本发明涉及分离提纯技术领域，具体涉及一种生物发酵法制备辅酶q10的提纯方法。
背景技术：
辅酶q10是一种存在于人体细胞内的脂溶性醌类物质，在生物体的线粒体内膜以结合型或游离型存在，在体内与蛋白质结合发挥生物活性，其分子式为c59h90o4，广泛存在于自然界具有呼吸作用的生物体内，因此又被称为泛醌。
现有已公开辅酶q10的制备技术主要包括动植物组织提取法、化学合成法和微生物发酵法。辅酶q10最早的工业化生产方法是从动物体内提取加工而成，利用该方法得到的产品所需原料量大、产量低、生产成本高。以茄尼醇为原料制备辅酶q10的（半）合成法，产率相对较低，且产品为顺反异构体的混合物，活性不强，需要进行手性分离提纯。目前，利用微生物发酵法生产辅酶q10因为生产成本低、活性成分含量高以及生产工艺相对简单的优点，被国内外公认为是最具前途的生产工艺技术路线。但是不论选用哪种工艺路线生产辅酶q10，最终从原料中得到的粗品都需要经提取、分离、纯化等工艺处理步骤，得到符合要求的辅酶q10产品，因此开发产品的高效分离提纯工艺是辅酶q10产品工业化的关键技术。宋亚琼等在《微生物发酵法生产辅酶q10提取方法研究进展》中综述了辅酶q10的提取方法主要有皂化提取法、有机溶剂搅拌破碎细胞提取法、研磨细胞破碎提取法、超声波细胞破碎提取法等。中国专利cn107673958a公开了一种辅酶q10分离纯化的方法，利用多级串联的纳滤装置处理得到的浓缩液经溶剂脱除、乙醇结晶得含量＞99%的辅酶q10精品。公开号为cn107337593a的中国专利介绍了一种将辅酶q10发酵液经陶瓷膜微滤和喷雾干燥得到的粗品，经丙酮浸提、分相、减压浓缩得到辅酶q10提取浓缩液，然后通过石油醚萃取、硅胶柱层析、减压蒸馏浓缩洗脱液、结晶干燥的工艺得辅酶q10精品。中国专利cn108047014b公开介绍了一种采用离子液体分离辅酶q10的方法，以辅酶q10的粗体物为原料，以非极性有机溶剂为原料溶剂和洗涤剂，以离子液体或者离子液体-极性有机溶剂组成的二元混合溶剂为萃取剂获得高纯度的辅酶q10，该方法与传统有机溶剂相比，萃取剂具有较好的热稳定性和选择性，但是仍然没有解决萃取剂、洗涤剂等大量使用，最终会产生较多的有机溶剂废液的问题。中国专利cn108218681a中将辅酶q10粗提物溶解在丙酮/甲醇的混合溶液中，利用有机烃类键合硅胶或含有极性有机官能团的有机烃类键合硅胶进行吸附洗脱除去杂质，制得高纯度辅酶q10单体。cn105886562a介绍了微生物发酵法制备辅酶q10的纯化步骤，将粗体物用硅胶吸附柱，先用石油醚洗涤，再用石油醚/乙醚混合液洗脱，减压蒸馏洗脱液制得黄色油状结晶。cn103819326b公开了一种38~42℃硅胶柱吸附，然后利用甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷的一种或两种以上的组合溶剂作为洗脱液纯化分离微生物发酵法制备辅酶q10的方法。cn101987815b专利公开了制备高纯度辅酶q10的纯化工艺，包括将辅酶q10粗提物先经吸附树脂预处理，洗涤液经浓缩、结晶、重结晶，再以石油醚/乙醚或乙酸乙酯/正己烷混合溶剂为洗脱剂经硅胶柱分离纯化得精制辅酶q10。公开号cn101111465a专利借助正相色谱法，在20~40℃范围内分离含辅酶q10的混合物制备出纯净的产品。
