本发明涉及检测ph的比率型近红外荧光探针，具体涉及一种含有苯并吡喃结构的检测ph的比率型近红外荧光探针及制备方法和应用。
背景技术：
ph是许多领域的重要参数。生命环境的ph值是一项非常重要的生理参数，它在酶活性、细胞增殖和调亡、抗药性、离子传输、细胞内吞作用以及肌肉收缩等一系列组织活动中起着至关重要的作用。异常的ph是许多常见疾病(如癌症、中风和阿茨海默病等等)发生的指标。除此之外，工业废水、土壤、药物、以及食品的ph测定为对于工业，农业，医药和食品安全检查领域具有重要意义。因此，如何精准地检测样本中ph值的变化显得尤为重要。
荧光光谱法则是利用荧光参数如荧光强度、荧光寿命等变化对ph值进行测定，灵敏度高，选择性好，响应速度快和信噪比高等优点，更重要的是能够实时原位监测样本ph的变化，因此用于ph检测的荧光探针迅速发展。但是，到目前为止，许多ph荧光探针报告的ph值范围较小，能够在碱性环境中检测ph值的荧光探针鲜有报道。但是在实际检测中一些样本时，要求对其检测ph值的范围更宽。检测ph值的范围有限，使得许多荧光探针无法满足实际需求，需要其它检测方法来检测ph。此外，在可见光的激发下，许多检测样本自身会发射荧光，严重干扰样本的荧光检测和造影。近红外荧光探针的最大发射波长在650-900nm，可避免背景干扰。然而苯并吡喃类近红外(nir)荧光探针(吸收和发射在650-900nm范围内)却鲜有报道。因此，设计并合成一种检测大范围ph的苯并吡喃类近红外荧光探针，并将其应用于ph检测具有重要意义。
技术实现要素：
针对上述问题本发明的目的在于提供一种检测ph的比率型近红外荧光探针，通过不同ph条件下发射波长的变化实现对样本ph的检测。所采用的制备方法操作简单，反应条件温和。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种检测ph的比率型近红外荧光探针(pchc)，其结构式为：
一种检测ph的比率型近红外荧光探针(pchc)的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，在n2保护下，将7-羟基-3-羧基香豆素与二氯亚砜混合，进行加热回流反应，得到7-羟基-3-甲酰氯基香豆素；反应式如下：
步骤2，在n2保护下，将(e)-2-(2-(4-氨基苯乙烯基)-4h-色烯-4-亚甲基)丙二腈、碳酸钾混合，之后加入溶有步骤1所得到的7-羟基-3-甲酰氯基香豆素的无水甲苯溶液，进行加热回流反应，反应完成后旋除溶剂、过柱，旋除溶剂，用水清洗产物，抽滤，直至水中无蓝色荧光为止，收集滤饼中的固体，抽真空干燥，得到含有色烯和香豆素的检测ph的比率型近红外荧光探针，即(e)-n-(4-(2-(4-丙二氰亚甲基)-4h-色烯-2-基)乙烯基)苯基)-7-羟基-3-甲酰胺基香豆素；反应式如下：
进一步，所述步骤1中7-羟基-3-羧基香豆素的用量为0.50-5.00mmol，二氯亚砜的用量为5-20ml。
进一步，所述步骤1中加热回流反应的温度为80-100℃，加热回流反应的时间为4-8h。
进一步，所述步骤2中(e)-2-(2-(4-氨基苯乙烯基)-4h-色烯-4-亚甲基)丙二腈的用量为1.00-3.00mmol，碳酸钾的用量为2.00-6.00mmol，无水甲苯的用量为5-30ml。
进一步，所述步骤2中加热回流反应的温度为110-130℃，加热回流反应的时间为12-20h。
一种检测ph的比率型近红外荧光探针在ph检测方面的应用。
一种检测ph的比率型近红外荧光探针的ph检测范围为4.0-9.0。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明得到的近红外荧光探针(pchc)以苯并吡喃为骨架结构，以7-羟基香豆素为供电子基团，苯乙烯基为共轭连接基团，双氰基亚甲基-4h-色烯为吸电子基团，形成d-π-a型的大共轭结构。由于香豆素具有荧光量子产率高、光稳定性好、发色强度高、色谱覆盖范围广、生物兼容性好等优良的光学和生物性能，通过香豆素与近红外发色团双氰基亚甲基-4h-色烯相连得到的近红外荧光探针(pchc)具有热、光、化学稳定性、大摩尔消光系数以及宽范围的光谱吸收。本发明得到近红外荧光探针(pchc)在不同的ph条件下会发出不同的光，根据荧光的变化实现对ph的比率检测，有效避免背景的干扰，在实际样本的ph检测方面具有较好的应用价值。所采用的合成路线简短，制备方法操作简单，反应条件温和。
