本发明涉及微生物复合制剂技术领域，具体为一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂及制备方法。
背景技术：
炎症反应是由组织损伤或病原体感染引发的免疫反应过程，当免疫反应发生紊乱或者持续时间过长，会使细胞持续分泌促炎因子，从而引发各种疾病。屎肠球菌可通过免疫作用、代谢作用和调节肠道菌群等多种机制来缓解炎症反应进而维持机体稳态。巨噬细胞是主要的免疫细胞，分泌细胞因子的水平在评价细胞免疫功能中至关重要。
断奶仔猪胃肠道和免疫系统发育不完善，断奶会造成断奶应激，导致消化系统功能紊乱，出现各种疾病。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂及制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂，包括以下重量份的原料：屎肠球菌2-6份、磷酸缓冲盐溶液4-8份、thp-1细胞2-6份、佛波酯1-5份、胃蛋白酶10-14份、枯草芽孢杆菌发酵液2-6份、大豆蛋白粉7-11份、玉米淀粉11-15份和维生素粉9-13份。
进一步的，一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂，包括以下重量份的原料：屎肠球菌3-5份、磷酸缓冲盐溶液5-7份、thp-1细胞3-5份、佛波酯2-4份、胃蛋白酶11-13份、枯草芽孢杆菌发酵液3-5份、大豆蛋白粉8-10份、玉米淀粉12-14份和维生素粉10-12份。
进一步的，一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂，包括以下重量份的原料：屎肠球菌4份、磷酸缓冲盐溶液6份、thp-1细胞4份、佛波酯3份、胃蛋白酶12份、枯草芽孢杆菌发酵液4份、大豆蛋白粉9份、玉米淀粉13份和维生素粉11份。
一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂的制备方法，包括以下步骤：
s1：原料准备：按以下重量份依次称取原材料：屎肠球菌2-6份、磷酸缓冲盐溶液4-8份、thp-1细胞2-6份、佛波酯1-5份、胃蛋白酶10-14份、枯草芽孢杆菌发酵液2-6份、大豆蛋白粉7-11份、玉米淀粉11-15份和维生素粉9-13份，备用：
s2：屎肠球菌培养：将屎肠球菌以3％接种量接种于mrs培养基，传代培养2次，将活化好的待测菌株，37℃培养至稳定期，离心收集菌体，磷酸缓冲盐溶液洗涤2-3次，热灭活后，将菌体悬浮于prmi1640培养基中，调整为1×107cfu/ml备用；
s3：培养巨噬细胞：将thp-1细胞进行常规复苏、传代培养，培养细胞数量扩增至所需，调整thp-1细胞数为1×106cfu/ml，接种于6孔板，加入100ng/ml的佛波酯对thp-1进行诱导处理成为巨噬细胞；
s4：混合培养：去除培养巨噬细胞的上清液，用prmi1640培养基洗涤2-3次，加入s2中的rpmi1640培养基中进行培养；
s5：原料添加：在ph2.0-3.0无菌磷酸缓冲盐溶液中，加入3.5g/l胃蛋白酶，制成模拟胃液，预热至37℃，备用，取s4中稳定期菌液1ml，离心收集菌体，磷酸缓冲盐溶液洗涤2-3次，加入模拟胃液中，然后再将枯草芽孢杆菌发酵液、大豆蛋白粉、玉米淀粉和维生素粉混匀后加入到模拟胃液中培养，用平板计数法测活菌数。
进一步的，所述s2中，屎肠球菌以3％接种量接种于mrs培养基中培养温度设置为37℃，培养时间设置为18h。
进一步的，所述s3中，诱导时间设置为72h。
进一步的，所述s4中，培养时间设置为16h。
进一步的，所述s5中，采用混合机对枯草芽孢杆菌发酵液、大豆蛋白粉、玉米淀粉和维生素粉进行混匀。
进一步的，所述s5中，枯草芽孢杆菌发酵液、大豆蛋白粉、玉米淀粉和维生素粉混匀后加入到模拟胃液中培养的温度设置为37℃，培养时间设置为3h。
与现有技术相比，本发明的有益效果是；
培育出的屎肠球菌复合制剂可有效的减少患肠炎仔猪的腹泻率，改善肠道炎症，提高机体免疫力，作用效果与抗生素组无显著差异，同时由于屎肠球菌复合制剂中添加了枯草芽孢杆菌发酵液、大豆蛋白粉、玉米淀粉和维生素粉，可以有效改善动物肠道微生态环境，增加肠道有益菌群的功效。
