本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：
老鼠簕是一种生长在热带海岸地带的红树林植物，具有抗氧化和肝保护作用、抗炎及肿瘤活性。老鼠簕中的生物碱苯并噁唑酮类化合物作为植物次生代谢物的一种活性物质，在植物自我防御中起到重要的作用，研究表明苯并噁唑酮类化合物具杀虫、抗真菌和细菌等活性，可作为新农药开发的先导化合物，以此作为先导化合物进行结构修饰和改造，可得到生物活性较好的化合物。
技术实现要素：
基于上述内容，本发明提供一种海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物及其制备方法和应用。所述化合物在抗肿瘤药物开发应用方面具有广阔的前景。
本发明的技术方案之一，一种海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物，结构式如式i所示：
本发明的技术方案之二，上述海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物的制备方法，以邻氨基苯酚、芳香醛、三氯乙酸和异腈为原料，经聚合反应后关环反应得到海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物。
进一步地，所述邻氨基苯酚、芳香醛、三氯乙酸和异腈的摩尔比为1:1:1:1。
进一步地，所述制备方法具体包括以下步骤：
取邻氨基苯酚、芳香醛置于反应容器中，加入甲醇搅拌反应，有沉淀产生后依次加入三氯乙酸和异腈进行聚合反应，反应结束后加入三乙胺进行关环反应，反应完成后产物冷冻过夜，抽滤，水洗，重结晶得所述海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物。
进一步地，所述邻氨基苯酚和甲醇摩尔体积比为1mol：5l，所述聚合反应时间24h；邻氨基苯酚和三乙胺的摩尔比为1：1.5，关环反应时间24h；使用乙醚对产物进行重结晶。
本发明的技术方案之三，上述海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述肿瘤为宫颈癌。
本发明的技术方案之四，一种抗肿瘤药物，包含上述海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物和药学上可接受的辅料。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明得到的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物具有明显抗肿瘤活性，是一种适合的抗肿瘤候选药物，尤其是作为抗宫颈癌治疗的候选药物，对宫颈癌细胞有明显抑制作用，能增加肿瘤细胞的凋亡率。相对于阳性对照药品顺铂，提高了药物对癌细胞的药物的抑制活性。本发明的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物的合成方法简单，原料易得，合成路线收率高，并且操作过程简便。本发明所述化合物在抗肿瘤药物开发应用方面具有广阔的前景。
附图说明
图1为本发明所述海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物的合成路线图；
图2为本发明实施例1所制备的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物的氢谱图；
图3为本发明实施例1所制备的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物的碳谱图；
图4为本发明实施例1所制备的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物对宫颈癌c-33a细胞的迁移作用图；
图5为本发明实施例1所制备的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物对凋亡因子noxa、puma的作用图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物的合成(合成路径见图1)：
称取邻氨基苯酚(1mmol)和对三氟甲基苯甲醛(1mmol)于25ml圆底烧瓶中，加入5ml甲醇，搅拌半小时，待有沉淀产生后，依次加入三氯乙酸(1mmol)和环己基异腈(1mmol)，室温反应24小时；tlc监测聚合反应完全后，加入三乙胺(1.5mmol)，室温继续反应24小时，tlc监测关环反应完全后；反应液置于冰箱中冷冻过夜，待固体析出完全后抽滤，水洗，并用乙醚重结晶得环多肽2-苯乙烯基-5-吡咯烷酮-2-酰胺衍生物，总收率为83％。
本实施例制备得到的老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物结构式见式ⅰ：
本实施例得到的化合物鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物，化学名为n-环己基-2-(2-苯并噁唑酮-3-基)-2-对三氟甲基苯基乙酰胺，其波谱数据如下：白色固体(0.35g,总收率:83％)；熔点:183-184℃.1hnmr(cdcl3,400mhz):δ7.64-6.70(m,8h,ar-h),6.63(s,1h,nh),6.15(s,1h,ch),3.87-3.84(m,1h,ch),2.01-1.13(m,10h,5ch2).13cnmr(cdcl3,100mhz):δ165.2,154.8,142.4,137.4,129.3,128.4,128.4,125.9,124.1,123.0,112.0,110.1,60.2,49.2,32.7,25.3,24.7.msm/z(％):418(m ,2),292(67),145(33),134(100).anal.calcdforc22h21f3n2o3:c,63.15；h,5.06；n,6.70.found:c,63.10；h,5.30；n,4.95.