附图说明
图1本发明荧光探针pchc随ph变化的紫外吸收图谱。
图2本发明荧光探针pchc随ph变化的荧光发射图谱。
图3本发明荧光探针pchc在ph为5.0、7.0、8.0的br缓冲溶液中对各种离子以及生物活性小分子的抗干扰能力测试图。其中横坐标0-19分别代表：空白组、mg2 、cd2 、ca2 、co2 、k 、cu2 、ag 、zn2 、fe3 、fe2 、亚硝酸钠、vc、l-半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、次氯酸钠、cl-、l-谷氨酸、l-精氨酸。
图4本发明荧光探针pchc在不同ph溶液中的颜色变化图。
图5本发明荧光探针pchc在ph值为4.0和7.0之间的的可逆性测试图。
图6本发明荧光探针pchc在ph值为7.0和9.0之间的的可逆性测试图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案进行具体、详细的说明。
实施例1
一种检测ph的比率型近红外荧光探针(pchc)的制备：
1.在装有磁子的50ml的三口圆底烧瓶中，加入392mg(1.90mmol)7-羟基-3-羧基香豆素，抽真空通氮气三次，再加入10ml二氯亚砜，之后升温，在90℃回流反应6h。反应完成后减压旋除溶剂得到粗产品7-羟基-3-甲酰氯基香豆素，无需进一步纯化，直接投下一步反应。
2.在装有磁子的50ml的三口圆底烧瓶中，加入590mg(1.90mmol)(e)-2-(2-(4-氨基苯乙烯基)-4h-色烯-4-亚甲基)丙二腈和525mg(3.80mmol)k2co3，抽真空通氮气三次，在旋出溶剂的粗酰7-羟基-3-甲酰氯基香豆素中加入10ml无水甲苯溶解，快速加入到三口圆底烧瓶中，在120℃下回流反应16h。反应完成后旋除溶剂，先用纯二氯甲烷过柱，再用纯乙酸乙酯过柱，旋除溶剂，用水清洗产物，抽滤，直至水中无蓝色荧光为止，收集滤饼中的固体，抽真空干燥，得暗红色固体，即近红外荧光探针(e)-n-(4-(2-(4-丙二氰亚甲基)-4h-色烯-2-基)乙烯基)苯基)-7-羟基-3-甲酰胺基香豆素(pchc)93mg，产率9.8％。1hnmr(400mhz,dmso)δ11.19(s,1h),10.84(s,1h),8.87(s,1h),8.72(d,j＝8.4hz,1h),7.93(t,j＝8.4hz,1h),7.86(d,j＝8.7hz,1h),7.80(t,j＝9.6hz,4h),7.74(d,j＝11.0hz,1h),7.69(s,1h),7.61(t,j＝7.8hz,1h),7.44(d,j＝16.0hz,1h),7.00(s,1h),6.90(d,j＝8.6hz,1h),6.83(s,1h)；hrms-esiforc30h17n3o5(m/z)500.1235[m h] 。
实施例2
近红外荧光探针(pchc)检测ph的测试实验：
将实施例1中制备的荧光探针(pchc)溶于dmso中，制备成1mmol/l的荧光探针储备液。用醋酸、磷酸、硼酸、氢氧化钠分别配置ph为：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的ph缓冲溶液(br缓冲溶液)。取荧光探针储备液，加入到不同ph值的缓冲液中，使其最终浓度为10.0μm，30min后获得紫外吸收光谱和荧光发射光谱(激发为415.0nm，激发狭缝和发射狭缝宽度均为10.0nm)。如图1所示，随着ph的增加，近红外荧光探针(pchc)吸收光谱在逐渐红移。如图2所示，随着ph的增加，在波长为453.0nm处，近红外荧光探针(pchc)的荧光强度逐渐增强。随着ph的增加，在波长为662.0nm处，近红外荧光探针(pchc)的荧光强度逐渐减弱。
实施例3
近红外荧光探针(pchc)用于ph检测的抗离子干扰性能测试：