随着对辅酶q10应用领域的研究不断深入，国内外消费市场对辅酶q10的需求量亦日益增长，但是辅酶q10的分离纯化技术仍然存在收率低、有机溶剂用量大、提纯成本高等各种技术问题亟待解决，且现有关于辅酶q10的分离纯化的以硅胶为吸附基质的柱分离方法中，均存在硅胶的可再生成本高及循环利用率低，给环境带来一定程度上的污染问题。因此，要实现辅酶q10的工业化，尤其是微生物发酵工艺方法的工业化生产，更应该从粗品的提取、分离、纯化等精制工艺方面探索开发新的技术方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种生物发酵法制备辅酶q10的提纯方法，为了解决现有辅酶q10分离提纯工艺中存在的技术问题，本发明提供一种超临界流体与有机溶剂混合洗脱的方式，实现对生物发酵法制备辅酶q10的提纯。该方法利超临界二氧化碳和有机溶剂混合体系洗脱进行生物发酵合成辅酶q10的分离提纯，具有分离效果好、二氧化碳利用率高、有机溶剂使用量低、安全环保等优点，产品纯度可达99%以上，同时，可实现硅胶和溶剂的重复利用，利于规模化生产的实施。
为实现上述目的本发明采用以下技术方案：
一种生物发酵法合成辅酶q10的提纯方法，包括如下步骤：
1）、将微生物发酵法制得的辅酶q10菌渣经压力为42mpa，萃取和分离温度为40~45℃，控制二氧化碳流速为30~50l/h，循环萃取时间选择为1~4h的超临界二氧化碳萃取分离初提处理，得质量百分比含量为50~60%的辅酶q10粗提物；
2）、向步骤（1）中所得辅酶q10粗提物与无水乙醇按照1：（1~5）的质量比混合，升温至45~50℃并搅拌使其呈均一的液态混合体系；
3）、继续保持45~50℃的体系温度，按照与步骤（2）所得混合液质量比为（1~3）:1的质量比加入粒径为100~200目的硅胶粉，充分搅拌使物料均匀吸附在硅胶上形成制样；
4）、将步骤（3）所得制样平铺于萃取釜下端，然后向制样上方加入步骤（3）中同规格的空白硅胶粉并充分压实使萃取釜上端保留2~3㎝空间，利用超临界与有机洗脱剂进行洗脱、分离，经蒸馏、干燥得黄色辅酶q10产品，回收溶剂可循环利用。
作为本发明进一步方案，所述的步骤（1）中菌渣中辅酶q10含量为2~3%。
作为本发明进一步方案，所述的步骤（1）中辅酶q10质量百分比含量约为50~60%的粗提物中杂质成分主要为5-脱甲氧基辅酶q10、辅酶q9、q11等同系物及还原型辅酶q9和少量的甲萘醌8。
作为本发明进一步方案，所述的步骤（4）中超临界与有机洗脱剂为同步打入萃取釜的方式对硅胶制样进行层析分离。
作为本发明进一步方案，所述的有机洗脱剂从超临界萃取装置的携带剂入口按照实际需要设定流速打入。
作为本发明进一步方案，所述的有机洗脱剂选择为无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、正己烷等中的任意两种或三种以任何合适比例混合组成。
作为本发明进一步方案，所述的步骤（4）中超临界二氧化碳的循环流速控制范围为10~20l/h,有机洗脱剂的流速控制范围为0.1~1l/h，洗脱分离时间为1~3h。
作为本发明进一步方案，所述的硅胶粉经超临界二氧化碳反复萃取处理后可回收循环利用，所述的有机溶剂洗脱剂经蒸馏可回收再利用。
