本发明属于笼锁化合物领域，具体涉及2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
笼锁化合物是指小的生物活性分子通过共价键与一个惰性的化合物(笼锁部分)相结合所生成的产物。结合后，小的生物活性分子就会失去活性，然而该共价键对光线是敏感的，在一定波长的光线照射下，共价键会断裂，释放出小的生物活性分子，使其发挥作用。这一光活化过程称为光解笼锁。
目前已研发成功的笼锁物质大都是些神经递质或者配体比如：mni-caged-l-glutamate，mni-caged-nmda，mni-cagedkainicacid，cnvdopamine，rubi-gaba(rialverdeetal.,2008)等；能量物质比如：dmnpe-cagedatpdiammoniumsalt；一些重要的离子比如：dmnpe-4am-caged-calcium，npe-caged-proton，npe-caged-hpts或者是特定受体的阻断剂/激动剂比如：npec-caged-d-ap5，mni-caged-d-aspartate，npec-caged-ly379268等。这些笼锁物质只能作用于特定受体用于研究经典神经传递和受体介导生理生化过程。
在神经科学领域中应用最广泛的是笼锁神经递质。目前笼锁神经递质研究最多的是笼锁γ-氨基丁酸(caged-gaba)和笼锁谷氨酸(caged-glu)。光解笼锁神经递质的基本工作原理是：笼锁γ-氨基丁酸或笼锁谷氨酸在吸收特定波长的光线后，与神经递质结合的共价键就会断裂释放出γ-氨基丁酸或谷氨酸，从而使与其相应的受体结合来发挥生物学效应。
选择恰当的笼锁神经递质是光解笼锁应用的关键，一种理想的笼锁神经递质要想发挥好的效应，应具有以下特征：(1)在生理ph下，具有良好的水溶性；(2)具有良好的稳定性，不能水解；(3)光解释放快速高效，能满足突触时间对递质释放的时间和浓度需求；(4)笼锁化合物质、反应中间产物以及光解的副产物均应完全为惰性，且对相应的受体、转运体和释放的神经递质代谢等都没有影响；(5)应尽可能在较长的光线下进行光解，以增强光线对组织的穿透性及避免对细胞造成伤害。
神经活动中，蛋白质的翻译修饰具有重要作用。常见的蛋白质翻译修饰主要有磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化等。其中蛋白质棕榈酰化修饰是一种广泛存在并唯一可逆的翻译后脂质共价修饰，经过棕榈酰化修饰的蛋白质疏水性增加，这对蛋白质的转运、膜功能的稳定、受体的膜质迁移、细胞器定位和功能等都具有重要的作用。深入探讨蛋白质棕榈酰化修饰的调控机制，对理解复杂信号转导通路意义重大。
传统研究棕榈酰化蛋白的方法主要是采用蛋白裂解液进行abe/rac检测，间接检测蛋白质棕榈酰化修饰水平，该方法误差大，可重复性差，处理过程繁杂样品损失量大，不能反映细胞内蛋白棕榈酰化变化的原位信息。由于缺乏专门检测蛋白质棕榈酰化水平的抗体，更无法进行免疫组化实验。
目前，由于缺乏相应的工具药物，对于蛋白质棕榈酰化在调控神经活动中扮演的角色并不十分清楚。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物，可用于蛋白质棕榈酰化调控神经活动的机制研究。
本发明的第二个目的在于上述2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供上述2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物的应用。
为实现上述目的，本发明的2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物的技术方案是：
2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物，具有式(1)所示结构：
式(1)中，r1选自c1-3的烷氧基；r2选自氢或硝基。
本发明的2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物，硝基二氢吲哚结构与2-溴十六烷酸通过共价键结合形成笼锁化合物，该笼锁化合物在一定波长下可受激发并光解，释放2-溴十六烷酸，可用于蛋白质棕榈酰化修饰过程调节神经可塑性的机制研究。
优选的，2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物为2-溴-1-(4-甲氧基-7-硝基二氢吲哚)十六烷酮，结构式如下：
本发明的2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物的制备方法的技术方案是：
2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物的制备方法，包括以下步骤：式(2)所示的硝基二氢吲哚化合物、2-溴十六烷酸、氯化亚砜在溶剂中于60-100℃下搅拌反应；
优选的，搅拌反应的时间为2-24h。
为保证原料较高的反应收率，优选的，式(2)所示的硝基二氢吲哚化合物、2-溴十六烷酸、氯化亚砜的摩尔比为1:(1-2):(1-2)。
反应溶剂可选择甲苯。式(2)所示的硝基二氢吲哚化合物在甲苯中的浓度可选择1-10mol/l。达到反应时间后进行后处理。具体的后处理可将反应体系降温冷却至室温后用饱和nahco3溶液在0℃淬灭。之后加入乙酸乙酯，并用饱和食盐水萃取3次，有机相加无水na2so4干燥。过滤除去na2so4，滤液减压浓缩得到产物。产物可经反相液相色谱法进一步纯化，得目标化合物。
