本发明属于医药领域，具体涉及一种具有组蛋白甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制活性的喹唑啉异羟肟酸衍生物及其制备方法与应用。
背景技术：
癌症，是一类严重威胁人类健康、影响人们生活质量的常见恶性疾病，是仅次于心血管疾病的第二大死亡原因。其发生与发展不仅与基因突变有关，还与表观遗传的改变有密切的联系。组蛋白甲基转移酶(histonemethyltransferases)和组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylases，hdac)分别催化组蛋白的甲基化和组蛋白的去乙酰化，是表观遗传的重要调控方式。其中hdac是抗肿瘤药物研发的比较成熟的重要靶点，目前已有五个hdac抑制剂(vorinostat、romidepsin、belinostat、panobinostat、chidamide)上市，而目前针对组蛋白甲基转移酶g9a/glp(g9a-likeprotein)的研究还处于萌芽起步阶段，其抑制剂都还未进入临床实验阶段。
组蛋白甲基转移酶g9a/glp和组蛋白去乙酰化酶(hdac)是多种肿瘤发生发展的关键靶点酶，在组蛋白修饰过程中它们并不是独立存在的，而是相互影响协调的关系，其功能也息息相关。大量证据表明，在肺癌，乳腺癌，结肠癌等肿瘤细胞当中均发现了不同程度的组蛋白去乙酰化酶(hdac)过量表达。此外，组蛋白甲基转移酶g9a/glp在白血病、前列腺癌、肝癌和肺癌等多种癌症中也均过量表达。g9a/glp过量表达，会使h3k9和h3k27甲基化，从而抑制基因转录表达。去乙酰化酶在细胞中过量表达，赖氨酸带正电荷，能够与负电荷的dna结构紧密结合，从而抑制基因的转录表达。这就是说，g9a/glp和hdac过量表达都能抑制细胞的转录表达，具有相似的作用机制；同时，2017年，中国科学院上海药物研究所丁健课题组发现组蛋白甲基转移酶g9a与转录因子yy1和组蛋白去乙酰化酶hdac能形成转录抑制复合物促进乳腺癌生长。因此，组蛋白甲基转移酶g9a/glp和组蛋白去乙酰化酶hdac具有协同效应。此外，它们在组蛋白上具有相同的作用位点(h3k9，p53k373)。因此，研发同时干预g9a/glp和hdac活性的化学小分子有可能成为肿瘤治疗的有效策略。发明人推测同时干预g9a/glp和hdac的活性可产生抗肿瘤协同效应，并能克服因旁路代偿产生耐药性的问题，与单一靶标抑制剂相比具有明显的优势，且可避免联合用药潜在的一些毒副作用(如复杂的药代动力学、潜在的药物相互作用、更多的毒副作用等)。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一类具有g9a/glp和hdac抑制活性的喹唑啉异羟肟酸衍生物及其制备方法。
具体地，本发明的第一方面提供一种喹唑啉异羟肟酸衍生物或其药学上可接受的盐，所述喹唑啉异羟肟酸衍生物的结构式如式ⅰ所示：
其中，
y为取代的或非取代的脂肪烃基或芳香烃基；优选地，所述y为取代的或非取代的c1-c20脂肪烃基或c6-c20芳香烃基；其中，所述c1-c20脂肪烃基更优选为c1-c10的烷基、c2-c10的烯基或c2-c10的炔基，进一步优选为c3-c8的烷基、c2-c6的烯基或c2-c6的炔基；所述芳香烃基可以为六元芳香环、五元芳香环或它们的类似物，优选选自哌嗪基、苯基、吡啶基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、吡咯基或它们的类似物；所述脂肪烃基或芳香烃基的取代基优选选自c1-c5的烷基、c2-c5的烯基、c2-c5的炔基、羟基、硝基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、氨基、丙烯酰胺基、氰基、氟基、氯基、溴基或碘基；
r1为含氮取代基；优选地，所述r1为吡咯烷衍生物或哌啶衍生物，具体优选为
r2、r3各自独立地为氢或烷基；优选各自独立地为c1-c6烷基，最优选均为甲基。
根据本发明，所述药学上可接受的盐可以为无机酸盐或有机酸盐；优选地，所述无机酸盐选自下述任意一种无机酸形成的盐：盐酸、硫酸或磷酸；优选地，所述有机酸盐选自下述任意一种有机酸形成的盐：乙酸、三氟乙酸、丙二酸、柠檬酸或对甲苯磺酸。
具体地，上述式i所示的化合物优选为下表所示任意一种：
本发明的式i所示的喹啉异羟肟酸类化合物可根据本领域常规方法制得，具体地，可按照下述反应路线制备得到：
反应路线中，式iii中的r1、式iv中的r1和y与式i中对应的r1和y定义相同，将me替换为h或其他烷基即可制得r2、r3为其他取代基的化合物。
反应路线主要包括以下反应步骤：
步骤a)式ii所示化合物(2,4-二氯-6,7-二甲氧基喹唑啉)与相应的携带r1基团的氨基衍生物发生buchwald-hartwig碳-氮偶联反应得到式iii所示化合物；