取2mlph分别为5.0，7.0，8.0的br缓冲溶液于四通的比色皿中，加入实施案例2中制备的荧光探针储备液。随后分别加入各种离子以及生物相关活性小分子(mg2 、cd2 、ca2 、co2 、k 、cu2 、ag 、zn2 、fe3 、fe2 、亚硝酸钠、vc、l-半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、次氯酸钠、cl-、l-谷氨酸、l-精氨酸)，使荧光探针以及干扰分子的最终浓度分别为10μmol/l、50μmol/l，只加荧光探针组为空白组，反应0.5h后，测定其荧光值(激发为415.0nm，激发狭缝和发射狭缝宽度均为10.0nm)。如图3所示，表明本发明探针具有良好的抗干扰能力。
实施例4
近红外荧光探针(pchc)的随ph变化的荧光照片：
调节不同ph的br缓冲溶液，ph为4.0、5.5、6、6.5、7.0、8.0、9.0，分别加入实施案例2中制备的荧光探针储备液，如图4所示，随着ph的增加，红光逐渐减弱，蓝光逐渐增强。
实施例5
近红外荧光探针(pchc)的用于ph检测的可逆性测试：
在四通的比色皿中加入实施案例2中制备的荧光探针储备液，调节ph在4.0和7.0，以及7.0和9.0之间变化，分别记录其荧光强度的变化(激发为415.0nm，激发狭缝和发射狭缝宽度均为10.0nm)。如图5、图6所示，表明该过程可以可逆地进行至少五个周期。表明本发明荧光探针对ph的响应具有很好的可逆性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，都包含在本发明的保护范围之内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
1.一种检测ph的比率型近红外荧光探针，其特征在于，所述近红外荧光探针的结构式为：
2.根据权利要求1所述的一种检测ph的比率型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，在n2保护下，将7-羟基-3-羧基香豆素与二氯亚砜混合，进行加热回流反应，得到7-羟基-3-甲酰氯基香豆素；
步骤2，在n2保护下，将(e)-2-(2-(4-氨基苯乙烯基)-4h-色烯-4-亚甲基)丙二腈和碳酸钾混合，之后加入溶有步骤1所得到的7-羟基-3-甲酰氯基香豆素的无水甲苯溶液，进行加热回流反应，反应完成后旋除溶剂、过柱，旋除溶剂，用水清洗产物，抽滤，直至水中无蓝色荧光为止，收集滤饼中的固体，抽真空干燥，得到含有色烯和香豆素的检测ph的比率型近红外荧光探针，即(e)-n-(4-(2-(4-丙二氰亚甲基)-4h-色烯-2-基)乙烯基)苯基)-7-羟基-3-甲酰胺基香豆素。
3.根据权利要求2所述的一种检测ph的比率型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1中7-羟基-3-羧基香豆素的用量为0.50-5.00mmol，二氯亚砜的用量为5-20ml。
4.根据权利要求2所述的一种检测ph的比率型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1中加热回流反应的温度为80-100℃，加热回流反应的时间为4-8h。
5.根据权利要求2所述的一种检测ph的比率型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤2中(e)-2-(2-(4-氨基苯乙烯基)-4h-色烯-4-亚甲基)丙二腈的用量为1.00-3.00mmol，碳酸钾的用量为2.00-6.00mmol，无水甲苯的用量为5-30ml。
6.根据权利要求2所述的一种检测ph的比率型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤2中加热回流反应的温度为110-130℃，加热回流反应的时间为12-20h。
7.根据权利要求2所述的一种检测ph的比率型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤2中过柱先用纯二氯甲烷过柱，再用纯乙酸乙酯过柱。
8.一种权利要求1所述的检测ph的比率型近红外荧光探针在ph检测方面的应用。
9.一种权利要求1所述的检测ph的比率型近红外荧光探针的ph检测范围为4.0-9.0。
技术总结