本发明的有益效果是：本发明采用超临界流体萃取粗提、硅胶吸附粗提物、再次超临界流体 有机混合溶剂洗脱硅胶吸附体系的方法，实现了对生物发酵法合成辅酶q10粗品的精制提纯，该方法分离效率高、周期短、产品纯度可达99%以上，且易实现吸附硅胶和混合溶剂的循环利用；本发明方法有效避免了辅酶q10现有硅胶层析分离、溶剂重结晶等纯化技术中产生大量有机废液的技术问题、大大减少了固废和有机废液的产生，利于环境安全。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
将微生物发酵法制得的辅酶q10菌渣500g(其中：辅酶q10含量为2.97%)经压力为42mpa，萃取和分离温度范围选择为45℃，控制二氧化碳流速为30l/h，循环萃取时间选择为3h的超临界二氧化碳萃取分离初提处理，得质量百分比含量为57%的辅酶q10粗提物25.82g；向上述所得辅酶q10粗提物5g中加入无水乙醇10g，升温至45℃并搅拌使其呈均一的液态混合体系，然后加入15g粒径为100~200目的硅胶粉充分搅拌混合均匀，形成硅胶制样；将硅胶制样平铺于超临界萃取装置的萃取釜底部，加入粒径为100~200目的空白硅胶粉并充分压实使萃取釜上端保留2~3㎝空间；控制超临界流体压力为30mpa，流速为10l/h，萃取釜内温度为45±1℃，同时按照0.3l/h的流速将v乙酸乙酯:v石油醚=1:15的有机混合洗脱溶剂从携带剂入口匀速打入，循环洗脱2.1h时，共消耗有机有机洗脱剂409.5g,从分离罐放料口共接收辅酶q10液相色谱纯度＞99%的混合液共计307g，经蒸馏、干燥得黄色辅酶q10固体2.47g，经高效液相色谱检测分析得：辅酶q10含量为99.65%，所含杂质成分为辅酶q9含量0.27%，辅酶q11含量0.08%，辅酶q10回收率为86.67%。
实施例2
取实施例1中所制备辅酶q10粗提物5g，加入15g无水乙醇并升温至48℃使其呈均一混合液态流动体系，然后加入25g粒径为100~200目的硅胶粉充分搅拌混合均匀，形成硅胶制样；将硅胶制样平铺于超临界萃取装置的萃取釜底部，加入粒径为100~200目的空白硅胶粉并充分压实使萃取釜上端保留2~3㎝空间；控制超临界流体压力为35mpa，流速为20l/h，萃取釜内温度为45±1℃，同时按照0.5l/h的流速将v正己烷:v石油醚=1:20的混合有机洗脱溶剂从携带剂入口匀速打入，循环洗脱2.5h时，共消耗有机有机洗脱剂812.5g,从分离罐放料口接收辅酶q10液相色谱纯度＞99%的混合液共计624g，经蒸馏、干燥得黄色辅酶q10固体2.53g，经高效液相色谱检测分析得：辅酶q10含量为99.33%，所含杂质成分为辅酶q9含量0.19%，还原型辅酶q9含量0.08%，辅酶q11含量0.39%，辅酶q10回收率为88.77%。
实施例3
硅胶粉及有机洗脱剂的回收利用；
分别将上述实施例1-2中分离出辅酶q10的剩余物料经二氧化碳超临界流体继续循环洗脱至萃取釜中硅胶吸附物质全部流出，取出无色至暗灰色硅胶粉并进行干燥处理。按照实施例1中工艺参数和操作方法利用上述回收硅胶粉对辅酶q10粗提物进行提纯分离，其中从携带罐中打入分离体系中的混合溶剂掺有实施例1分离接受物中蒸馏出的溶剂282g，得黄色产品2.44g，经高效液相色谱检测分析得：辅酶q10含量为99.19%，所含杂质成分为辅酶q9含量0.81%，辅酶q10回收率为85.61%。
对比例
利用柱层析方法分离纯化；
