本发明涉及乳杆菌和鲁氏接合酵母协同发酵豆瓣酱的方法，属于生物工程发酵技术领域。
背景技术：
豆瓣酱是我国一种传统的发酵调味品，通常以蚕豆、面粉和盐为主要原料，经曲霉、酵母及细菌等多种微生物发酵而成。传统豆瓣酱的生产是一个多菌种混合固态发酵的开放式过程，主要包括两部分。首先是原料预处理后接种纯种米曲霉进行2～3天的通风制曲。然后是自然发酵，将成曲在陶瓷大缸中与盐水混合后再次发酵，日晒夜露3～5个月，发酵期间进行人工翻醅，是豆酱制作过程中的主要步骤。在漫长的发酵过程中，蚕豆和面粉中的蛋白质、淀粉、脂肪等成分在米曲霉分泌的各种酶的作用下分解成糖、氨基酸等小分子，然后细菌和酵母利用这些小分子进一步合成各种风味化合物，最终形成了酱独特的风味。其中氨基酸态氮、可滴定酸度、游离氨基酸和挥发性风味物质含量是衡量豆类发酵食品品质的重要指标。
最近，人们越来越关注乳酸菌和酵母的共培养，其被广泛用于葡萄酒、奶酪、酱油和其他产品的发酵。先前的研究表明乳酸菌和酵母的共培养有助于豆类发酵食品的生产，其中鲁氏接合酵母(zygosaccharmycesrouxii)是最主要的酵母，融合魏斯式乳杆菌(weissellaconfusa)和嗜盐四联球菌(tetragenococcushalophilus)是豆类发酵食品中最常见的乳酸菌。因豆类发酵食品生产工艺或发酵阶段的不同，乳酸菌的多样性和分布在不同的地区或国家会有所差别。之前的研究主要研究了鲁氏接合酵母与嗜盐四联球菌的共培养对酱油质量的影响，然而在豆瓣酱等酱类发酵食品中嗜盐四链球菌的丰度极低，因此其在豆瓣酱等食品的发酵中所起的作用较小。在豆瓣酱等酱类食品的发酵过程中，其中主要存在的乳酸菌为魏斯氏乳杆菌，然而近年来对融合魏斯式乳杆菌的功能以及起与鲁氏接合酵母在豆瓣酱等酱类发酵食品中的共同发酵缺乏了解。
技术实现要素：
针对以上问题，本发明提出一种乳酸菌和酵母协同发酵豆瓣酱的方法，并比较了常见乳酸菌(融合魏斯式乳杆菌和嗜盐四联球菌)和鲁氏接合酵母的环境耐受性、代谢功能以及协同发酵对豆瓣酱品质的影响，最终提高了产品的关键理化指标，有效的改善了豆酱的风味与品质。
本发明提供了一种制备豆瓣酱的方法，利用鲁氏结合酵母(zygosaccharomycesrouxii)和融合魏斯氏乳杆菌(weissellaconfusa)协同发酵生产豆瓣酱。
在本发明的一种方式中，将所述鲁氏结合酵母和融合魏斯氏乳杆菌添加至酱醅中发酵，所述鲁氏结合酵母和融合魏斯氏乳杆菌的比例为(1:10)～(1:1)。
在本发明的一种方式中，所述鲁氏结合酵母菌的添加量不低于105cfu/g。
在本发明的一种方式中，所述融合魏斯氏乳杆菌的添加量为不低于106cfu/g。
在本发明的一种方式中，所述酱醅的制备方法为在成曲拌入盐水开始发酵时以低于105cfu/g的量加鲁氏接合酵母，以不低于106cfu/g的量加入融合魏斯氏乳杆菌。
在本发明的一种方式中，酱醅中的盐度为80-100g/l。
在本发明的一种方式中，在30℃发酵。
在本发明的一种方式中，总共发酵6-8周，前7天每天进行翻醅，之后每隔7天进行翻醅一次。
本发明提供了所述方法在制备豆类发酵食品中的应用。
在本发明的一种方式中，所述豆类发酵食品包括豆瓣酱、酱油、黄豆酱、甜面酱。
有益效果：
本发明提供的乳酸菌和酵母协同发酵方法，采用了魏斯式乳杆菌和鲁氏接合酵母共培养，使用此方法制备得到的酱醅中氨基酸态氮和游离氨基酸形成的速率和含量更高，特别是谷氨酸和天冬氨酸，其可以赋予酱醅以鲜味；且使得酱醅中的可滴定酸也控制在较好的范围内，降低了酱醅中的酸味；酯类、羰基类、酚类等风味物质也显著提升，赋予酱醅以焦香、奶酪、丁香等气味，提升了豆瓣酱的品质及口感。
生物材料保藏
嗜盐四联球菌，分类命名为嗜盐四联球菌tetragenococcushalophilus，已于2020年07月29日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmccno.20466，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1是乳酸菌和酵母的对不同环境压力的耐受性图；(a)：盐度耐受性；(b)：ph耐受性；(c)：温度耐受性；z为鲁氏接合酵母；w为魏斯式乳杆菌；t为嗜盐四联球菌。