下面对上述2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物的应用情形进行说明。
2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物具有光解笼锁特性，利用该特性，可利用双光子显微镜在激发波长下受激发并光解，实现定点精准释放，对于研究蛋白质棕榈酰化过程如何调节突触可塑性这一科学问题提供了有力工具。
优选的，光解笼锁的激发波长为690-1040nm。
2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物在光子成像中的应用。
在光子成像技术中，利用上述2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物可实现受特定波长光激发并光解，从而可以用于神经调控活动方面的研究。
2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物在蛋白质棕榈酰化调控神经活动方面的应用。
优选的，所述调控神经活动包括神经元树突棘形态结构的变化和/或突触可塑性的调节。
不同笼锁物质只能作用于特定受体，利用上述2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物可用于研究蛋白质棕榈酰化受阻对树突棘形态和胞内钙离子浓度变化的影响，从而为研究神经可塑性的调节创造良好条件。
附图说明
图1为本发明实施例2所得化合物的1h-nmr图；
图2为本发明实施例2所得化合物的lc-ms检测结果；
图3为本发明实施例2所得化合物的hplc-pda色谱图；
图4为本发明实施例2所得化合物的hplc-elsd色谱图；
图5为应用实施例2所得化合物进行双光子成像得到的解笼锁前后突触形态的对比变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的实施方式作进一步说明。
一、本发明的2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物的具体实施例
实施例1
本实施例的2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物，结构式为：
在其他实施例中，对应式(1)，r2可以为硝基，r1可以为乙氧基或丙氧基。
二、本发明的2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物的制备方法的具体实施例
实施例2
本实施例的2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物的制备方法，对实施例1的化合物的制备过程进行说明，具体包括以下步骤：
1)将1g4-甲氧基-7-硝基-2,3-二氢吲哚(4.892mmol,1.00equiv,95％)和2.59g2-溴十六烷酸(7.338mmol,1.5equiv,95％)溶于10ml甲苯中，加入氯化亚砜(0.92g,7.338mmol,1.5equiv,95％)，80℃下搅拌16h。
2)反应体系降温冷却至室温后用饱和nahco3溶液在0℃淬灭。之后加入乙酸乙酯溶液20ml，并用饱和食盐水萃取3次，无水na2so4干燥。过滤除去na2so4，滤液减压浓缩得到产物。将产物经反相液相色谱法纯化得到目标化合物(mni-caged-2-bp)，纯化条件为：c18填料80g，40-60nm；流动相a:0.05％三氟乙酸水溶液，流动相b：0.05％三氟乙酸乙腈溶液，梯度洗脱10min(洗脱时间程序如表1所示)；检测波长254nm。
本实施例中，反应流程如下所示：
产物2-溴-1-(4-甲氧基-7-硝基二氢吲哚)十六烷酮的化学式为：c25h39brn2o4；准确分子量(exactmass):510.21；摩尔分子量(molecularweight):511.49。
在其他实施例中，选择4-乙氧基-7-硝基-2,3-二氢吲哚、4-丙氧基-7-硝基-2,3-二氢吲哚、4-甲氧基-5,7-二硝基-2,3-二氢吲哚作为硝基二氢吲哚化合物进行反应，可得到相应的目标化合物。
其中，r1为c1-3的烷氧基时除影响其化合物极性外，并未对解笼锁性质产生影响；r2为硝基时，笼锁物质的光解过程的量子产率提高5-6倍。
三、实验例
实验例1
对实验例2所得化合物进行1h-nmr，结果如图1所示。
h1-nmr(dmso-d6,400mhz)δ(ppm):谱低场区出现2个苯环氢信号：δh7.79(1h,d,j＝8.8hz,h-2),δh6.97(1h,d,j＝8.8hz,h-1)。谱高场区出现两个甲基信号：δh3.97(3h,s,h-3),δh0.83(3h,t,j＝6.8hz,h-20),1个次甲基信号：δh4.93(1h,t,j＝7.2hz,h-6),4个亚甲基信号,δh4.36-4.25(2h,m,h-5),δh3.06(2h,t,j＝8.0hz,h-4),δh2.07-1.90(2h,m,h-7),δh1.46-1.15(24h,m,h8-h19)。
实验例2
对实验例2所得化合物进行lc-ms检测。
色谱条件：样品经dmso溶解，经c18反相ods高效液相色谱柱(halo90ac18；长度：30mm；内径：3.0mm；类型：20μμ)分离。采用二元梯度洗脱(流动相a：水/0.05％tfa；流动相b：乙腈/0.05％tfa)。洗脱程序如表1所示。
表1lc洗脱时间程序
