本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种制备左旋吡喹酮手性中间体的方法及组合物。
背景技术：
吡喹酮是人工合成的吡嗪异喹啉衍生物，又名环吡喹酮，白色或类白色结晶粉末，味苦，是世界公认的高效广谱抗寄生虫药物，广泛用于治疗日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫、华支睾吸虫病、肺吸虫病、孟氏裂头蚴、姜片虫、包虫、绦虫和囊虫等疾病。它具有抗虫谱广、疗效高、毒性低、疗程短及使用方便等优点。除用于人体外，它也广泛用于动物、家禽等的抗寄生虫治疗。吡喹酮的问世是寄生虫病化疗史上的一项重大突破，30余年来仍然是市场上治疗多种寄生虫病的首选药物。
吡喹酮是由左旋和右旋吡喹酮共同组成的外消旋化合物，科研人员从合成吡喹酮中拆分获得左旋吡喹酮和右旋吡喹酮光学异构体，并通过临床前和初期临床试验发现：左旋吡喹酮是吡喹酮的有效杀虫成分，而右旋吡喹酮是无效甚至有害成分；相同剂量下，左旋吡喹酮临床疗效比吡喹酮更好，右旋吡喹酮则几乎无疗效，味苦，而且是药物副作用的主要产生来源。对心脏的毒性左旋体比右旋体低，因此开发左旋吡喹酮代替吡喹酮，将具有疗效更高，毒副作用更少，服药依从性更好的临床应用价值。
目前左旋吡喹酮的合成主要有：
1、化学拆分：采用消旋中间体或消旋吡喹酮为原料，通过化学拆分合成左旋吡喹酮，操作繁琐，收率低，剧毒原料及重金属以及高温高压、环境污染严重(resolutionofpraziquantel，matthewh.todd1，australia,plos，neglectedtroplcaldiseases,september2011|volume5|issue9|e1260；
2、化学酶催化工艺技术：改进传统化学方法安全环保的不足之处，解决化学法生产左旋吡喹酮时采用消旋吡喹酮及其中间体中危险和污染的问题，相对于化学法，其优势在于避免了剧毒原料氰化钠及重金属使用，避免高温高压等危险反应，减少有机溶剂用量，降低消除了吡喹酮及其中间体生产对于环境的污染；
1,2,3,4-四氢异喹啉(thiq)作为一种特殊的杂环骨架，存在于许多天然的生物碱中，许多临床药物都以thiq为核心骨架，它们具备各种有效的治疗活性。手性1,2,3,4-四氢异喹啉类化合物是其中一类非常重要的药物中间体，近年也被广泛应用于多种手性药物的合成，例如(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸是合成广谱型抗寄生虫药物左旋吡喹酮的重要手性中间体(中国专利201310487924.4)，而由(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸为起始化合物合成的右旋吡喹酮无相关治疗作用。对于左旋吡喹酮合成工艺及有关物质和含量的检测，目前未见公开报道。因而在工艺研发和产业化的过程中，建立相关检测方法，对于左旋吡喹酮合成的过程中引入的手性关键中间体进行纯度检测和质量控制显得尤为重要。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种改进的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(r)或(s)构型的方法，其能够从始至终实时监测反应体系进行的程度，以达到四种构型以及含量的检测，确保目的产物手性纯度的质量控制。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(r)或(s)构型的方法，所述方法包括以1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯的外消旋体为底物制备(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的步骤；
所述方法还包括通过高效液相色谱检测反应体系中(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸和(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸含量的步骤；
所述高效液相色谱检测所采用的色谱柱为硅胶表面共价键合-奎宁定(8r,9s)-(1r,2r)-环己基氨基磺酸衍生物的两性离子交换型手性柱，采用的流动相为包含甲醇、乙腈、甲酸和二乙胺的混合物。
根据本发明的一些优选且具体的方面，所述流动相由甲醇、乙腈、甲酸和二乙胺构成。
根据本发明的一些优选且具体的方面，所述流动相中，所述甲醇与所述乙腈的体积比为1-9∶1，更优选为1-6∶1，进一步优选为1-3∶1；所述甲酸的添加量为48-52mm，所述二乙胺的添加量为23-27mm。进一步优选地，所述流动相中，所述甲酸的添加量为49-51mm，所述二乙胺的添加量为24-26mm。根据本发明的一个优选且具体的方面，所述流动相中，所述甲酸的添加量为50mm，所述二乙胺的添加量为25mm。