图2是乳酸菌和酵母的代谢特性图；ck为对照；z为鲁氏接合酵母；w为魏斯式乳杆菌；t为嗜盐四联球菌；(a)：氨基酸态氮和可滴定酸度；(b)：游离氨基酸；(c)：挥发性风味物质。
图3是乳酸菌和酵母协同发酵豆瓣酱的发酵特性图；(a)为可滴定酸；(b)为氨基酸态氮；(c)为游离氨基酸；(d)为挥发性风味物质；a为未接种乳酸菌和酵母的豆瓣酱酱醅；a-z为仅接种了鲁氏接合酵母样品；a-w为仅接种了魏斯式乳杆菌样品；a-t为仅接种了嗜盐四联球菌样品；a-wz为同时接种了魏斯式乳杆菌和鲁氏接合酵母样品；a-tz为同时接种了嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母样品。
图4是乳酸菌和酵母协同发酵豆瓣酱的感官评估图；(a)为味觉的感官评价；(b)为香气的感官评价。
具体实施方式
融合魏斯式乳杆菌(weissellaconfusa)公开于授权公告号为cn103571782b的专利文献中。
米曲霉3.042从商业渠道购得。
鲁氏接合酵母(zygosaccharomycesrouxii)公开于公开号为cn111248409a的专利文献中。
pda培养基：马铃薯200g加水蒸煮过滤，加入葡萄糖20克，琼脂20克，采用去离子水定容至1l。
ypd培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，采用去离子水定容至1l。
mrs培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，磷酸氢二钾2g，吐温-801.0ml，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，采用去离子水定容至1l。
将蚕豆在121℃高压蒸煮变性后冷却至室温，与小麦粉充分混合(3:1，w/w)，并以106个孢子/g的接种量接种米曲霉，在30℃下培养60h后制得成曲。
在成曲拌入盐水开始发酵时以105cfu/g的接种量接入鲁氏接合酵母，以106cfu/g的接种量接入融合魏斯氏乳杆菌和嗜盐四联球菌。发酵过程盐度为8-10％(w/v)，在30℃发酵6周，第一周每天进行翻醅，之后每隔7d进行翻醅一次。
可滴定酸：采用酸碱滴定法测定了以乳酸为代表的可滴定酸。具体步骤参照gb/t5009.40-2003《酱卫生标准的分析方法》。
氨基酸态氮：采用甲醛滴定法测定了氨基酸态氮含量。具体步骤参照gb5009.235-2016《食品中氨基酸态氮的测定》。
游离氨基酸：采用高效液相色谱法测定了游离氨基酸。具体步骤参照王宗敏的博士论文《镇江香醋醋酸发酵阶段菌群结构变化与风味物质组成之间的相关性研究》。
挥发性风味物质：采用气相色谱-质谱联用顶空固相微萃取技术(hs-spme/gc-ms)测定酱醅中的挥发性风味物质含量。准确称取2g左右酱醅于15ml固相微萃取瓶中，分别先后加入2g固体nacl，6ml脱二氧化碳的水，并加入2-辛醇内标，放入转子后拧紧盖子并放入55℃带有磁力搅拌器的恒温水浴锅中。使用spme纤维萃取头吸附挥发物40min，然后在气相色谱仪(tracegc-1310-isqlt)的进样口中于250℃的条件下解吸5min。挥发性化合物的分离在db-wax毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)上进行。gc柱箱的初始温度在40℃下保持2min，然后以5℃/min的速度升至230℃，并在最终温度下保持8min。以1.2ml/min的氦气作为载气。ms质谱以电子轰击(ei)模式操作，离子源温度为260℃，电离电压为70ev。质量扫描范围为25-500amu，扫描速率为0.2scan/s。通过将质谱与nist谱库和wiley谱库进行匹配来进行化合物鉴定。根据特定化合物的峰面积与内标2-辛醇的峰面积之比计算化合物的含量。