取实施例1中所制备辅酶q10粗提物5g，按照实施例1所述的操作方法加入无水乙醇10g，升温至45℃并搅拌使其呈均一的液态混合体系，然后加入15g粒径为100~200目的硅胶粉充分搅拌混合均匀，形成硅胶制样，以径高比为1:14的100~200目的硅胶柱为吸附介质、v乙酸乙酯:v石油醚=1:10为洗脱剂，连续洗脱3小时，共消耗洗脱剂1950g，收集辅酶q10液相色谱纯度＞99%的混合液共计723g,经蒸馏、干燥得黄色辅酶q10固体1.89g，经高效液相色谱检测分析得：辅酶q10含量为99.29%，所含杂质成分为辅酶q9含量0.44%，还原型辅酶q9含量0.06%，辅酶q11含量0.21%，辅酶q10回收率为66.32%。
本发明方法分离效率高、周期短、产品纯度可达99%以上，且易实现吸附硅胶和混合溶剂的循环利用；本发明方法有效避免了辅酶q10现有硅胶层析分离、溶剂重结晶等纯化技术中产生大量有机废液的技术问题、大大减少了固废和有机废液的产生，利于环境安全。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
1.一种生物发酵法合成辅酶q10的提纯方法，其特征在于，包括如下步骤：
将微生物发酵法制得的辅酶q10菌渣经压力为42mpa，萃取和分离温度为40~45℃，控制二氧化碳流速为30~50l/h，循环萃取时间选择为1~4h的超临界二氧化碳萃取分离初提处理，得质量百分比含量为50~60%的辅酶q10粗提物；
向步骤（1）中所得辅酶q10粗提物与无水乙醇按照1：（1~5）的质量比混合，升温至45~50℃并搅拌使其呈均一的液态混合体系；
继续保持45~50℃的体系温度，按照与步骤（2）所得混合液质量比为（1~3）:1的质量比加入粒径为100~200目的硅胶粉，充分搅拌使物料均匀吸附在硅胶上形成制样；
将步骤（3）所得制样平铺于萃取釜下端，然后向制样上方加入步骤（3）中同规格的空白硅胶粉并充分压实使萃取釜上端保留2~3㎝空间，利用超临界与有机洗脱剂进行洗脱、分离，经蒸馏、干燥得黄色辅酶q10产品，回收溶剂可循环利用。
2.根据权利要求1所述的一种生物发酵法合成辅酶q10的提纯方法，其特征在于，所述的步骤（1）中菌渣中辅酶q10含量为2~3%。
3.根据权利要求1所述的一种生物发酵法合成辅酶q10的提纯方法，其特征在于，所述的步骤（1）中辅酶q10质量百分比含量为50~60%的粗提物中杂质成分主要为5-脱甲氧基辅酶q10、辅酶q9、辅酶q11及还原型辅酶q9和少量的甲萘醌8。
4.根据权利要求1所述的一种生物发酵法合成辅酶q10的提纯方法，其特征在于，所述的步骤（4）中超临界与有机洗脱剂为同步打入萃取釜的方式对硅胶制样进行层析分离。
5.根据权利要求1所述一种生物发酵法合成辅酶q10的提纯方法，其特征在于，所述的有机洗脱剂从超临界萃取装置的携带剂入口按照实际需要设定流速打入。
6.根据权利要求5所述一种生物发酵法合成辅酶q10的提纯方法，其特征在于，所述的有机洗脱剂选择为无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、正己烷等中的任意两种或三种以任何合适比例混合组成。
7.根据权利要求1-6所述一种生物发酵法合成辅酶q10的提纯方法，其特征在于，所述的步骤（4）中超临界二氧化碳的循环流速控制范围为10~20l/h,有机洗脱剂的流速控制范围为0.1~1l/h，洗脱分离时间为1~3h。
8.根据权利要求7所述的一种生物发酵法合成辅酶q10的提纯方法，其特征在于，所述的硅胶粉经超临界二氧化碳反复萃取处理后可回收循环利用，所述的有机溶剂洗脱剂经蒸馏可回收再利用。
技术总结