素，协同实现抑制、拮抗、杀灭棉花枯黄萎病霉菌菌株的目的，同时也解决了由于长期耕作，化肥的过度使用，使得土壤根结线虫病发生严重的问题，还能避免因种植块根作物后产生的土传病害疮痂病，通过植入土壤优势菌株，达到占位目的，抑制了其它病菌的发生，优势菌种的大量繁殖和新陈代谢，培肥了地力，最终提高了棉花的产量，实现土壤的永续利用。
优选地，所述生物防治棉花枯黄萎病的组合物各组分的重量份为：烟叶提取物1.0～2.0份、刺儿菜提取物1.0～4.0份、坚强芽孢杆菌制剂0.5～1.5份、淡紫拟青霉制剂1.0～3.0份、疮痂链霉菌制剂0.5～1.5份、γ-氨基丁酸2.0～3.5份和有机物料85～94份。
优选地，所述烟叶提取物的制备方法为：将干燥的烟叶粉碎后，加入水中，调节ph值后，加热浸出，过滤，滤液浓缩，得烟叶提取物。
优选地，所述干燥的烟叶与水的质量比为1:10～15。在所述比例下更有利于烟叶的浸润和提取，且降低后续浓缩的能耗。
优选地，所述粉碎至过10目筛。
优选地，所述调节ph值至10～12。
优选地，所述加热浸出的温度为40～60℃，时间为1～2h。在所述条件下更利于烟叶中有助于杀虫抗菌的烟碱等物质的浸出，同时兼顾生产效率。
优选地，所述滤液浓缩至含水率≤30%。
优选地，所述刺儿菜提取物的制备方法为：将干燥的刺儿菜粉碎后，加入乙醇溶液中，超声加热浸出，过滤，滤液浓缩，得刺儿菜提取物。
优选地，所述干燥的刺儿菜与乙醇溶液的质量体积比（g/ml）为1:5～10。
优选地，所述乙醇溶液的体积分数为10～95%（更优选40～80%）。
优选地，所述粉碎至过10目筛。
优选地，所述超声加热浸出的温度为50～70℃，超声的频率为30～50khz，时间为10～20min。在所述条件下更利于刺儿菜中有助于杀虫抗菌的黄酮类等物质的浸出，同时兼顾生产效率。
优选地，所述滤液浓缩至含水率≤15%。
优选地，所述坚强芽孢杆菌制剂的活菌数为1.0×107～2.0×1010个/g。
优选地，所述淡紫拟青霉制剂的活菌数为1.0×107～2.0×1010个/g。
优选地，所述疮痂链霉菌制剂的活菌数为1.0×107～1.0×1010个/g。
优选地，所述有机物料为棉籽饼、豆粕、油枯、酒糟、发酵腐熟粪便、味精发酵废料或酵母发酵废料等中的一种或几种。所述有机物料均是植物提取物和微生物菌的载体，微生物施入土壤中有利于生长和繁殖，同时直接补充土壤有机质，所述有机物料与微生物功能菌产生协调和互补达到最佳的应用效果。所述有机物料均为就地取材或市购。
本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种生物防治棉花枯黄萎病的组合物的制备方法，先将坚强芽孢杆菌制剂、淡紫拟青霉制剂、疮痂链霉菌制剂、γ-氨基丁酸和有机物料进行一次搅拌混合后，发酵，再加入烟叶提取物和刺儿菜提取物进行二次搅拌混合，即成。
优选地，所述搅拌的转速均为30～50r/min。
优选地，所述一次搅拌混合的时间为20～30min。
优选地，所述发酵的温度为50～58℃，含水量为50～60%，时间为48～72h。发酵不仅可以促进微生物菌剂的存活和繁殖，而且还可以杀灭有害菌，特别是有可能从有机肥料中携带的棉花枯黄萎病菌。当原料含水率达不到所述指标时，可以补水实现。
优选地，所述二次搅拌混合的时间为10～20min。
本发明更进一步解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种生物防治棉花枯黄萎病的组合物的应用，将所述生物防治棉花枯黄萎病的组合物，按照50～100kg/亩撒施于土壤表面，翻地、整地后，进行棉花播种以及常规管理。
