本发明属于生化分离技术领域，具体涉及一种从发酵液中分离提取番茄红素的方法。
背景技术：
番茄红素是一种长链不饱和烯烃，类胡萝卜素的一种，它的抗氧化能力是β-胡萝卜素的3.2倍，是维生素e的100倍，能高效淬灭人体中的单线态氧和清除自由基，从而起到抗癌、抑癌作用及活化免疫细胞等功能，被称为“植物黄金”。
目前，番茄红素主要从植物中萃取，自然界植物以番茄中番茄红素含量最高，但含量也仅有约100mg/kg，大规模提取番茄红素会造成植物资源大量浪费，且植物成分复杂，造成提取产物纯度不高。因此，综合考虑到品质、技术、生产、资源成本等因素，从天然番茄中提取生产番茄红素的前景并不乐观。通过wittig烯化反应可以人工合成番茄红素，但化学合成法工艺路线较长，反应条件比较苛刻，收率较低，同时产品带有大量的有毒物质残余，对食品安全产生很大影响。
微生物有生长繁殖快，生长周期短，产量高，杂质少，可以进行大规模生产的特点，可以克服番茄提取和化学法合成番茄红素的不足之处，非常适合用于工业化生产；其培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉，经济效益高。
技术实现要素：
本发明的目的是从发酵液中分离提取番茄红素。
本发明首先保护一种从发酵液中分离提取番茄红素的方法，依次包括如下步骤：
(1)取含有番茄红素的发酵液，收集菌体；
(2)取步骤(1)得到的菌体，加入乙醇浸泡1-3h(如1-2h、2-3h、1h、2h或3h)，收集沉淀；
(3)用乙醇洗涤步骤(2)收集的沉淀2次以上(如2次、3次)，收集菌粉；
(4)取步骤(3)得到的菌粉，用50-60℃(如50-55℃、55-60℃、50℃、55℃或60℃)乙酸乙酯萃取2-4次(如2-3次、3-4次、2次、3次或4次)，合并乙酸乙酯相，得到有机相；
(5)将步骤(4)得到的有机相进行浓缩；然后加入乙醇，0-4℃(如0-2℃、2-4℃、0℃、2℃或4℃)结晶，得到番茄红素晶体。
上述方法中，所述步骤(1)中，收集菌体的方式可为离心或过滤。
上述方法中，所述步骤(2)中，收集沉淀的方式可为离心或过滤。
离心可为管式离心机离心或碟片式离心机离心。离心速度不低于8000rpm。过滤可为板框过滤。
上述方法中，所述步骤(2)中，浸泡时，乙醇和菌体的比例可为1ml：0.8-1.2g(如1ml：0.8-1.0g、1ml：1.0-1.2g、1ml：0.8g、1ml：1.0g或1ml：1.2g)。
上述方法中，所述步骤(3)中，洗涤时，乙醇和沉淀的比例可为1ml：0.8-1.2g(如1ml：0.8-1.0g、1ml：1.0-1.2g、1ml：0.8g、1ml：1.0g或1ml：1.2g)。
上述方法中，所述步骤(3)中，每次洗涤的方法可为：向沉淀中缓慢加入乙醇淋洗，搅拌均匀并抽滤。
洗涤方法命名为乙醇淋洗脱水法，其不仅可以快速带出发酵菌体中大部分水，而且还可以带出发酵原料残余和醇溶性化学组分。乙醇淋洗之后菌体由明显的粘稠状变成可抓取的粉体状，主要是乙醇淋洗过程中带走了大部分的水溶性多糖、蛋白、发酵残余等物质，大幅度改善提取收率和晶体纯度。
上述方法中，所述步骤(4)中，每次萃取的时间可为1-2h(如1-1.5h、1.5-2h、1h、1.5h或2h)。
上述方法中，所述步骤(4)中，萃取时，乙酸乙酯和菌粉的比例为200ml：8-12g(如200ml：8-10g、200ml：10-12g、200ml：8g、200ml：10g或200ml：12g)。
上述方法中，所述步骤(5)中，浓缩可为60℃以下(如40-50℃、50-60℃、40℃、50℃或60℃)真空减压浓缩。
上述方法中，所述步骤(5)中，结晶时，浓缩后的有机相和乙醇的体积比可为1:3-5(如1:3-4、1:4-5、1:3、1:4或1:5)。
上述任一所述的方法还可包括步骤(6)：完成步骤(5)后，将番茄红素晶体纯化3次以上。
每次纯化方法可为：向番茄红素晶体中加入无水乙醇，溶解，之后0-4℃(如0-2℃、2-4℃、0℃、2℃或4℃)结晶。乙醇和番茄红素晶体的比例可为3-5ml：1g(如3-4ml：1g、4-5ml：1g、3ml：1g、4ml：1g或5ml：1g)。
上述任一所述含有番茄红素的发酵液是由生产番茄红素的菌株发酵培养获得的。所述生产番茄红素的菌株具体可为重组大肠杆菌lyc029。