本发明以屎肠球菌为基础开发出一个复合制剂产品，该产品可有效减轻仔猪的肠道炎症，提高仔猪免疫力，达到与抗生素相当的效果，同时具有改善动物肠道微生态环境，增加肠道有益菌群的功效。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂，包括以下重量份的原料：屎肠球菌4份、磷酸缓冲盐溶液6份、thp-1细胞4份、佛波酯3份、胃蛋白酶12份、枯草芽孢杆菌发酵液4份、大豆蛋白粉9份、玉米淀粉13份和维生素粉11份。
一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂的制备方法，包括以下步骤：
s1：原料准备：按以下重量份依次称取原材料：屎肠球菌4份、磷酸缓冲盐溶液6份、thp-1细胞4份、佛波酯3份、胃蛋白酶12份、枯草芽孢杆菌发酵液4份、大豆蛋白粉9份、玉米淀粉13份和维生素粉11份，备用：
s2：屎肠球菌培养：将屎肠球菌以3％接种量接种于mrs培养基，传代培养2次，将活化好的待测菌株，37℃培养至稳定期，离心收集菌体，磷酸缓冲盐溶液洗涤2-3次，热灭活后，将菌体悬浮于prmi1640培养基中，调整为1×107cfu/ml备用；
s3：培养巨噬细胞：将thp-1细胞进行常规复苏、传代培养，培养细胞数量扩增至所需，调整thp-1细胞数为1×106cfu/ml，接种于6孔板，加入100ng/ml的佛波酯对thp-1进行诱导处理成为巨噬细胞；
s4：混合培养：去除培养巨噬细胞的上清液，用prmi1640培养基洗涤2-3次，加入s2中的rpmi1640培养基中进行培养；
s5：原料添加：在ph2.0-3.0无菌磷酸缓冲盐溶液中，加入3.5g/l胃蛋白酶，制成模拟胃液，预热至37℃，备用，取s4中稳定期菌液1ml，离心收集菌体，磷酸缓冲盐溶液洗涤2-3次，加入模拟胃液中，然后再将枯草芽孢杆菌发酵液、大豆蛋白粉、玉米淀粉和维生素粉混匀后加入到模拟胃液中培养，用平板计数法测活菌数，计算公式：菌株的存活率(％)＝3h活菌数/0h活菌数×100。
本实施例中，所述s2中，屎肠球菌以3％接种量接种于mrs培养基中培养温度设置为37℃，培养时间设置为18h，所述s3中，诱导时间设置为72h，所述s4中，培养时间设置为16h，所述s5中，采用混合机对枯草芽孢杆菌发酵液、大豆蛋白粉、玉米淀粉和维生素粉进行混匀，所述s5中，枯草芽孢杆菌发酵液、大豆蛋白粉、玉米淀粉和维生素粉混匀后加入到模拟胃液中培养的温度设置为37℃，培养时间设置为3h。
屎肠球菌体外抗炎作用研究：
本实施例中，每个受试菌株设置3个复孔。对照组为巨噬细胞 rpmi1640培养基，模型组为巨噬细胞 rpmi1640培养基 脂多糖(lps)母液，试验组为巨噬细胞 rpmi1640培养基 受试菌 脂多糖(lps)母液，处理6h，用试剂盒检测上清液中炎性细胞因子tnf-α，il-1β和il-6的含量变化，得到表一；
该屎肠球菌复合制剂有效成分及添加量为每公斤含：屎肠球菌(2-5×109cfu/g)50g、壳寡糖(98％)50g、绿原酸500g；
表一屎肠球菌复合制剂对tnf-α，il-1β和il-6的含量影响
试验结果表明：从10株菌株里筛选出来屎肠球菌ef-2表现出最佳的抗炎效果，可有效的降低炎症模型中tnf-α，il-1β和il-6的含量。
屎肠球菌复合制剂对断奶仔猪生长性能及改善肠道炎症的作用研究：
本实施例中，将试验仔猪按体重相近、窝龄相近、健康状况良好的杜×长×大三元杂交28日龄断奶仔猪公猪120头随机分为3个处理，每个处理8个重复，每个重复5头猪；三个处理分别为：
(1)抗生素组：基础日粮 dss 0.03％金霉素；
(2)模型组：基础日粮 dss；
(3)复合制剂组：基础日粮 dss 屎肠球菌复合制剂，所有猪自由采食和饮水，试验周期从断奶后第1天至断奶后第50天，得到表二和表三。
表二屎肠球菌复合制剂对仔猪腹泻率及生长性能的影响
表三屎肠球菌复合制剂对仔猪免疫指标及抗炎因子的影响