实施例1：菌株的培养
将米曲霉接种于pda斜面培养基上，于28℃静置培养2-3d。
将鲁氏接合酵母以1ml/100ml的接种量接种于ypd液体培养基中，于30℃、200rpm震荡培养至对数生长中后期。
将融合魏斯式乳杆菌以1ml/100ml的接种量接种于mrs液体培养基中，于35℃静置培养至对数生长中后期。
将嗜盐四联球菌以1ml/100ml的接种量接种于含8ml/100mlnacl的mrs液体培养基中，于30℃静置培养至对数生长中后期。
实施例2：菌株对环境耐受性
(1)菌株在不同盐浓度和ph下的生长
将鲁氏接合酵母、嗜盐四联球菌和魏斯式乳杆菌分别以2ml/100ml接种量接种于不同盐浓度(0、4、8、12、16％)和ph(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)的培养基中30℃静置培养3天后，将培养液梯度稀释涂布于ypd或mrs平板，30℃培养3d后对各菌株的cfu活菌数进行计数，测定各菌株在不同条件下的生长状况。
如图1所示，魏斯式乳杆菌可以在0-8％(g/100ml)的盐度条件下有效生长，鲁氏接合酵母可以在0-12％的盐度下生长。而嗜盐四联球菌仅当盐度大于4％时，才能生长得更好，且高盐度对其生长没有显着影响。
此外，魏斯式乳杆菌和鲁氏接合酵母在ph4.5-7.0时生长良好，而嗜盐四联球菌的生长在ph小于5.0时受到显着抑制。
(2)菌株在不同温度下的生长
将鲁氏接合酵母、嗜盐四联球菌和魏斯式乳杆菌分别以2ml/100ml接种量接种于ypd(鲁氏接合酵母)、mrs(嗜盐四联球菌和魏斯式乳杆菌)培养基中在不同温度下(10、15、20、25、30、35℃)静置培养3天后，对各菌株的cfu活菌数进行计数，测定各菌株在不同条件下的生长状况。
如图1所示，鲁氏接合酵母可以在15-35℃下有效生长，魏斯式乳杆菌具有最宽的温度生长范围(10-35℃)，而嗜盐四联球菌在低温(10-15℃)下几乎不能生长。
实施例3：菌株的对风味及营养物质的生产性能
采用体外混合培养发酵法：
将10g蚕豆粉、2.5g小麦粉、50g新鲜酱醅和80g氯化钠加入1.0l去离子水中煮30min，过滤后取上清，将上清液分装至三角瓶后通过115℃灭菌制成模拟液体培养基。然后将鲁氏接合酵母、魏斯式乳杆菌、嗜盐四联球菌分别接种到液体培养基中，模拟豆瓣酱的发酵过程，每个菌种的初始细胞密度设置为1×106cfu/g。在30℃下进行3天，发酵结束后对单菌发酵液的风味物质进行了检测，以未接种的发酵培养基为对照品。所有实验均进行三次平行实验。如图2所示，魏斯式乳杆菌和嗜盐四联球菌可产生有机酸，这进一步导致了ph的降低。另外，魏斯式乳杆菌显示出较高的氨基酸和氨基酸态氮产生能力。并且，在接种鲁氏接合酵母的培养基中，酯类和醇类化合物显着增加。
实施例4：融合魏斯式乳杆菌和鲁氏接合酵母协同发酵在豆酱发酵中的应用
将蚕豆在121℃高压蒸煮变性后冷却至室温，与小麦粉充分混合(3：1，w/w)，并以106个孢子/g的接种量接种米曲霉，在30℃下培养60h后制得成曲。在成曲拌入盐水(约20％，200g/l，使得混合后的酱醅含盐量在8％-12％，即含盐量为80-120g/l)开始发酵时以105cfu/g的接种量接入鲁氏接合酵母，以106cfu/g的接种量接入融合魏斯氏乳杆菌和嗜盐四联球菌。在30℃条件下发酵6周，每隔7天，取混匀后的醅测定其中的可滴定酸、氨基酸态氮、游离氨基酸和挥发性风味物质，用以评价豆瓣酱的品质。