步骤b)式iii所示化合物与相应的末端伯胺的脂肪酸酯/哌嗪的脂肪酸酯发生亲核取代反应得到式iv所示化合物；
步骤c)式iv所示化合物与羟胺或盐酸羟胺在碱性溶液中反应，得到式i所示化合物。
上述方法步骤a)中，优选地，反应温度为室温，反应时间为2-20小时。所述buchwald-hartwig反应可使用行业里普遍使用的buchwald-hartwig反应条件。
上述方法步骤b)中，优选地，所述碱选自氨水、三乙胺、二异丙基乙基胺、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾等中的一种或多种。
上述方法步骤c)中，优选地，反应在水溶液或有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自二甲基甲酰胺、氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、乙腈等中的一种或多种。
式iv所示化合物与羟胺或盐酸羟胺、碱反应的摩尔比为1:1-10:1-20:1，具体可为1:5:5。
所述步骤c)中反应的反应温度可以为室温，反应时间为0.5-10小时；
本发明制备的化合物经过高分辨质谱，核磁共振等测试，证明所制备的化合物正确无误，为通式ⅰ所示化合物。
本发明的再一个目的是提供式ⅰ所示化合物及其药学上可接受的盐的应用。
本发明式ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐的用途是其在下述至少一个方面的应用：
1)在制备组蛋白甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的应用；
2)在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用；
3)在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
根据本发明，所述组蛋白甲基转移酶包括在哺乳动物细胞中已知的亚型g9a、glp或ezh2；所述组蛋白去乙酰化酶(hdacs)包括在哺乳动物细胞中已知的亚型，主要包括但不限于hdac1，hdac2，hdac3，hdac8，hdac4，hdac5，hdac7，hdac9，hdac6，hdac10，hdac11。
所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为白血病癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、人脑胶质瘤细胞、黑色素癌细胞、胶质母细胞瘤、宫颈癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、鼻咽癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞、直肠癌细胞或淋巴瘤细胞；优选为人慢性髓原白血病细胞和人组织细胞淋巴瘤细胞。
所述白血病癌细胞优选为人慢性粒细胞白血病(cml)细胞系k562，所述淋巴瘤细胞优选为人组织细胞淋巴瘤细胞u937，所述肺癌细胞优选为人肺癌细胞nci-h520，所述人脑胶质瘤细胞优选为u251，所述黑色素癌细胞优选为a375，所述胶质母细胞瘤细胞优选为人胶质母细胞瘤细胞a172或人脑星形胶质母细胞瘤细胞u-118mg，所述宫颈癌细胞优选为人宫颈癌细胞系hela，所述鼻咽癌细胞优选为鼻咽癌细胞株cne-2，所述肝癌细胞优选为人肝癌细胞株hepg2，所述乳腺癌细胞优选为人乳腺癌细胞mcf-7或mda-mb-231。
根据本发明，所述肿瘤为癌；所述癌为白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌或直肠癌。
本发明式ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐也可用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物。
以式ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐为有效成分制备的预防和/或治疗肿瘤的药物，也属于本发明的保护范围。
用式ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐制备的dna甲基转移酶和/或组蛋白去乙酰化酶抑制剂、真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂以及预防和/或治疗肿瘤的药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
