本发明属于生物医药领域，具体涉及两种新的假白榄烷类二萜及其提取方法与应用。
背景技术：
癌症是影响人类健康的重大疾病之一，随着人口的老龄化趋势及人口快速增长，全球的癌症发病数和死亡数也在快速增长。癌症正在成为人口死亡的重要原因，并且将是人类提高预期寿命的重要障碍。现有的癌症治疗手段中，化学疗法是重要手段之一。然而，在化疗药物使用过程中，一旦肿瘤细胞获得耐药性，则肿瘤化疗的效果将显著降低。根据统计，在癌症化疗过程中，约有90％的患者由于多药耐药性(multidrugresistance,mdr)的产生而不能达到预期的治疗效果。寻找低毒有效逆转肿瘤细胞耐药性，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，从而达到更好治疗与预后效果的需求显得越来越突出。因此，探索肿瘤mdr抑制剂，显得尤为重要。
在抗肿瘤多药耐药机制中，abc转运蛋白(atp-bindingcassettetransporterssuperfamily)介导的肿瘤多药耐药最普遍，其中p-糖蛋白(p-glycoprotein,p-gp)是产生多药耐药性的主要靶点，也是目前研究热点。以p-gp为靶点的肿瘤多药耐药逆转剂，以发展顺序分为以下几类：以维拉帕米(verapamil)为代表的第一代p-gp抑制剂，这类抑制剂特异性结合率低，对人体毒副作用强；以vx-710等为代表的在一代抑制剂结构基础上改造而来的第二代p-gp抑制剂，该类药物干扰体内正常代谢，限制了临床应用。第三代p-gp抑制剂的代表药物为tariguidar，对p-gp蛋白具有较高的亲和力，但此类药物吸收不良，临床效果较差。因此，针对p-gp的抑制剂亟需一种新结构。
技术实现要素：
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供两个假白榄烷类二萜化合物及其制备方法与其在制备逆转肿瘤细胞多药耐药性的药物中的应用，具体地说是具有逆转p-gp介导的肿瘤细胞多药耐药作用的假白榄烷类二萜。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
如式1或式2所示的假白榄烷类二萜化合物，
本发明的两个假白榄烷类二萜为环上多个位点被乙酰基和苯甲酰基取代的化合物。
优选地，所述假白榄烷类二萜化合物为式2所示的化合物。
本发明还提供上述式1或式2所示的假白榄烷类二萜化合物的提取方法，所述式1或式2所示的假白榄烷类二萜化合物提取自甘遂块根，甘遂采购自安徽省亳州市，经鉴定为euphorbiakansui，样品标本由浙江工业大学药学院天然药物研究所保藏，编号为no.20160810。
所述方法包括乙醇浸提法、萃取、硅胶柱层析、和mci柱层析等步骤，具体包括如下步骤：
(1)取甘遂块根粉碎，室温条件下，用体积分数为95％的乙醇水溶液浸提，合并提取液，减压浓缩，得甘遂块根提取物；
(2)将步骤(1)得到的甘遂块根提取物用水a溶解后，用石油醚a萃取两次，合并有机相；所述水a的体积以甘遂块根提取物的质量计为1.95～2ml/g，优选1.95ml/g；每次萃取所用石油醚a与水a的体积比为1:1；水a就是指水，此处用水a表示只是为了方便描述，无特殊含义；石油醚a就是指石油醚，此处用石油醚a表示只是为了方便描述，无特殊含义；
(3)取步骤(2)中所得有机相减压浓缩，硅胶柱层析，依次用体积比为20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶液进行梯度洗脱，每个梯度分别洗脱2个柱体积；
(4)取步骤(3)中体积比为5:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶液洗脱部分，减压浓缩后以mci为柱层析填料，依次用体积分数为55％、65％、75％、85％、95％的甲醇水溶液以及甲醇进行第一次梯度洗脱，收集第一次梯度洗脱液以体积比为2:1的石油醚与丙酮的混合溶剂为展开剂进行tlc检测，rf值为0.4的第一次梯度洗脱液合并并减压蒸干得第一部分，rf值为0.6的第一次梯度洗脱液合并并减压蒸干得第二部分；
