本发明涉及shp2蛋白靶向降解剂的合成，属于药物化学和生物学技术领域。本发明化合物可用于制备治疗shp2介导的肿瘤和/或其他疾病的药物。
背景技术：
shp2是一种由ptpn11基因编码的非受体蛋白酪氨酸磷酸酶，表达于机体的各种组织和细胞中。目前研究表明shp2介导肿瘤发生的机制主要包括：激活ras-erk信号通路促进癌细胞的存活和增殖；mek等激酶被抑制之后，shp2介导了代偿性激活途径，从而促进肿瘤耐药的发生；作为pd-1受体的下游分子，shp2还参与t细胞抑制性信号的传导，使肿瘤免疫功能降低。因此，靶向降解shp2可抑制肿瘤细胞生长、降低肿瘤耐药性、恢复或增强t细胞介导的抗肿瘤免疫功能。(参见：ruessd.a.,etal.nat.med.2018,24,954-960；mainardis.,etal.nat.med.2018,24,961-967；wongg.s.,etal.nat.med.2018,24,968-977；dardaeil.,etal.nat.med.2018,24,512-517；huie.,etal.science.2017,355,1428-1433；lij.,etal.cancerres.2015,75,508-518；yokosukat.,etal.j.exp.med.2012,209,1201-1217.)
近年来，人们利用蛋白酶体具有特异性降解蛋白底物的功能，提出了蛋白降解靶向嵌合体(protac)技术，依靠化学合成方法，将靶蛋白结合配体和泛素连接酶e3的配体通过连接臂(linker)连接起来，形成可以自发介导靶蛋白降解的双功能分子化合物，具有广阔的研究价值。但是由于靶蛋白配体、泛素连接酶e3的配体和连接臂的不同，得到的化合物的性能也不同。
本领域没有以shp099作为靶蛋白结合配体，以度胺类化合物作为泛素连接酶e3的配体得到介导靶蛋白降解的双功能分子化合物的相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供了可以靶向降解shp2蛋白的化合物，为shp2介导的肿瘤和/或其他疾病提供非常有潜力的治疗方案。
本发明的具体技术方案如下：
本发明提供了如式i所示的一种基于cereblon配体诱导shp2蛋白降解的双功能分子化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或前药：
其中：
所述的b是e3泛素连接酶复合体中cereblon蛋白的小分子配体，其选自沙利度胺及其衍生物、来那度胺及其衍生物、泊马度胺及其衍生物；
所述的b为如下所示的任意结构之一：
其中：
w选自ch2、c＝o、so2、nh、n-c1-c4烷基；
x选自o、s；
z选自氢、c1-c4烷基、c3-c6环烷基、卤素；
g、g′选自h、c1-c4烷基、-oh、c1-c4烷基取代的5-10元杂环基，所述杂环基含有1-3个n、o或s的杂原子；
r1选自h、d、卤素、硝基、氨基、氰基、羟基、c1-c4烷基、卤代c1-c4烷基、氘代c1-c4烷基。
其中，所述的l通过共价键与nh和b相连，
所述l优选为如下所示的任意结构之一：
其中：n选自1-10之间的整数。
本发明优选如通式ii所示的双功能分子化合物或其药学上可接受的盐、水合物或前药：
其中：
r1选自-h、-d、-f、-cl、-br、-i、-no2、-cn、-nh2、-oh、-ch3、-ch2f、-chf2、-cf3、-ch2d、-chd2、-cd3、-ch2ch3；
l为如下结构中的任意一种：
n选自1-10之间的整数。
本发明更优选如通式iii所示双功能分子化合物或其药学上可接受的盐、水合物或前药：
其中：
l为
本发明优选化合物包括，但不限于：
根据本发明，药学上可接受的盐包括与下列酸形成的加成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、苯磺酸、琥珀酸以及类似的已知可以接受的酸成盐。
此外，本发明还包括本发明衍生物的前药。它们自身可能具有较弱的活性甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。
本发明还提供了所述的双功能分子的制备方法：
n选自1-10之间的整数。
步骤a：将化合物1(shp099)溶于适量乙腈中，在碱性条件下(如碳酸钾)向反应体系中加入溴代丙炔，加热回流一段时间后，加入适量水，经乙酸乙酯萃取，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到化合物2；
步骤b：将化合物3(沙利度胺衍生物)溶于适量dmf中，向反应体系中加入适量dipea，90℃反应一段时间，加入适量水，乙酸乙酯萃取，收集有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到化合物4n；
步骤c：化合物2与化合物4n，以thf/h2o＝1:1(v/v)为溶剂，通过cuso4催化的click反应进行连接，经硅胶柱层析纯化，得到化合物spn。
一种药物组合物，含有治疗有效量的上述任意一项化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、水合物、前药以及药学上可接受的载体、稀释剂、辅剂、媒介物或它们的组合。
其中，所述的药物组合物的剂型为注射剂、片剂和胶囊剂中的任意一种。