其1hnmr谱图如图2所示,其13cnmr谱图如图3所示；
实施例2
海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物对宫颈癌c-33a细胞增殖的影响试验：
收集对数生长期的宫颈癌细胞c-33a，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，然后进行离心。倒掉细胞上清，用含10％胎牛血清的dmem培养基配制成单个细胞悬液，调整细胞悬液浓度，使每毫升含有2×105个c-33a细胞，移种到96孔板中培养，每孔加入200μl细胞悬液，96孔板边缘用无菌pbs填充。在5％co2、37℃培养箱孵育24h。设置空白以及10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μm不同浓度的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物及同样终浓度的顺铂分别处理对数生长期c-33a细胞48h。然后加入mtt试剂，用酶标仪测定吸光值，求出各浓度的抑制率。海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物和顺铂对c-33a细胞的抑制率见表1。
表1
注：n＝3，与对照组1比较，*p<0.01。
从表1中可以得出海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物可以显著抑制宫颈癌细胞c-33a的增殖。
根据mtt法的结果，宫颈癌细胞抑制率随海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物的浓度增加而明显上升。海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物浓度10μm到100μm，宫颈癌细胞c-33a的抑制率分别从(1.25％±3.01％)增加到(71.52％±0.80％)。
实施例3
收集对数生长期的宫颈癌细胞c-33a，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，然后进行离心。倒掉细胞上清，用含10％胎牛血清的dmem培养基配制成单个细胞悬液，调整细胞悬液浓度，使每毫升含有2×105个c-33a细胞，6孔板每孔加入2ml细胞悬液。5％co2、37℃培养箱孵育24h。设置空白对照组、以及按照海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物对c-33a细胞的ic50的大小设置低、中、高的浓度(20μm、30μm、40μm)分别处理细胞48h。48h后收集细胞，用accutaseenzyme消化细胞，然后进行离心。按annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪测定海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物对c-33a细胞凋亡的作用。海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物对c-33a细胞凋亡率见表2。
表2
注：n＝3，与对照组比较，*p<0.01
从表2可以看出，流式细胞仪鉴定结果中，c-33a细胞的凋亡率从7.60％±0.55％增加到62.60％±1.72％。
实施例4
海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物对c-33a细胞迁移的影响
收集对数生长期的宫颈癌细胞c-33a，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，然后进行离心。倒掉细胞上清，用含10％胎牛血清的dmem培养基配制成单个细胞悬液，调整细胞悬液浓度，使每毫升含有2×105个c-33a细胞，6孔板每孔加入2ml细胞悬液。5％co2、37℃培养箱孵育24h。待细胞融合至70％左右，用提前消毒好的直尺放在六孔板上方，用200μl的枪头于每个孔里划三条直线，将细胞上清吸出，用pbs清洗两遍，显微镜下拍照。设置空白对照组以及20μm、30μm、40μm不同浓度的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物分别处理细胞0h、24h、48h、72h，显微镜下拍照观察细胞的迁移情况，迁移结果如图4所示。
根据图4迁移的结果，不同浓度的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物作用于宫颈癌c-33a细胞0h、24h、48h、72h后，通过与对照组划痕宽带的比较，海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物作用于c-33a细胞后均能不同程度地抑制细胞迁移。
实施例5
对凋亡因子noxa、puma的作用
收集对数生长期的宫颈癌细胞c-33a，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，然后进行离心。倒掉细胞上清，用含10％胎牛血清的dmem培养基配制成单个细胞悬液，调整细胞悬液浓度，使每毫升含有2×105个c-33a细胞，6孔板每孔加入2ml细胞悬液。5％co2、37℃培养箱孵育24h。设置空白对照组以及20μm、30μm、40μm不同浓度的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物分别处理细胞48h。48h后收集细胞，提取细胞内的总rna，然后进行rt-qpcr。根据扩增出来的ct值计算结果，扩增结果如图5所示。从图5可以看出，noxa、puma表达均增加，noxa、puma为促凋亡因子。实验结果说明海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物通过促进凋亡基因noxa、puma表达来诱导细胞凋亡。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物，其特征在于，结构式如式i所示：
2.一种根据权利要求1所述的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物的制备方法，其特征在于，以邻氨基苯酚、芳香醛、三氯乙酸和异腈为原料，经聚合反应后关环反应得到海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物。
3.根据权利要求2所述的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物的制备方法，其特征在于，所述邻氨基苯酚、芳香醛、三氯乙酸和异腈的摩尔比为1:1:1:1。
4.根据权利要求2所述的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
取邻氨基苯酚、芳香醛置于反应容器中，加入甲醇搅拌反应，有沉淀产生后依次加入三氯乙酸和异腈进行聚合反应，反应结束后加入三乙胺进行关环反应，反应完成后产物冷冻过夜，抽滤，水洗，重结晶得所述海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物。
5.根据权利要求4所述的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物的制备方法，其特征在于，所述邻氨基苯酚和甲醇摩尔体积比为1mol：5l，所述聚合反应时间24h；邻氨基苯酚和三乙胺的摩尔比为1：1.5，关环反应时间24h；使用乙醚对产物进行重结晶。
6.一种根据权利要求1所述的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为宫颈癌。
8.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包含权利要求1所述的海洋红树老鼠簕生物碱2-苯并噁唑酮衍生物和药学上可接受的辅料。
技术总结