优选地，棉花种植的密度为10000～14000株/亩。
本发明的有益效果如下：
（1）施用本发明生物防治棉花枯黄萎病的组合物后，利用微生态原理中微生物间的竞争及拮抗理论，通过选育并向棉花根圈施入拮抗性微生物，能产生抗生素，且能在棉花根际土壤和根内定植的特殊拮抗性放线菌上抑制棉花枯黄萎病生长，可从根本上抑制棉花枯黄萎病生长繁殖，防止棉花枯黄萎病发生，解决化学农药不能解决的棉花枯黄萎病的防治难题；且通过有机物料的施入，可改善土壤的物理或化学性质，提高土壤有机质，培肥地力，实现土壤永续利用，且环保绿色，成本低；枯黄萎病发生率低至2.3%，枯黄萎病发生率比未施用药剂的减少14.3%以上，比施用传统药剂的减少7.5%以上，同时，亩增产率最高达76.5%，亩净增收益高达1038.2元；
（2）本发明制备方法简单，本发明生物防治棉花枯黄萎病的组合物适宜于农业化生产，可广泛应用于不同种类、不同地区棉花生长期的枯黄萎病防治。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的坚强芽孢杆菌制剂购于江西顺泉生物科技有限公司，淡紫拟青霉制剂均购于湖北启明生物工程有限公司，疮痂链霉菌制剂购于上海一研生物科技有限公司；本发明实施例所使用的棉籽饼和发酵腐熟粪便来源于种植户，豆粕、油枯、酒糟、味精发酵废料和酵母发酵废料为当地购买；本发明实施例所使用的原料、供试棉花品种种子或育苗，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
烟叶提取物的制备方法参考例1
将1重量份干燥的烟叶粉碎至过10目筛后，加入12重量份的水中，调节ph值至11后，在50℃下，加热浸出1.5h，过滤，滤液浓缩至含水率为25%，得烟叶提取物1。
烟叶提取物的制备方法参考例2
将1重量份干燥的烟叶粉碎至过10目筛后，加入10重量份的水中，调节ph值至12后，在40℃下，加热浸出2.0h，过滤，滤液浓缩至含水率为20%，得烟叶提取物2。
烟叶提取物的制备方法参考例3
将1重量份干燥的烟叶粉碎至过10目筛后，加入15重量份的水中，调节ph值至10后，在60℃下，加热浸出1.0h，过滤，滤液浓缩至含水率为30%，得烟叶提取物3。
刺儿菜提取物的制备方法参考例1
将1重量份（g）干燥的刺儿菜粉碎至过10目筛后，加入8体积（ml）的乙醇溶液（体积分数为50%）中，在60℃、频率为40khz下，超声加热浸出15min，过滤，滤液浓缩至含水率为12%，得刺儿菜提取物1。
刺儿菜提取物的制备方法参考例2
将1重量份（g）干燥的刺儿菜粉碎至过10目筛后，加入5体积（ml）的乙醇溶液（体积分数为60%）中，在50℃、频率为50khz下，超声加热浸出20min，过滤，滤液浓缩至含水率为15%，得刺儿菜提取物2。
刺儿菜提取物的制备方法参考例3
将1重量份（g）干燥的刺儿菜粉碎至过10目筛后，加入10体积（ml）的乙醇溶液（体积分数为40%）中，在70℃、频率为30khz下，超声加热浸出10min，过滤，滤液浓缩至含水率为10%，得刺儿菜提取物3。
一种生物防治棉花枯黄萎病的组合物实施例1～3
一种生物防治棉花枯黄萎病的组合物实施例1～3各组分及重量份，如表1所示。
表1一种生物防治棉花枯黄萎病的组合物实施例1～3各组分及重量份表
注：表中“-”表示未添加。