上述任一所述含有番茄红素的发酵液具体可为重组大肠杆菌lyc029发酵液。重组大肠杆菌lyc029发酵液的制备方法可如下：从-80℃取出重组大肠杆菌lyc029菌种，在lb平板上划线，置于37℃培养箱中15h；挑取单菌落接种至含有120mllb培养基的三角瓶中，37℃、250rpm培养至od600nm为3.0-4.0，得到的菌液即为高密度发酵的种子液；将制备的种子液接种至5l发酵液，培养温度为37℃，ph为7.0、溶氧恒定在20％，与溶氧与搅拌和通气级联，通过仪器的智控系统调节转速和通气将溶解氧维持在20％；初始培养基中碳源耗尽后溶氧会突然升高，此时开启补料，通过do-stat法调整补料速率将溶氧维持在合适的范围；当菌体od600nm长到90左右时加入0.1mmiptg诱导；培养48h发酵结束。重组大肠杆菌lyc029已于2016年08月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为cgmccno.12883。上述制备方法和重组大肠杆菌lyc029记载于如下中国发明专利文献cn106434506a中。
实验证明，采用本发明提供的方法从发酵液中分离提取番茄红素，纯度可达98％以上，收率可达75％以上。该方法提取的番茄红素含量高，杂质少，提取方法简单、快速、成本低、溶剂可以全部回收，符合工业化要求，适合大规模工业化生产。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例2中获得的番茄红素丙酮溶液的液相色谱图。
图2为实施例3中获得的番茄红素丙酮溶液的液相色谱图。
图3为番茄红素重结晶的质谱检测结果。
图4为番茄红素重结晶的核磁共振碳谱检测结果。
图5为番茄红素重结晶的核磁共振氢谱检测结果。
图6为全反式番茄红素的分子结构。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，重组大肠杆菌lyc029发酵液的制备方法如下：从-80℃取出重组大肠杆菌lyc029菌种，在lb平板上划线，置于37℃培养箱中15h；挑取单菌落接种至含有120mllb培养基的三角瓶中，37℃、250rpm培养至od600nm为3.0-4.0，得到的菌液即为高密度发酵的种子液；将制备的种子液接种至5l发酵液，培养温度为37℃，ph为7.0、溶氧恒定在20％，与溶氧与搅拌和通气级联，通过仪器的智控系统调节转速和通气将溶解氧维持在20％；初始培养基中碳源耗尽后溶氧会突然升高，此时开启补料，通过do-stat法调整补料速率将溶氧维持在合适的范围；当菌体od600nm长到90左右时加入0.1mmiptg诱导；培养48h发酵结束。重组大肠杆菌lyc029已于2016年08月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为cgmccno.12883。上述制备方法和重组大肠杆菌lyc029记载于如下中国发明专利文献cn106434506a中。
实施例1、从发酵液中分离提取番茄红素的方法的建立
一、从发酵液中分离提取番茄红素的实验摸索
实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
1、取重组大肠杆菌lyc029发酵液，离心，收集得到菌体。
2、取500ml三角瓶，加入100g菌体和400ml乙酸乙酯，混匀，浸泡1天，收集上清液。用移液管取1ml上清液，用丙酮稀释100倍，然后检测od474nm和od506nm。
3、完成步骤2后，向三角瓶加入400ml乙酸乙酯，混匀，继续浸泡1天，收集上清液。用移液管取1ml上清液，用丙酮稀释100倍，然后检测od474nm和od506nm。
4、完成步骤3后，向三角瓶加入400ml乙酸乙酯，混匀，继续浸泡1天，收集上清液。用移液管取1ml上清液，用丙酮稀释100倍，然后检测od474nm和od506nm。
5、完成步骤4后，向三角瓶加入400ml乙酸乙酯，混匀，继续浸泡1天，收集上清液。用移液管取1ml上清液，用丙酮稀释100倍，然后检测od474nm和od506nm。
上述步骤的检测结果见表1。
表1
上述结果表明，随着浸泡的延长，番茄红素浸提液(即上文中的上清液)的od474nm和od506nm逐渐减少。浸泡第4天后，菌体的颜色还是深红色，说明还有大量番茄红素未被萃取出来。
二、建立从发酵液中分离提取番茄红素的方法
本发明的发明人经过大量实验，建立了从发酵液中分离提取番茄红素的方法，该方法耗时短且提取番茄红素含量高。具体步骤如下：
1、取发酵液(含有番茄红素)，收集得到菌体。
收集菌体的方式为离心或过滤。离心为管式离心机离心或碟片式离心机离心。过滤为板框过滤。