采用日本岛津pda检测器(spd-m20a)，lampd2，检测波长范围190-400nm。接口处参数设置为：interface:esi；dltemperature:250℃；nebulizinggasfrow:1.50l/min；heatblock:250℃；dryinggas:on15.00l/min。质谱离子源模式采用电喷雾电离正离子模式，检测电压为 1.15kv；threshold：20，扫描速度：1667μ/sec。
lc-ms检测结果如图2所示：(es,m/z):511,513[m h] ，与目标化合物分子量一致。
经高效液相色谱仪-二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器联用(hplc/pda/elsd)检测结果如下：在hplc-pda色谱图(如图3所示，检测波长254nm)中标定了2个峰，保留时间rt分别为0.891，0.921；峰高分别为1066092.000，6318.000，峰高％分别为99.411，0.589；峰面积积分分别为929685，6434，峰面积％分别为99.313，0.687；
hplc-elsd色谱图(如图4所示)中标定了2个峰，保留时间rt分别为0.109，0.894；峰高分别为7197.000，251531，峰高％分别为2.728，97.218；峰面积积分分别为17628，711083，峰面积％分别为2.426，97.574。根据峰面积归一化法计算，目标化合物纯度为97.6％。
根据以上检测结果，可以证明目标化合物的合成。
实验例3mni-caged-2-bp在双光子成像领域的应用
培养神经元细胞并进行质粒转染或离体脑切片经过特异性染色，利用双光子显微镜特定波长条件下成像。
将mni-caged-2-bp溶解于人工脑脊液中(126mmnacl,3mmkcl,1.25mmnah2po4,2mmmgso4,24mmnahco3,2mmcacl2,10mm葡萄糖，95％o2/5％co2持续饱和)，室温条件下以1ml/min流速持续灌流给药。利用声光驱动双光子显微镜高速活体成像系统(femtonics，波长690-1040nm,hungary)，经25×水镜(mrd77220,镜口率:1.10,工作距离:2mm,nikon,japan)拍摄。解笼锁操作按照以下3个步骤进行：
①ao模式下选择roi并进行xyz层扫。分辨率为512x512，zstep为0.4μm，zdepth为1-3μm，激光波长为920nm，功率为1.85w。
②持续灌流mni-caged-2bp5-10min，在同一焦点平面，切换到galvo模式，在linescan模式下激发设置波长为720nm使mini-caged-2-bp在roi的树突棘位置精准发生解笼锁，扫描频率为0.1-100hz，功率为2.08w。
③再次进行xyz层扫，同步骤1一致。检测解笼锁前后2-bp引起的细胞内蛋白质棕榈酰化受阻对树突棘形态和胞内钙离子浓度变化的影响。图片经过mesv.6.3.7480(femtonicsltd,hungary)软件处理结果如图5所示。
由图5可知，通过对神经元进行gfp转染标记树突棘，经过720nm激光解笼锁操作后，释放2-bp使荧光减弱，树突棘收缩。表明抑制蛋白的棕榈酰化修饰，引起树突棘形态可塑性变化。
综合以上内容，本发明提供的笼锁化合物，可作为一种新的工具药物使用，借助双光子显微镜在720nm波长下受激发并光解，实现定点精准释放，对于研究蛋白质棕榈酰化过程如何调节突触可塑性提供了有力工具。
1.2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物，其特征在于，具有式(1)所示结构：
式(1)中，r1选自c1-3的烷氧基；r2选自氢或硝基。
2.2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物，其特征在于，具体为2-溴-1-(4-甲氧基-7-硝基二氢吲哚)十六烷酮。
3.一种如权利要求1或2所述的2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：式(2)所示的硝基二氢吲哚化合物、2-溴十六烷酸、氯化亚砜在溶剂中于60-100℃下搅拌反应；
4.如权利要求3所述的2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物的制备方法，其特征在于，搅拌反应的时间为2-24h。
5.如权利要求3或4所述的2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物的制备方法，其特征在于，式(2)所示的硝基二氢吲哚化合物、2-溴十六烷酸、氯化亚砜的摩尔比为1:(1-2):(1-2)。
6.一种如权利要求1或2所述的2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物在光解笼锁方面的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，光解笼锁的激发波长为690-1040nm。
8.一种如权利要求1或2所述的2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物在光子成像中的应用。
9.一种如权利要求1或2所述的2-溴-1-(7-硝基二氢吲哚)十六烷酮化合物在蛋白质棕榈酰化调控神经活动方面的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述调控神经活动包括神经元树突棘形态结构的变化和/或突触可塑性的调节。
技术总结