根据本发明的一些优选方面，所述高效液相色谱检测的条件为：所述流动相的流速为0.3-1ml/min，所述手性色谱柱的柱温为5-45℃，检测波长为210-240nm。进一步优选地，所述流动相的流速为0.4-0.5ml/min，所述手性色谱柱的柱温为25-30℃，检测波长为210-220nm。
根据本发明的一些优选且具体的方面，所述方法包括建立外消旋底物标准曲线以及产物标准曲线的步骤；其中，底物标准曲线为：y＝4×109x-42910，r2＝0.9999，0≤x≤0.005mol·l-1，y表示高效液相色谱检测所获得谱图的峰面积，x表示底物的摩尔浓度；产物标准曲线为：y＝6×109x 52538，r2＝0.9999，0≤x≤0.005mol·l-1，y表示高效液相色谱检测所获得谱图的峰面积，x表示产物的摩尔浓度。
根据本发明的一个优选且具体的方面，所述两性离子交换型手性柱为大赛璐公司的
根据本发明的一个具体方面，所述高效液相色谱检测采用的高效液相色谱仪为fulifl2200。
根据本发明的一些优选且具体的方面，所述高效液相色谱检测的步骤包括：
配制流动相；
取样，将所取的样品溶液溶解在流动相中制得待检测液，或，将所取的样品溶液溶解在水中，再利用流动相进行稀释制得待检测液；
进行高效液相色谱检测。
根据本发明的一些优选且具体的方面，在采用所述高效液相色谱进行检测的步骤中，所述待检测液的浓度为0.001-1g/l。
本发明提供的又一技术方案：一种组合物，所述组合物由上述方法制备而得，所述组合物包含如下组分：
a:(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯；
b:(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯；
c:(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸；
d:(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸；
上述组分的化学结构分别为：
根据本发明的一些优选方面，所述组合物中，组分a、b和d的含量分别小于1％。
本发明提供的又一技术方案：一种左旋吡喹酮的制备方法，所述制备方法包括采用上述所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(r)构型的方法来制备(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的步骤。
本发明提供的又一技术方案：一种用于左旋吡喹酮手性中间体制备过程中的检测方法，所述检测方法包括采用高效液相色谱检测反应体系中(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸和(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸含量的步骤；
所述高效液相色谱检测所采用的色谱柱为硅胶表面共价键合-奎宁定(8r,9s)-(1r,2r)-环己基氨基磺酸衍生物的两性离子交换型手性柱，采用的流动相为包含甲醇、乙腈、甲酸和二乙胺的混合物。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
本发明通过在制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的方法中引入液相色谱检测并监测反应体系中四种构型的含量，同时通过特定流动相与特定手性色谱柱的配合使得液相色谱所得色谱峰好，能够完全分离目的产物以及底物中的两种对映体，灵敏度高，重现性好，操作简单，易于掌控，进而能够适用于生物催化制备手性左旋吡喹酮关键中间体(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸时的工艺优化和实时质量监控，对于保证左旋吡喹酮中间体(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸生产过程中的光学纯度，从而提高由其所制备的左旋吡喹酮的质量和药效具有明显独特的实用价值和重要意义，能够满足产品大规模产业化中手性分析的需求。
附图说明
图1为实施例1中底物母液以及反应结束后反应体系中四种构型的检测谱图；
图2为实施例1中制备出的底物标准曲线图；
图3为实施例1中制备出的产物标准曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明；应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的范围限制；实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