(5)取步骤(4)中所述第一部分通过粗硅胶柱层析依次用体积比为6:1、5:1、4:1、3:1、2:1和1:1的石油醚/丙酮混合液进行第二次梯度洗脱，收集第二次梯度洗脱液，以体积比为2:1的石油醚与丙酮的混合溶剂为展开剂进行tlc检测，合并rf值为0.4的第二次梯度洗脱液，浓缩后析出晶体，即得化合物1；
(6)取步骤(4)中所述第二部分通过硅胶柱层析用体积比为10:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行第三次洗脱，收集第三洗脱液，以体积比为2:1的石油醚与丙酮的混合溶剂为展开剂进行tlc检测，合并rf为0.6的第三次洗脱液，浓缩后析出晶体得到化合物2。
优选地，步骤(1)用体积分数为95％的乙醇水溶液浸提3次，每次7天。
进一步优选地，步骤(1)每次浸提的乙醇水溶液的体积以所述甘遂块根的质量计为2l/kg。
优选地，步骤(3)中所述硅胶柱为100-200目硅胶柱，
优选地，步骤(6)中所述硅胶柱为500目硅胶柱。
本发明还提供一种上述式1或式2所示的假白榄烷类二萜化合物在制备逆转肿瘤耐药性的药物中的应用。
优选地，所述耐药性是肿瘤对阿霉素的耐药性。
优选地，所述肿瘤为mcf-7细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果是，化合物1、2无明显细胞毒性，在起到逆转多药耐药作用时，化合物固有毒性甚微，但能显著增强阿霉素对mcf-7/adr的抑制，逆转倍数可达3.4至85.9不等。两种新型二萜化合物1、2能明显逆转耐药肿瘤细胞mcf-7/adr的耐药性，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，在抗肿瘤多药耐药中具有较好的应用前景。本发明所涉及的化合物不仅为新结构，且对p-gp介导的肿瘤多药耐药性具有良好的抑制作用。涉及的化合物未检测到明显细胞毒性(ic50>20μm)，在与阿霉素联用后，改善了阿霉素耐药的mcf-7肿瘤细胞对阿霉素的敏感性，大幅提高了阿霉素的作用。说明本发明所述的化合物具有较好的安全性并表现出对多药耐药肿瘤潜在的治疗价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：化合物的制备方法
(1)干燥甘遂块根5kg粉碎，粉末用10l体积百分比95％乙醇浸泡，每次浸提的乙醇水溶液的体积以所述甘遂块根的质量计为2l/kg；重复提取3次，每次7天，合并提取液并减压浓缩得到514g提取物；所述的甘遂2016年8月采购自亳州，产地为山西侯马，经鉴定为euphorbiakansui，样品标本有浙江工业大学药学院天然药物研究所保藏，编号为no.20160810。
(2)将所得提取物进行石油醚/水萃取。将步骤(1)所得的甘遂块根提取物514g，加入1l水溶解，用石油醚萃取两次，每次使用1l石油醚，合并有机相，减压浓缩，得到含活性物质的有机相(110g)。
(3)取步骤(2)中含活性物质的有机相，以100-200目，柱体积为500ml的硅胶为柱层析填料，用石油醚/乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的步骤为：体积比20:1；15:1；10:1；5:1；2:1；1:1；0:1的石油醚/乙酸乙酯混合液，每个柱体积分别洗脱1000ml；