结果如图3a所示，嗜盐四联球菌及其与鲁氏接合酵母共培养的产酸能力远高于魏斯式乳杆菌及其共培养的产酸能力。然而，过高的酸度会使豆瓣酱酸味突出，降低豆瓣酱质量。而魏斯式乳杆菌及其共培养的氨基酸态氮和游离氨基酸形成的速率和含量更高，特别是谷氨酸和天冬氨酸(图3b、图3c和表1)，其可以赋予酱醅以鲜味。虽然单独添加魏斯式乳杆菌的氨基酸含量会稍高于魏斯式乳杆菌与鲁氏接合酵母的组合，但差异并不明显。与此同时，魏斯式乳杆菌单独接菌及其与鲁氏接合酵母共培养所得酱醅的可滴定酸度显著低于嗜盐四联球菌及其与鲁氏接合酵母共培养所制得的酱醅。由此可见，在豆瓣酱发酵过程中，和嗜盐四联球菌及其与鲁氏接合酵母相比，魏斯式乳杆菌与鲁氏接合酵母的组合能够更显著提高成品酱醅的品质。
表1乳酸菌和酵母协同发酵豆瓣酱的鲜味氨基酸含量(g/100g)
与单一的鲁氏接合酵母相比，乳酸菌(魏斯式乳杆菌和嗜盐四联球菌)和鲁氏接合酵母的共培养产生更多的挥发性风味物质，尤其是酸类和酯类(图3d)。魏斯式乳杆菌和鲁氏接合酵母的共培养组中其豆瓣酱关键挥发性风味物质(酯类、羰基类、酚类等)的含量显著高于嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母共培养组。酯类化合物具有水果和花香的气味，羰基类和酚类化合物可以在较低的浓度下赋予酱醅以焦香、奶酪、丁香等复杂的气味(表2)，是豆瓣酱的关键性挥发性风味物质。由此可见，尽管嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母共培养组含有更高含量的总挥发性风味物质含量，但是魏斯式乳杆菌和鲁氏接合酵母共培养组中含有更多的关键性风味物质，因此其更有助于提高豆瓣酱的风味。
表2乳酸菌和酵母协同发酵豆瓣酱酱醅中挥发性风味物质含量分析(mg/kg)
此外，嗜盐四联球菌及其共培养组的感官评价显示出较高的酸味和醇味，而魏斯式乳杆菌及其共培养组则具有较高的鲜味、果味和烟熏味(图4)，结果与上述理化代谢产物的测定一致。总的来说，良好的味道和香气与高含量的鲜味氨基酸、低含量的酸度和令人愉悦的醇酯化合物有关。由于过高的酸度会抑制酶的活性，导致豆瓣酱的氨基酸态氮含量降低和酱醅酸化，影响豆酱的品质及口感。因此从感观评价和理化代谢方面来讲，魏斯式乳杆菌比嗜盐四联球菌更适合于豆瓣酱的发酵。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
1.一种制备豆瓣酱的方法，其特征在于，利用鲁氏结合酵母(zygosaccharomycesrouxii)和融合魏斯氏乳杆菌(weissellaconfusa)协同发酵生产豆瓣酱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述鲁氏结合酵母和融合魏斯氏乳杆菌添加至酱醅中发酵，所述鲁氏结合酵母和融合魏斯氏乳杆菌的比例为(1:10)～(1:1)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述鲁氏结合酵母菌的添加量不低于1.0×105cfu/g。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述融合魏斯氏乳杆菌的添加量为不低于1.0×106cfu/g。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酱醅的制备方法为在成曲拌入盐水开始发酵时以低于105cfu/g的量加鲁氏接合酵母，以不低于106cfu/g的量加入融合魏斯氏乳杆菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，酱醅中的盐度为80-120g/l。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在30℃发酵。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，总共发酵6-8周，前7天每天进行翻醅，之后每隔7天进行翻醅一次。
9.权利要求1-8任一所述方法在制备豆类发酵食品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述豆类发酵食品包括豆瓣酱、酱油、黄豆酱、甜面酱。
技术总结