下述中，如无特殊说明，所有的原料基本来自于商购或者通过本领域的常规方法制备而得；下述中，(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸简称(r)-1-tic，(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸简称(s)-1-tic，外消旋底物1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯(简称(±)-1)，均购自苏州同力生物医药有限公司，qllip-9购自苏州同力生物医药有限公司，novozyme435购自苏州同力生物医药有限公司，immo8285、immoplus分别购于purolite公司；下述实施例中使用的甲醇或乙腈均为购自sigma公司的hplc级甲醇或乙腈，二乙胺和甲酸购自阿拉丁公司，手性色谱柱
实施例1(r)-1-tic的制备
(1)底物母液的制备：称量0.2g(±)-1，充分溶解于10ml100mm醋酸铵缓冲液。边滴加氨水溶液边检测溶液ph值的变化，当溶液ph值达到8.0时，停止滴加氨水，即获得初始ph值为8.0的底物母液，分别取0.5ml底物母液分装至2mlep管内；
(2)催化过程：选择calb制剂：qllip-9，称量0.01g，加入装有0.5ml底物母液的ep管内，并加入搅拌磁子，将反应ep管做好标记并置于泡沫板中，于3℃低温槽中搅拌反应24h，反应结束后获得反应液。
反应液的处理：(a)反应终止：反应结束后，取出反应ep管，向反应液中加入0.5ml1m盐酸溶液，混合均匀，作为样品溶液；(b)样品稀释：将包含0.5ml反应液的样品溶液全部转移至25ml容量瓶，用流动相(甲醇：乙腈＝6:4(含50mm甲酸和25mm二乙胺))定容、稀释至1g/l。充分摇匀后取20μl稀释液，经微孔有机滤膜过滤后进样，利用高效液相色谱进行检测(流速为0.4ml·min-1；检测波长为220nm；柱温为30℃，手性色谱柱为
反应结束后反应体系中四种构型的检测结果参见图1，其中，1.(r)-1((r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯)；2.(r)-1-tic；3.(s)-1((s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯)；4.(s)-1-tic，(±)-1的两个构型(r)-1和(s)-1分别在8.3min和13.5min左右出峰，产物酸的两个构型(r)-1-tic和(s)-1-tic分别在10.5min和16.5min左右出峰。
反应结果的定量计算：
底物标准曲线的制作：称量0.01g(±)-1，充分溶解于9.5ml流动相(甲醇：乙腈＝6:4(含50mm甲酸和25mm二乙胺))中，最后用10ml容量瓶定容，得到1g·l-1的底物酯标准溶液。利用1ml移液管进行逐级稀释，最终获得终浓度分别为1g·l-1、0.5g·l-1、0.25g·l-1、0.125g·l-1、0.0625g·l-1、0.03125g·l-1、0.015625g·l-1的底物酯溶液。将这7个浓度梯度的底物酯溶液进样，分别获得对应的hplc谱图。然后以消旋酯的摩尔浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到一条线性相关曲线，即为底物标准曲线。如图2所示，利用外标法得到的底物标准曲线为：y＝4×109x-42910，r2＝0.9999(线性范围为0≤x≤0.005mol·l-1，其中x为(±)-1的摩尔浓度，y为峰面积)；
产物标准曲线的制作：称量0.01g外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸((±)-1-tic)，充分溶解于9.5ml流动相中，最后用10ml容量瓶定容，得到1g·l-1的产物酸标准溶液。利用1ml移液管进行逐级稀释，最终获得终浓度分别为1g·l-1、0.5g·l-1、0.25g·l-1、0.125g·l-1、0.0625g·l-1、0.03125g·l-1、0.015625g·l-1的产物酸溶液。将这7个浓度梯度的产物酸溶液进样，分别获得对应的hplc谱图。然后以消旋酸的摩尔浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到一条线性相关曲线，即为产物标准曲线。如图3所示，利用外标法得到的产物标准曲线为：y＝6×109x 52538，r2＝0.9999(线性范围为0≤x≤0.005mol·l-1，其中x为(±)-1-tic的摩尔浓度，y为峰面积)；
然后根据hplc谱图所获得的峰面积计算出目的产物中两种构型的浓度，进而获得转化率和e.e.p(enantiomericexcessofproduct)；其中转化率(conversion，％)＝(1-s1/s0)×100％，其中s0为底物母液(0h)含有的底物量，s1为反应结束时剩余未被转化的底物量；e.e.p(％)＝[((r)-1-tic)-((s)-1-tic)]/[((r)-1-tic) ((s)-1-tic)]×100％，其中(r)-1-tic为反应结束时溶液含有的(r)-酸的量，(s)-1-tic为反应结束时溶液含有的(s)-酸的量。
实施例2(r)-1-tic的制备
基本同实施例1，区别仅在于将calb制剂替换为novozyme435。
实施例3(r)-1-tic的制备
基本同实施例1，区别仅在于将calb制剂替换为immo8285。
实施例4(r)-1-tic的制备