(4)取步骤(3)过程中石油醚/乙酸乙酯体积比为5:1洗脱液所在的部分，减压浓缩。以250ml柱体积的mci为柱层析填料，依次用体积分数为55％；65％；75％；85％；95％；100％甲醇水溶液作为洗脱条件，分别洗脱500ml。用石油醚/丙酮2:1的展开剂为条件进行tlc检测，254nm紫外下检测斑点，并在tlc上喷洒体积分数为10％的硫酸乙醇，加热显色，将rf值相近、显色相似的流分合并，取rf值为0.4的部分合并为第一部分，rf值为0.6的为第二部分。并将这两部分分别减压蒸干。
(5)取(4)中第一部分通过粗硅胶柱层析用体积比6:1,5:1,4:1,3:1和2:1的石油醚/丙酮混合液梯度洗脱，以石油醚/丙酮2:1为展开剂进行tlc展开，取rf值为0.4，体积分数为10％的硫酸乙醇显色为黄色斑点的洗脱馏分合并浓缩后，析出晶体得到化合物1。第二部分通过500目硅胶，柱体积为250ml的层析柱，用体积比10：1的石油醚/乙酸乙酯混合液洗脱1000ml，以石油醚/丙酮2:1为展开剂进行tlc展开，取rf值为0.6，10％硫酸乙醇显色为黄色斑点的洗脱馏分合并浓缩后，析出晶体得到化合物2。
假白榄烷类二萜化合物1和2的理化性质及波谱数据
化合物1：无色晶体；易溶于氯仿、丙酮、甲醇；紫外灯下254nm有吸收；esi-ms(positive):m/z713.3[m na] ，hr-esi-ms:m/z713.2560([m na] ,计算值为713.2568)，确定其分子式为c38h42o12；旋光[α]20d＝ 16.0(c＝0.001,chcl3)；ir(kbr)νmax:3477,2974,1714cm-1；uv(meoh)λmax(logε):230.0nm；核磁数据见表1。
表1化合物1的核磁数据
1h-nmr:600mhz；13c-nmr:150mhz；solvent:cdcl3
化合物2：无色晶体；易溶于氯仿、丙酮、甲醇；紫外灯下254nm有吸收；esi-ms(positive):m/z797.3[m na] ，hr-esi-ms:m/z797.2776([m na] ,计算值为797.2780)，确定其分子式为c42h46o14；旋光[α]20d＝-18.0(c＝0.001,chcl3)；ir(kbr)νmax:3479,2928,1750cm-1；uv(meoh)λmax(logε):230.0nm；核磁数据见表2。
表2化合物2的核磁数据
1h-nmr:600mhz；13c-nmr:150mhz；solvent:cdcl3
实施例2：假白榄烷类二萜化合物的体外抗肿瘤多药耐药作用
利用细胞培养液将实施例1中制备的假白榄烷类二萜化合物1和2分别配制成20μm高浓度溶液，评价其对耐阿霉素的mcf-7/adr细胞株的抑制作用，结果显示加入上述两个化合物后，加药组(化合物1和2)细胞数量分别为空白对照的102％和93％，证实其在20μm浓度下未到达半数抑制率，证实其ic50>20μm，说明对mcf-7/adr细胞无明显毒活。
选择对数生长的mcf-7/adr细胞，接种于96孔板，细胞密度约为7×103/孔，实验组为化合物(1或5μm)与系列浓度梯度的阿霉素(0.25μm,0.5μm,1μm,2μm,4μm,8μm,16μm,32μm)联合用药，阳性对照组为维拉帕米(5μm)与上述相同系列浓度阿霉素联合用药，阴性对照组为阿霉素(4μm,8,μm16μm,32μm,64μm,128μm)，每组3个复孔，接种于96孔板，在培养箱中孵育48h。测定阿霉素对mcf-7/adr的ic50(adr)、加入待测物或逆转剂阳性对照药后阿霉素的ic50(p-gp抑制剂 adr)。计算ic50(adr)与ic50(p-gp抑制剂 adr)比值，即得逆转倍数(reversalfold)。实验结果见表3。
实验结果显示，在此评估方法中，假白榄烷类二萜(化合物1、2)在低浓度(1μm)和高浓度(5μm)下均具有显著的逆转肿瘤多药耐药性活性，且表现出逆转肿瘤多药耐药性活性的有效浓度远低于其表现细胞毒性的浓度(ic50>20μm)。