用式ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐制备的预防和/或治疗肿瘤药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明提供的化合物经过组蛋白甲基转移酶(glp)抑制活性测试、组蛋白去乙酰化酶抑制活性测试和肿瘤细胞增殖抑制活性测试，证明式ⅰ所示化合物对组蛋白甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶均有抑制活性，是一种潜在的抗肿瘤药物。本发明提供的化合物原料易得，制备方法简单，实验证明其有良好的抗癌效果，在抗肿瘤药物设计研发领域有着良好的应用前景。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1、图2和图3分别为化合物d1的核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图。
图4、图5和图6分别为化合物d2的核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图。
图7、图8和图9分别为化合物d3的核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图。
图10、图11和图12分别为化合物d4的核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图。
图13、图14和图15分别为化合物d5的核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图。
图16、图17和图18分别为化合物d6的核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图。
图19、图20和图21分别为化合物d7的核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图。
图22、图23和图24分别为化合物d8的核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明的范围并不限定于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为有机合成与生物测试的常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均从商业途径获得。
实施例1化合物d1的制备
实施例1a中间体2-氯-6,7-二甲氧基-n-(1-甲基哌啶-4-基)喹唑啉-4-胺(式iii所示化合物)
将2,4-二氯-6,7-二甲氧基喹唑啉(式ii所示化合物)(1eq)与相应的携带r1基团的氨基衍生物(2eq)加入到圆底烧瓶中，溶于四氢呋喃等有机溶剂中，氮气保护下室温搅拌反应过夜，继而以二氯甲烷萃取得粗品，经柱色谱分离得纯品。
实施例1b6-(6,7-二甲氧基-4-((1-甲基哌啶)喹唑啉-氨基))己酸甲酯
(式iv所示化合物，y＝2-氨基己酰胺，r1＝1-甲基哌啶)
此步反应利用亲核取代反应完成，一般过程如下：将实例1a所得化合物(1eq)溶于乙腈等有机溶液中，加入diea(2eq)、以及相应的末端伯胺的脂肪酸酯(6-氨基己酸甲酯)(2eq)，80℃氮气保护反应2小时，点板监测至实例1a化合物反应完全。加入水和二氯甲烷萃取，有机相以柱色谱分离得产品。
实施例1c6-((6,7-二甲氧基-4-((1-甲基哌啶-4-基)氨基)喹唑啉-2-基)氨基)-n-羟基己酰胺(d1)
(式i所示化合物，y＝2-氨基己酰胺，r1＝1-甲基哌啶)
本反应将实施例1d所得化合物的酯键转化为目标化合物的异羟肟酸官能团。首先将实施例1b所得化合物(1eq)加入圆底烧瓶中，加入适量甲醇或二氯甲烷使之充分溶解，依次加入羟胺的水溶液(15.17m，5eq)和甲醇钠的甲醇溶液(5m，10eq)，室温下搅拌反应，点板监测至原料反应完全。旋除部分反应液，加入适量水使固体溶解，滴加3m的盐酸调ph至中性，此时有白色沉淀产生。过滤并以乙醚、正己烷等洗涤滤饼得到目标化合物。化合物表征如下：
d1:1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.48(s,1h),9.24(s,1h),8.71(s,1h),8.02(d,j＝57.3hz,2h),6.92(s,1h),4.36(s,1h),3.88(s,6h),3.46(dd,j＝31.6,9.4hz,4h),3.14(s,2h),2.77(s,3h),2.17(d,j＝20.0hz,4h),1.97(t,j＝7.3hz,2h),1.54(m,j＝7.5,6.4hz,4h),1.32(q,j＝7.9,7.4hz,2h).13cnmr(101mhz,dmso)δ169.56,169.54,152.91,146.99,146.97,135.96,62.95,57.12,56.58,56.57,51.71,32.65,32.63,26.34,26.32,25.32,25.30.hrms(esi)m/z计算值[m h] 447.2720,实测值447.2733。核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图分别如图1、图2和图3所示。