2、取菌体，加入乙醇浸泡1-3h，过滤，收集沉淀。
乙醇和菌体的比例为1ml：0.8-1.2g。
3、完成步骤2后，用乙醇洗涤沉淀2次以上(如2次、3次、4次)，收集菌粉。
每次洗涤的方法为：向沉淀中缓慢加入乙醇淋洗，搅拌均匀并抽滤。
洗涤时，乙醇和沉淀的比例为1ml：0.8-1.2g。
4、完成步骤3后，取菌粉，用50-60℃乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯相，得到有机相。
每次萃取的时间为1-2h。
乙酸乙酯和菌粉的比例为200ml：8-12g。
5、完成步骤4后，将有机相进行真空减压浓缩；然后加入乙醇，0-4℃结晶，得到番茄红素晶体。
真空减压浓缩可为40-60℃以下真空减压浓缩。
真空减压浓缩后的有机相和乙醇的体积比为1:3-5。
为了提高番茄红素晶体的纯度(即去除主要杂质得到高纯度的番茄红素晶体)，可将步骤5得到的番茄红素晶体纯化3次以上。纯化方法为：向晶体中加入无水乙醇，溶解，之后0-4℃结晶。
如果将步骤2-3由菌体制备菌粉的方法替换为将菌体常规干燥制备菌粉，则番茄红素提取率较低；可能的原因如下：(1)番茄红素化学性质不稳定，在脱水过程中会造成损失；(2)菌体中还含有大量的发酵残余、水溶性蛋白和色素物质，干燥后菌粉直接提取影响晶体纯度。因此，步骤2-3由菌体制备菌粉的方法是必须的，是本发明的发明人经过大量实验摸索出的最佳方法—乙醇淋洗脱水法，其不仅可以快速带出发酵菌体中大部分水，而且还可以带出发酵原料残余和醇溶性化学组分。乙醇淋洗之后菌体由明显的粘稠状变成可抓取的粉体状，主要是乙醇淋洗过程中带走了大部分的水溶性多糖、蛋白、发酵残余等物质，大幅度改善提取收率和晶体纯度。需要说明的是，上述步骤2和3由菌体制备菌粉，得率约25％，即离心后的菌体中含有大概75％的水分。
实施例2、从重组大肠杆菌lyc029发酵液中分离提取番茄红素的实验一
1、取10l重组大肠杆菌lyc029发酵液(重组大肠杆菌lyc029发酵液中番茄红素的浓度为4g/l)，管式离心机离心，收集得到3.3kg菌体。
2、完成步骤1后，取40g菌体，加入40ml乙醇浸泡1h，过滤，用砂芯漏斗抽滤，收集沉淀(约10g)。
3、完成步骤2后，用乙醇洗涤沉淀2次，收集菌粉(约10g)。
每次洗涤的方法为：向沉淀中缓慢加入10ml乙醇淋洗，搅拌均匀并抽滤。
4、完成步骤3后，将菌粉转移至1l三口烧瓶，加入200ml乙酸乙酯，60℃萃取3次，合并乙酸乙酯相，得到有机相。
每次萃取的时间为1h。
5、完成步骤4后，取有机相，用真空减压浓缩器进行浓缩，当浓缩液剩余20ml左右时，停止旋转蒸发；向浓缩液中加入4体积份的乙醇，震荡混合后用保鲜膜密封，4℃结晶24h，过滤，获得番茄红素晶体。将番茄红素晶体50℃真空烘干2h，称重，得到干燥晶体380mg。收率为78.3％(380mg×3.3kg/(40g×4g/l×10l)×100％＝78.4％)
将干燥晶体溶于丙酮(即番茄红素丙酮溶液)，用hplc进行含量测定。
检测条件：symmetryc18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇：乙腈：二氯甲烷＝21:21:8，流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长480nm。
共检测3个平行样，结果取自3个平行样的均值。
番茄红素标准品为sigma公司的产品。经hplc检测，样品中的出峰时间与标准品中番茄红素的出峰时间相同(出峰时间为11.785min)。
结果见图1。结果表明，番茄红素的纯度为99.0％。
实施例3、从重组大肠杆菌lyc029发酵液中分离提取番茄红素的实验二
1、取30l重组大肠杆菌lyc029发酵液(重组大肠杆菌lyc029发酵液中番茄红素的浓度为4g/l)，管式离心机离心，收集9.9kg菌体。
2、完成步骤1后，取320g菌体，加入320ml乙醇浸泡2h，过滤，用砂芯漏斗抽滤，收集沉淀(约80g)。
3、完成步骤2后，用乙醇洗涤沉淀2次，收集菌粉(约80g)。
每次洗涤的方法为：向沉淀中缓慢加入80ml乙醇淋洗，搅拌均匀并抽滤。
4、完成步骤3后，将菌粉转移至三口烧瓶，加入1.6l乙酸乙酯，60℃萃取2次，合并乙酸乙酯相，得到有机相。
每次萃取的时间为1h。
5、完成步骤4后，取有机相，用真空减压浓缩器进行浓缩，当浓缩液剩余160ml左右时，停止旋转蒸发；向浓缩液中加入4体积份的乙醇，震荡混合后用保鲜膜密封，4℃结晶24h，过滤，获得番茄红素晶体。