一种生物防治棉花枯黄萎病的组合物的制备方法实施例1
按照表1实施例1各组分及重量份，先将所述坚强芽孢杆菌制剂、淡紫拟青霉制剂、疮痂链霉菌制剂、γ-氨基丁酸和有机物料，以40r/min转速进行一次搅拌混合25min后，在56℃，含水率为55%下，发酵60h，再加入烟叶提取物和刺儿菜提取物，以40r/min转速进行二次搅拌混合15min，得生物防治棉花枯黄萎病的组合物1。
一种生物防治棉花枯黄萎病的组合物的制备方法实施例2
按照表1实施例2各组分及重量份，先将所述坚强芽孢杆菌制剂、淡紫拟青霉制剂、疮痂链霉菌制剂、γ-氨基丁酸和有机物料，以30r/min转速进行一次搅拌混合30min后，在52℃，含水率为60%下，发酵70h，再加入烟叶提取物和刺儿菜提取物，以30r/min转速进行二次搅拌混合20min，得生物防治棉花枯黄萎病的组合物2。
一种生物防治棉花枯黄萎病的组合物的制备方法实施例3
按照表1实施例3各组分及重量份，先将所述坚强芽孢杆菌制剂、淡紫拟青霉制剂、疮痂链霉菌制剂、γ-氨基丁酸和有机物料，以50r/min转速进行一次搅拌混合20min后，在58℃，含水率为50%下，发酵50h，再加入烟叶提取物和刺儿菜提取物，以50r/min转速进行二次搅拌混合10min，得生物防治棉花枯黄萎病的组合物3。
一种生物防治棉花枯黄萎病的组合物的应用实施例1
实验区设在乌苏市百泉镇白杨树村农户张某家（面积50亩，实施例1、对比例1、2），土壤为盐渍化土，肥力一般，管理水平高；大田种植时间为2019年4月19日；供试棉花品种：新陆早67号。
将实施例1所述生物防治棉花枯黄萎病的组合物，按照80kg/亩撒施于土壤表面，翻地、整地后，进行棉花播种以及常规管理，棉花种植的密度为12000株/亩。
一种生物防治棉花枯黄萎病的组合物的应用实施例2
实验区设在伽师县英买里乡英阿瓦提村李某家（面积70亩，实施例2），土壤为盐渍化土壤，肥力一般，管理水平高；大田种植时间为2018年4月8日；供试棉花品种：中棉47。
将实施例2所述生物防治棉花枯黄萎病的组合物，按照60kg/亩撒施于土壤表面，翻地、整地后，进行棉花播种以及常规管理，棉花种植的密度为12000株/亩。
一种生物防治棉花枯黄萎病的组合物的应用实施例3
实验区设在沙湾县大泉镇西村王某家（面积200亩，实施例3），土壤为沙壤土，肥力一般，管理水平高；大田种植时间为2018年4月10日；供试棉花品种：新陆中16。
将实施例3所述生物防治棉花枯黄萎病的组合物，按照100kg/亩撒施于土壤表面，翻地、整地后，进行棉花播种以及常规管理，棉花种植的密度为12000株/亩。
对比例1
撒施底肥：磷酸二铵25kg、硫酸钾5kg，翻地、整地后，进行棉花播种以及常规管理，棉花种植的密度为12000株/亩。
对比例2
撒施底肥：磷酸二铵25kg、硫酸钾5kg，翻地、整地后，进行棉花播种以及常规管理，棉花种植的密度为12000株/亩；将高锰酸钾800倍液与50%敌克松800倍液，按照1:2混溶后，在棉花3～5片真叶期，每亩喷施60kg，以防治棉花枯黄萎病。
对本发明生物防治棉花枯黄萎病的组合物应用实施例1～3以及对比例1、2中棉花的生育期长势和经济性状进行评价，结果分别如表2、3所示。
表2应用实施例1～3和对比例1、2中棉花的生育期长势对比表
由表2可知，施用了本发明生物防治棉花枯黄萎病的组合物后，能增强植株抗病力，提高棉花的各种抗逆性，棉花枯黄萎病发生率低至2.3%，棉花枯黄萎病发生率比未施用药剂的减少14.3%以上，比施用传统药剂的减少7.5%以上。