实施例2化合物d2的制备
化合物制备方法参考实施例1。化合物表征如下：
d2:1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.39(d,j＝59.9hz,2h),6.64(s,1h),6.17(s,1h),4.04(s,1h),3.77(s,6h),3.30–3.14(m,4h),2.82(d,j＝10.9hz,2h),2.17(s,3h),1.91(dd,j＝18.4,11.8hz,4h),1.63(q,j＝12.2hz,2h),1.47(q,j＝7.8hz,4h),1.25(s,4h).13cnmr(101mhz,dmso)δ169.68,169.60,159.27,158.93,154.21,148.85,144.82,105.29,104.29,103.99,56.71,55.82,55.34,47.72,46.43,41.27,32.80,32.60,31.92,29.99,29.05,28.52,27.52,26.93,26.06,25.70,25.36.hrms(esi)m/z计算值[m h] 461.2876,实测值461.2884。核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图分别如图4、图5和图6所示。
实施例3化合物d3的制备
化合物制备方法参考实施例1。化合物表征如下：
d3:1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.49(s,1h),7.42(d,j＝68.1hz,2h),6.64(s,1h),6.09(s,1h),4.05(s,1h),3.79(s,6h),3.21(q,j＝6.7hz,2h),2.82(d,j＝10.8hz,2h),2.75–2.64(m,1h),2.16(t,j＝11.6hz,2h),1.98–1.83(m,4h),1.63–1.47(m,6h),1.27(t,j＝7.6hz,2h),0.97(d,j＝6.5hz,6h).13cnmr(101mhz,dmso)δ169.66,159.48,158.87,154.11,149.26,144.72,105.56,104.34,104.09,56.74,55.80,54.15,48.49,48.19,41.17,32.84,32.57,29.82,26.81,25.59,18.60.hrms(esi)m/z计算值[m h] 475.3033,实测值475.3049。核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图分别如图7、图8和图9所示。
实施例4化合物d4的制备
化合物制备方法参考实施例1。化合物表征如下：
d4:1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.37(s,1h),7.47(s,2h),6.66(s,1h),6.25(s,1h),4.07(s,1h),3.78(d,j＝3.3hz,6h),3.21(q,j＝6.7hz,2h),2.85(d,j＝38.0hz,3h),2.28(s,2h),1.92(t,j＝7.5hz,3h),1.64(d,j＝12.4hz,2h),1.47(m,j＝7.2hz,4h),1.34–1.15(m,4h),1.00(d,j＝6.5hz,6h).13cnmr(101mhz,dmso)δ169.63,158.96,158.87,154.30,144.93,104.33,103.91,56.70,55.85,54.61,48.04,41.28,32.79,31.97,29.95,29.05,26.92,25.70,18.34.hrms(esi)m/z计算值[m h] 489.3189,实测值489.3203。核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图分别如图10、图11和图12所示。
实施例5化合物d5的制备
化合物制备方法参考实施例1。化合物表征如下：