基本同实施例1，区别仅在于将calb制剂替换为immoplus。
结果：反应结束后测得上述四种固定化酶制剂(calb制剂)的催化结果如下表1所示。
表1
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
1.一种制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(r)或(s)构型的方法，所述方法包括以1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯的外消旋体为底物制备(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的步骤，其特征在于：
所述方法还包括通过高效液相色谱检测反应体系中(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸和(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸含量的步骤；
所述高效液相色谱检测所采用的色谱柱为硅胶表面共价键合-奎宁定(8r,9s)-(1r,2r)-环己基氨基磺酸衍生物的两性离子交换型手性柱，采用的流动相为包含甲醇、乙腈、甲酸和二乙胺的混合物。
2.根据权利要求1所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(r)或(s)构型的方法，其特征在于，所述流动相由甲醇、乙腈、甲酸和二乙胺构成，其中所述甲醇与所述乙腈的体积比为1-9∶1，更优选为1-6∶1，进一步优选为1-3∶1；所述甲酸的添加量为48-52mm，所述二乙胺的添加量为23-27mm。
3.根据权利要求1所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(r)或(s)构型的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的条件为：所述流动相的流速为0.3-1ml/min，所述手性色谱柱的柱温为5-45℃，检测波长为210-240nm；优选地，所述流动相的流速为0.4-0.5ml/min，所述手性色谱柱的柱温为25-30℃，检测波长为210-220nm。
4.根据权利要求1所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(r)或(s)构型的方法，其特征在于，所述方法包括建立底物标准曲线以及产物标准曲线的步骤；其中，底物标准曲线为：y＝4×109x-42910，r2＝0.9999，0≤x≤0.005mol·l-1，y表示高效液相色谱检测所获得谱图的峰面积，x表示底物的摩尔浓度；产物标准曲线为：y＝6×109x 52538，r2＝0.9999，0≤x≤0.005mol·l-1，y表示高效液相色谱检测所获得谱图的峰面积，x表示产物的摩尔浓度。
5.根据权利要求1所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(r)或(s)构型的方法，其特征在于，所述两性离子交换型手性柱为大赛璐公司的
6.根据权利要求1所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(r)或(s)构型的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的步骤包括：
配制流动相；
取样，将所取的样品溶液溶解在流动相中制得待检测液，或，将所取的样品溶液溶解在水中，再利用流动相进行稀释制得待检测液；
进行高效液相色谱检测。
7.根据权利要求6所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(r)或(s)构型的方法，其特征在于，在采用所述高效液相色谱进行检测的步骤中，所述待检测液的浓度为0.001-1g/l。
8.一种组合物，其特征在于，所述组合物由权利要求1-7中任一项权利要求所述的方法制备而得，所述组合物包含如下组分：
a:(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯；
b:(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯；
c:(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸；
d:(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，组分a、b和d的含量分别小于1％。
10.一种左旋吡喹酮的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括采用权利要求1-7中任一项权利要求所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(r)构型的方法来制备(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的步骤。
技术总结