本发明采用人乳腺癌阿霉素耐药细胞株mcf-7/adr作为活性筛选细胞株，以mtt法测定在化合物1、2分别与阿霉素联合用药，考查其分别对该细胞的逆转指数，探究这两个化合物对肿瘤多药耐药的逆转作用。实验结果显示，化合物1、2无明显细胞毒性，在起到逆转多药耐药作用时，化合物固有毒性甚微，但能显著增强阿霉素对mcf-7/adr的抑制，逆转倍数可达3.4至85.9不等。
表3假白榄烷二萜化合物在mcf-7/adr中的细胞毒和逆转能力
1.如式1或式2所示的假白榄烷类二萜化合物，
2.一种如权利要求1所述的式1或式2所示的假白榄烷类二萜化合物的提取方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
(1)取甘遂块根粉碎，室温条件下，用体积分数为95％的乙醇水溶液浸提，合并提取液，减压浓缩，得甘遂块根提取物；
(2)将步骤(1)得到的甘遂块根提取物用水a溶解后，用石油醚a萃取两次，合并有机相；所述水a的体积以甘遂块根提取物的质量计为1.95～2ml/g；每次萃取所用石油醚a与水a的体积比为1:1；
(3)取步骤(2)中所得有机相减压浓缩，硅胶柱层析，依次用体积比为20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶液进行梯度洗脱，每个梯度分别洗脱2个柱体积；
(4)取步骤(3)中体积比为5:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶液洗脱部分，减压浓缩后以mci为柱层析填料，依次用体积分数为55％、65％、75％、85％、95％的甲醇水溶液以及甲醇进行第一次梯度洗脱，收集第一次梯度洗脱液以体积比为2:1的石油醚与丙酮的混合溶剂为展开剂进行tlc检测，rf值为0.4的第一次梯度洗脱液合并并减压蒸干得第一部分，rf值为0.6的第一次梯度洗脱液合并并减压蒸干得第二部分；
(5)取步骤(4)中所述第一部分通过粗硅胶柱层析依次用体积比为6:1、5:1、4:1、3:1、2:1和1:1的石油醚/丙酮混合液进行第二次梯度洗脱，收集第二次梯度洗脱液，以体积比为2:1的石油醚与丙酮的混合溶剂为展开剂进行tlc检测，合并rf值为0.4的第二次梯度洗脱液，浓缩后析出晶体，即得化合物1；
(6)取步骤(4)中所述第二部分通过硅胶柱层析用体积比为10:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行第三次洗脱，收集第三次洗脱液，以体积比为2:1的石油醚与丙酮的混合溶剂为展开剂进行tlc检测，合并rf为0.6的第三次洗脱液，浓缩后析出晶体得到化合物2。
3.如权利要求2所述的式1或式2所示的假白榄烷类二萜化合物的提取方法，其特征在于：步骤(3)中所述硅胶柱为100-200目硅胶柱。
4.如权利要求2所述的式1或式2所示的假白榄烷类二萜化合物的提取方法，其特征在于：步骤(6)中所述硅胶柱为500目硅胶柱。
5.如权利要求2所述的式1或式2所示的假白榄烷类二萜化合物的提取方法，其特征在于：步骤(2)中所述水a的体积以甘遂块根提取物的质量计为1.95ml/g。
6.如权利要求2所述的式1或式2所示的巨大戟二萜化合物的提取方法，其特征在于步骤(1)用体积分数为95％的乙醇水溶液浸提3次，每次7天。
7.如权利要求2所述的式1或式2所示的巨大戟二萜化合物的提取方法，其特征在于步骤(1)每次浸提的乙醇水溶液的体积以所述甘遂块根的质量计为2l/kg。
8.一种如权利要求1所述的式1或式2所示的假白榄烷类二萜化合物在制备逆转肿瘤耐药性的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述耐药性是肿瘤对阿霉素的耐药性。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为mcf-7细胞。
技术总结