d5:1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.33(s,1h),8.69(s,1h),7.48–7.17(m,2h),6.69(s,1h),3.93(dq,j＝11.7,6.6,6.0hz,1h),3.78(d,j＝3.5hz,6h),3.66(t,j＝4.9hz,4h),2.75(dd,j＝45.2,8.7hz,3h),2.35(q,j＝6.0,5.1hz,4h),2.28–2.12(m,4h),1.93(q,j＝8.6,7.5hz,4h),1.48(m,j＝31.5,23.7,9.1,6.9hz,6h),1.23(q,j＝8.2hz,2h),0.95(d,j＝6.5hz,6h).13cnmr(101mhz,dmso)δ169.53,158.94,154.51,145.85,128.91,103.89,63.32,56.83,55.97,52.02,32.58,26.55,25.30.hrms(esi)m/z计算值[m h] 544.3611,实测值544.3618。核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图分别如图13、图14和图15所示。
实施例6化合物d6的制备
化合物制备方法参考实施例1。化合物表征如下：
d6:1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.42(s,1h),7.76(s,1h),7.48–7.17(m,5h),6.96(d,j＝51.4hz,1h),4.14(s,1h),3.82(s,6h),3.55(s,2h),3.45–3.33(m,2h),2.91(s,2h),2.30–2.02(m,2h),2.00–1.83(m,4h),1.77(s,2h),1.50(q,j＝7.7hz,4h),1.35–1.19(m,2h).13cnmr(101mhz,dmso)δ169.58,158.86,146.10,129.56,128.70,127.62,62.25,57.04,56.23,52.70,41.17,32.78,31.32,29.41,26.59,25.45,15.66,14.59.hrms(esi)m/z计算值[m h] 523.3033,实测值523.3042。核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图分别如图16、图17和图18所示。
实施例7化合物d7的制备
化合物制备方法参考实施例1。化合物表征如下：
d7:1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.53(s,1h),7.66(s,1h),7.54–7.28(m,5h),6.94–6.71(m,1h),4.13(s,1h),3.80(d,j＝7.2hz,6h),3.57–3.32(m,8h),3.10(d,j＝18.0hz,2h),2.92–2.58(m,6h),1.96(m,j＝19.7,12.1hz,6h),1.62–1.43(m,4h),1.26–1.17(m,2h).13cnmr(101mhz,dmso)δ169.53,158.94,154.51,145.85,128.91,103.89,63.32,56.83,55.97,52.02,32.58,26.55,25.30.hrms(esi)m/z计算值[m h] 592.3611,实测值592.3627。核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图分别如图19、图20和图21所示。
实施例8化合物d8的制备
化合物制备方法参考实施例1。化合物表征如下：
d8:1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.49(m,j＝33.7,18.7,8.0hz,10h),7.33–7.06(m,4h),6.68(m,j＝8.1hz,1h),6.56(m,j＝15.7hz,2h),5.13–4.93(m,2h),4.77–4.46(m,4h),3.79(m,10h),3.40–3.02(m,6h),2.99–2.60(m,2h),2.23(m,j＝55.4hz,2h).13cnmr(101mhz,dmso)δ167.54,163.94,158.64,154.42,148.85,148.22,134.52,134.13,130.73,129.83,129.43,128.65,127.59,127.31,103.88,56.81,55.89,54.89,53.13.hrms(esi)m/z计算值[m h] 638.3455,实测值638.3441。核磁氢谱图、核磁碳谱图和高分辨质谱图分别如图22、图23和图24所示。
测试例1组蛋白去乙酰化酶抑制活性试验
以组蛋白去乙酰化酶家族的两个亚型hdac1和hdac6为研究对象，测试化合物对组蛋白去乙酰化酶的抑制活性，每个化合物设十个浓度梯度，一个复孔，并以已上市的hdac抑制剂saha做对照。首先将化合物溶解在100％的dmso溶液中，分别配制成浓度为10mm的化合物储液；之后按如下步骤进行：(1)阳性对照化合物saha测试终浓度为3μm起始，3倍稀释，10个浓度，复孔测试。其余待测化合物测试终浓度为1μm起始，4倍稀释，8个浓度，均单孔测试。在source板中将saha和其余待测化合物都梯度稀释成100倍终浓度的10个或8个相应浓度的溶液。使用