将番茄红素晶体50℃真空烘干2h，称重，得到干燥晶体3.1g。收率为79.9％(3.1g×9.9kg/(320g×4g/l×30l)×100％＝79.9％)。
将干燥晶体溶于丙酮，用hplc进行含量测定。
检测条件：symmetryc18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇:乙腈:二氯甲烷＝21:21:8，流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长480nm。
共检测3个平行样，结果取自3个平行样的均值。
番茄红素标准品为sigma公司的产品。经hplc检测，样品中的出峰时间与标准品中番茄红素的出峰时间相同(出峰时间为11.791min)。
结果见图2。结果表明，番茄红素的纯度为98.5％。
为了提高干燥晶体的纯度，重结晶3次，得到番茄红素重结晶。每次重结晶的步骤为：向晶体中加入无水乙醇，溶解，之后0-4℃结晶。乙醇和晶体的比例为4ml：1g。
将番茄红素重结晶于天津大学分析测试中心进行质谱和核磁共振检测。核磁共振设备型号：瑞士brukeravanceiii400m。溶剂：氘代氯仿(cdcl3)。内标：四甲基硅烷(tms)。
番茄红素重结晶的质谱检测结果见图3。
番茄红素重结晶的核磁共振碳谱检测结果见图4。
番茄红素重结晶的核磁共振氢谱检测结果见图5。
获得核磁共振碳谱和氢谱分析得到谱图后，本发明的发明人进行详细的化学结构分析以及文献数据比对，确定送样结构为全反式番茄红素，核磁共振碳谱和氢谱数据和文献(synthesis，isolation，andnmr-spectroscopiccharacterizationoffourteen(z)-isomersoflycopeneandofsomeacetylenicdidehydro－andtetradehydrolycopenes.helveticachimicaacta，1992，76(6):1848-1865)完全一致。因此，番茄红素重结晶的晶体结构为全反式番茄红素(见图6)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
1.一种从发酵液中分离提取番茄红素的方法，依次包括如下步骤：
(1)取含有番茄红素的发酵液，收集菌体；
(2)取步骤(1)得到的菌体，加入乙醇浸泡1-3h，收集沉淀；
(3)用乙醇洗涤步骤(2)收集的沉淀2次以上，收集菌粉；
(4)取步骤(3)得到的菌粉，用50-60℃乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯相，得到有机相；
(5)将步骤(4)得到的有机相进行浓缩；然后加入乙醇，0-4℃结晶，得到番茄红素晶体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，收集菌体的方式为离心或过滤。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，收集沉淀的方式为离心或过滤。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，浸泡时，乙醇和菌体的比例为1ml：0.8-1.2g。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，洗涤时，乙醇和沉淀的比例为1ml：0.8-1.2g。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，每次萃取的时间为1-2h。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，萃取时，乙酸乙酯和菌粉的比例为200ml：8-12g。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，浓缩为60℃以下真空减压浓缩。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，结晶时，浓缩后的有机相和乙醇的体积比为1:3-5。
10.如权利要求1至9任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤(6)：完成步骤(5)后，将番茄红素晶体纯化3次以上；纯化方法为：向番茄红素晶体中加入无水乙醇，溶解，之后0-4℃结晶。
技术总结