试验结果表明：屎肠球菌复合制剂组与模型组相比，提高仔猪血清中iga和igg的水平，降低促炎因子tnfα和infγ的水平，有效降低仔猪腹泻率，与抗生素组结果差异不显著，有效的替代抗生素的使用。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
1.一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂，其特征在于，包括以下重量份的原料：屎肠球菌2-6份、磷酸缓冲盐溶液4-8份、thp-1细胞2-6份、佛波酯1-5份、胃蛋白酶10-14份、枯草芽孢杆菌发酵液2-6份、大豆蛋白粉7-11份、玉米淀粉11-15份和维生素粉9-13份。
2.根据权利要求1所述的一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂，其特征在于，包括以下重量份的原料：屎肠球菌3-5份、磷酸缓冲盐溶液5-7份、thp-1细胞3-5份、佛波酯2-4份、胃蛋白酶11-13份、枯草芽孢杆菌发酵液3-5份、大豆蛋白粉8-10份、玉米淀粉12-14份和维生素粉10-12份。
3.根据权利要求1所述的一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂，其特征在于，包括以下重量份的原料：屎肠球菌4份、磷酸缓冲盐溶液6份、thp-1细胞4份、佛波酯3份、胃蛋白酶12份、枯草芽孢杆菌发酵液4份、大豆蛋白粉9份、玉米淀粉13份和维生素粉11份。
4.一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1：原料准备：按以下重量份依次称取原材料：屎肠球菌2-6份、磷酸缓冲盐溶液4-8份、thp-1细胞2-6份、佛波酯1-5份、胃蛋白酶10-14份、枯草芽孢杆菌发酵液2-6份、大豆蛋白粉7-11份、玉米淀粉11-15份和维生素粉9-13份，备用：
s2：屎肠球菌培养：将屎肠球菌以3％接种量接种于mrs培养基，传代培养2次，将活化好的待测菌株，37℃培养至稳定期，离心收集菌体，磷酸缓冲盐溶液洗涤2-3次，热灭活后，将菌体悬浮于prmi1640培养基中，调整为1×107cfu/ml备用；
s3：培养巨噬细胞：将thp-1细胞进行常规复苏、传代培养，培养细胞数量扩增至所需，调整thp-1细胞数为1×106cfu/ml，接种于6孔板，加入100ng/ml的佛波酯对thp-1进行诱导处理成为巨噬细胞；
s4：混合培养：去除培养巨噬细胞的上清液，用prmi1640培养基洗涤2-3次，加入s2中的rpmi1640培养基中进行培养；
s5：原料添加：在ph2.0-3.0无菌磷酸缓冲盐溶液中，加入3.5g/l胃蛋白酶，制成模拟胃液，预热至37℃，备用，取s4中稳定期菌液1ml，离心收集菌体，磷酸缓冲盐溶液洗涤2-3次，加入模拟胃液中，然后再将枯草芽孢杆菌发酵液、大豆蛋白粉、玉米淀粉和维生素粉混匀后加入到模拟胃液中培养，用平板计数法测活菌数。
5.根据权利要求4所述的一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂的制备方法，其特征在于，所述s2中，屎肠球菌以3％接种量接种于mrs培养基中培养温度设置为37℃，培养时间设置为18h。
6.根据权利要求4所述的一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂的制备方法，其特征在于，所述s3中，诱导时间设置为72h。
7.根据权利要求4所述的一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂的制备方法，其特征在于，所述s4中，培养时间设置为16h。
8.根据权利要求4所述的一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂的制备方法，其特征在于，所述s5中，采用混合机对枯草芽孢杆菌发酵液、大豆蛋白粉、玉米淀粉和维生素粉进行混匀。
9.根据权利要求4所述的一种能改善仔猪肠道炎症的屎肠球菌复合制剂的制备方法，其特征在于，所述s5中，枯草芽孢杆菌发酵液、大豆蛋白粉、玉米淀粉和维生素粉混匀后加入到模拟胃液中培养的温度设置为37℃，培养时间设置为3h。
技术总结