测试例2组蛋白甲基转移酶抑制活性试验
以组蛋白甲基化酶家族的一个亚型glp为研究对象，测试化合物对组蛋白甲基化酶的抑制活性，每个化合物设十个浓度梯度，一个复孔，并以目前活性最好的的g9a/glp抑制剂unc0642做对照。首先将化合物溶解在100％的dmso溶液中，分别配制成浓度为10mm的化合物储液；之后按如下步骤进行：(1)化合物浓度的配制：受试化合物测试浓度为5μm，dqz-51以及dqz-85多设置测试浓度1μm；unc0642测试浓度为1μm起始，3倍稀释10个浓度。将化合物以及阳性对照以dmso稀释至待测浓度的1000×，然后阳性对照化合物則进行3倍稀释10个浓度，接下来以1×反应溶液稀释10倍，然后再稀释20倍(此时dmso浓度为0.5％)，最后各加入5μl至384孔反应板中待测，每个化合物浓度设置复孔测试。max孔和min孔中转移5μl的0.5％dmso。(2)在各孔中加10μl的2.5×蛋白溶液，1000rpm离心1min，在4℃孵育15分钟。(3)反应板各孔中加入10μl的2.5×底物混合溶液，1000rpm离心1min，在4℃孵育30分钟。(4)加入5μl终止液，1000rpm离心60秒，将各孔所有溶液转至flashplate，室温孵育60分钟。(5)用microbeta2读数。(6)以浓度的log值作为x轴，百分比抑制率为y轴，采用分析软件graphpadprism5的log(inhibitor)vs.response-variableslope拟合量效曲线，从而得出化合物对酶活抑制的ic50值。化合物对甲基转移酶酶(glp)的抑制活性结果如表1所示，可见化合物可以有效抑制glp酶活性，除化合物d3和d8外，其他化合物对glp的酶抑制活性亦小于20nm，特别是化合物d5和d7优于阳性对照药物unc0642(ic50＝2.8nm)。
表1化合物d1-d8酶抑制活性测试
测试例3mtt法细胞增殖抑制活性测试
本测试例测试了化合物处理人慢性粒细胞白血病(cml)细胞系k562和人乳腺癌细胞mda-mb-23172小时的肿瘤细胞增殖抑制活性，使用阳性化合物unc0642(g9a/glp抑制剂)和saha(hdac抑制剂)做对照。体外细胞增殖抑制实验采用mtt法，测试的具体步骤包括：
(a)样品准备：将化合物配制成5mm的dmso溶液，并以dmso梯度稀释得到相应浓度的样品溶液；
(b)铺板：取对数期细胞，通过血球计数板计数，将肿瘤细胞以每孔6-8×103个的密度接种于96孔板中，每孔培养基体积为100μl；
(c)加药：铺板后12-16h加药(待细胞贴壁后加药)。每孔加入1μl待测化合物溶液，使化合物终浓度为设定的浓度值，每个浓度设置4个复孔。同时设置两个阳性药组(分别加入hdac抑制剂saha或g9a/glp抑制剂unc0642)和空白组(加入1μldmso)；
(d)mtt处理：化合物与细胞共培养72h后往实验组和对照组中加入mtt的pbs溶液(5mg/ml，10μl/孔)，继续于培养箱中无菌培养4h；
(e)后处理与od值测试：将96孔板离心并吸除培养基(贴壁细胞无须离心)，加入dmso(100μl/孔)并将96孔板在微量振荡器上振荡5分钟后使用酶标仪测试490nm处od值，最后根据od值计算出相应浓度下化合物对肿瘤细胞增殖的抑制率(inh％)。
测试结果如表2所示，表明72小时条件下所合成化合物除了d3和d8对k562均具有微摩的抑制率，可有效抑制肿瘤细胞增殖。
表2化合物肿瘤细胞增殖抑制活性测试
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
1.一种喹唑啉异羟肟酸衍生物或其药学上可接受的盐，所述喹唑啉异羟肟酸衍生物的结构式如式ⅰ所示：
其中，
y为取代的或非取代的脂肪烃基或芳香烃基；
r1为含氮取代基；
r2、r3各自独立地为氢或烷基。
2.根据权利要求1所述的喹唑啉异羟肟酸衍生物或其药学上可接受的盐，其中，所述药学上可接受的盐为无机酸盐或有机酸盐；
优选地，所述无机酸盐选自下述任意一种无机酸形成的盐：盐酸、硫酸或磷酸；
优选地，所述有机酸盐选自下述任意一种有机酸形成的盐：乙酸、三氟乙酸、丙二酸、柠檬酸或对甲苯磺酸。
3.根据权利要求1或2所述的喹唑啉异羟肟酸衍生物或其药学上可接受的盐，其中，