表3应用实施例1～3和对比例1、2中棉花的经济性状对比表
注：表中“增产率”均以对比例1的产量为基准计算，“-”表示未计算。
由表3可知，施用了本发明生物防治棉花枯黄萎病的组合物后，能平衡土壤养分的供给，改善土壤理化状况，增加棉花品质，亩产籽棉可高达421.3kg，对比例亩产最高仅为279.8kg，最多可增产182.6kg，增产率可高达76.5%；按照2018年籽棉平均市价7元/kg，平均每亩增收1278.2元，减去施用的本发明生物防治棉花枯黄萎病的组合物的成本80kg*3元/kg=240元，亩净增收益可高达1038.2元，投入产出比1:4.3。
1.一种生物防治棉花枯黄萎病的组合物，其特征在于，主要包括以下组分：烟叶提取物、刺儿菜提取物、坚强芽孢杆菌制剂、淡紫拟青霉制剂、疮痂链霉菌制剂、γ-氨基丁酸和有机物料。
2.根据权利要求1所述生物防治棉花枯黄萎病的组合物，其特征在于，所述各组分的重量份为：烟叶提取物1.0～2.0份、刺儿菜提取物1.0～4.0份、坚强芽孢杆菌制剂0.5～1.5份、淡紫拟青霉制剂1.0～3.0份、疮痂链霉菌制剂0.5～1.5份、γ-氨基丁酸2.0～3.5份和有机物料85～94份。
3.根据权利要求1或2所述生物防治棉花枯黄萎病的组合物，其特征在于：所述烟叶提取物的制备方法为：将干燥的烟叶粉碎后，加入水中，调节ph值后，加热浸出，过滤，滤液浓缩，得烟叶提取物；所述干燥的烟叶与水的质量比为1:10～15；所述粉碎至过10目筛；所述调节ph值至10～12；所述加热浸出的温度为40～60℃，时间为1～2h；所述滤液浓缩至含水率≤30%；所述刺儿菜提取物的制备方法为：将干燥的刺儿菜粉碎后，加入乙醇溶液中，超声加热浸出，过滤，滤液浓缩，得刺儿菜提取物；所述干燥的刺儿菜与乙醇溶液的质量体积比为1:5～10；所述乙醇溶液的体积分数为10～95%；所述粉碎至过10目筛；所述超声加热浸出的温度为50～70℃，超声的频率为30～50khz，时间为10～20min；所述滤液浓缩至含水率≤15%。
4.根据权利要求1～3之一所述生物防治棉花枯黄萎病的组合物，其特征在于：所述坚强芽孢杆菌制剂的活菌数为1.0×107～2.0×1010个/g；所述淡紫拟青霉制剂的活菌数为1.0×107～2.0×1010个/g；所述疮痂链霉菌制剂的活菌数为1.0×107～1.0×1010个/g；所述有机物料为棉籽饼、豆粕、油枯、酒糟、发酵腐熟粪便、味精发酵废料或酵母发酵废料中的一种或几种。
5.一种如权利要求1～4之一所述生物防治棉花枯黄萎病的组合物的制备方法，其特征在于：先将坚强芽孢杆菌制剂、淡紫拟青霉制剂、疮痂链霉菌制剂、γ-氨基丁酸和有机物料进行一次搅拌混合后，发酵，再加入烟叶提取物和刺儿菜提取物进行二次搅拌混合，即成。
6.根据权利要求5所述生物防治棉花枯黄萎病的组合物的制备方法，其特征在于：所述搅拌的转速均为30～50r/min；所述一次搅拌混合的时间为20～30min；所述发酵的温度为50～58℃，含水量为50～60%，时间为48～72h；所述二次搅拌混合的时间为10～20min。
7.一种如权利要求1～4之一所述生物防治棉花枯黄萎病的组合物的应用，其特征在于：将权利要求1～4之一所述生物防治棉花枯黄萎病的组合物，按照50～100kg/亩撒施于土壤表面，翻地、整地后，进行棉花播种以及常规管理。
8.根据权利要求7所述生物防治棉花枯黄萎病的组合物的应用，其特征在于：棉花种植的密度为10000～14000株/亩。
技术总结