所述y为取代的或非取代的c1-c20脂肪烃基或c6-c20芳香烃基；所述c1-c20脂肪烃基优选为c1-c10的烷基、c2-c10的烯基或c2-c10的炔基，进一步优选为c3-c8的烷基、c2-c6的烯基或c2-c6的炔基；所述芳香烃基优选选自哌嗪基、苯基、吡啶基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、吡咯基或它们的类似物；所述脂肪烃基或芳香烃基的取代基优选选自c1-c5的烷基、c2-c5的烯基、c2-c5的炔基、羟基、硝基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、氨基、丙烯酰胺基、氰基、氟基、氯基、溴基或碘基；
所述r1为吡咯烷衍生物或哌啶衍生物，优选为
所述r2、r3各自独立地为c1-c6烷基，优选为甲基。
4.根据权利要求3所述的喹唑啉异羟肟酸衍生物或其药学上可接受的盐，其中，所述喹唑啉异羟肟酸衍生物的结构式如下表所示：
5.一种权利要求1至4任一项所述化合物的制备方法，包括下述步骤：
反应路线中，式iii中的r1、式iv中的r1和y与式i中对应的r1和y定义相同；
反应路线包括以下反应步骤：
步骤a)式ii所示化合物与相应的携带r1基团的氨基衍生物发生buchwald-hartwig碳-氮偶联反应得到式iii所示化合物；
步骤b)式iii所示化合物与相应的末端伯胺的脂肪酸酯/哌嗪的脂肪酸酯发生亲核取代反应得到式iv所示化合物；
步骤c)式iv所示化合物与羟胺或盐酸羟胺在碱性溶液中反应，得到式i所示化合物；
优选地，上述方法步骤a)中，反应温度为室温，反应时间为2-20小时；
优选地，上述方法步骤b)中，所述碱选自氨水、三乙胺、二异丙基乙基胺、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾中的一种或多种；
优选地，上述方法步骤c)中，
反应在水溶液或有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自二甲基甲酰胺、氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、乙腈中的一种或多种；
式iv所示化合物与羟胺或盐酸羟胺、碱反应的摩尔比为1:1-10:1-20:1；
反应温度为室温，反应时间为0.5-10小时。
6.根据权利要求1-4任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在下述至少一个方面的应用：
1)在制备组蛋白甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的应用；
2)在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用；
3)在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述组蛋白甲基转移酶包括亚型g9a、glp或ezh2；所述组蛋白去乙酰化酶包括亚型hdac1，hdac2，hdac3，hdac8，hdac4，hdac5，hdac7，hdac9，hdac6，hdac10，hdac11；
所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为白血病癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、人脑胶质瘤细胞、黑色素癌细胞、胶质母细胞瘤、宫颈癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、鼻咽癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞、直肠癌细胞或淋巴瘤细胞；优选为人慢性髓原白血病细胞和人组织细胞淋巴瘤细胞；
所述白血病癌细胞优选为人慢性粒细胞白血病(cml)细胞系k562，所述淋巴瘤细胞优选为人组织细胞淋巴瘤细胞u937，所述肺癌细胞优选为人肺癌细胞nci-h520，所述人脑胶质瘤细胞优选为u251，所述黑色素癌细胞优选为a375，所述胶质母细胞瘤细胞优选为人胶质母细胞瘤细胞a172或人脑星形胶质母细胞瘤细胞u-118mg，所述宫颈癌细胞优选为人宫颈癌细胞系hela，所述鼻咽癌细胞优选为鼻咽癌细胞株cne-2，所述肝癌细胞优选为人肝癌细胞株hepg2，所述乳腺癌细胞优选为人乳腺癌细胞mcf-7或mda-mb-231。
8.根据权利要求6所述的应用，所述肿瘤为癌；所述癌为白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌或直肠癌。
9.一种药物组合物，其包含了作为活性成分的如权利要求1-4任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐以及可药用辅料。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其制剂形式选自注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂。
技术总结