本发明还提供了上述的化合物及其药学上可接受的盐或上述的组合物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
本发明以protac技术为支撑，以现有的shp2抑制剂(shp099)为原料，合成linker长度不同的shp2蛋白水解靶向嵌合分子(spn)。shp099是shp2的变构抑制剂，具有活性强、选择性好、口服生物利用度高等特点。
本发明有效地靶向并降解shp2；类似于催化反应，药物起效剂量低；只提供结合活性，是事件驱动，区别于传统的占有驱动，不需直接抑制目标蛋白的功能活性；药物不需要与目标蛋白长时间和高强度的结合。本发明涉及的shp2蛋白靶向降解剂为shp2介导的肿瘤和/或其他疾病的治疗，提供了新的治疗方式。
本发明通过酶活性评价体系评价合成的4个protac(sp2-sp5)以及shp099对shp2酶活性的抑制活性，并通过细胞水平进一步验证了sp3、sp4的生物学活性以及对shp2蛋白的靶向降解活性，认为sp3、sp4可以作为shp2蛋白靶向降解剂，为shp2介导的肿瘤和/或其他疾病的治疗，提供新的治疗方式。
其中，所述肿瘤为多发性骨髓瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌、髓母细胞瘤、急性髓细胞性白血病、慢性白血病、黑色素瘤、前列腺癌、肝细胞瘤、肾细胞瘤、宫颈癌、皮肤癌、卵巢癌、结肠癌、神经胶质瘤、甲状腺癌和胰腺癌任意一种。
附图说明
图1sp2-sp5以及shp099对shp2酶活性抑制的ic50；
图2sp2-sp5以及shp099、pomalidomide对hela细胞存活率的影响；
图3在hela细胞中，sp4介导的shp2蛋白的降解特性。
a：在hela细胞中，不同浓度sp4作用24小时后，shp2蛋白的降解情况；
b：在hela细胞中，不同浓度sp4作用48小时后，shp2蛋白的降解情况；
c：在hela细胞中，不同浓度sp4作用96小时后，shp2蛋白的降解情况；
d：100nm的sp4作用0-96小时，shp2蛋白的降解情况；
e：2.5μm的mg-132对sp4介导的shp2蛋白降解的逆转作用；
图4sp4对shp2蛋白的降解导致hela细胞的凋亡。
a：不同浓度的sp4对hela细胞中parp,bcl-xl,caspase-9,caspase-3蛋白水平的影响；
b：不同浓度的sp4对hela细胞中jnk,erk和p38蛋白水平的影响；
c：sp4促进hela细胞的凋亡；
d：sp4导致hela细胞细胞周期的s期阻滞。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1化合物2的合成
100mg化合物1(shp099)溶解于5mlch3cn中，搅拌条件下，依次加入24μl溴丙炔、107mg碳酸钾粉末和21mgk2co3，加热回流反应6小时，反应液冷却后，加入30ml水和30ml乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩后得到粗品，经硅胶柱层析纯化，二氯甲烷-甲醇＝40:1(v/v)洗脱，得黄色固体50.1mg，收率50％。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.61(s,1h),7.49(dd,j＝7.6,2.0hz,1h),7.34–7.28(m,2h),4.22(s,2h),3.70–3.57(m,4h),3.44(d,j＝2.4hz,2h),2.22(t,j＝2.4hz,1h),1.69–1.62(m,4h),1.22(s,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ154.1,150.4,139.9,134.2,132.9,130.8,130.6,128.4,125.8,119.7,83.6,71.6,51.8,41.3,36.9,31.6,25.4.
实施例2化合物4n(n＝4)的合成
58mg化合物3(沙利度胺衍生物)(可购买获得)于茄形瓶中，加入3mldmf，搅拌下依次加入50mg叠氮基-peg4-胺(可购买获得)和47μldipea，90℃反应3-4小时，加入30ml水和30ml乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩后得粗品，经硅胶柱层析纯化，石油醚-乙酸乙酯1:2至1:4梯度洗脱，得黄色油状物40.9mg，收率41％。
441hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.81(brs,1h),7.48(dd,j＝8.0,7.2hz,1h),7.09(d,j＝7.2hz,1h),6.92(d,j＝8.8hz,1h),6.49(t,j＝5.6hz,1h),4.95–4.90(m,1h),3.72(t,j＝5.2hz,2h),3.68–3.66(m,14h),3.48(q,j＝5.6hz,2h),3.38(t,j＝5.0hz,2h),2.88–2.72(m,3h),2.13–2.09(m,1h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ171.6,169.4,168.8,167.8,146.9,136.1,132.6,116.9,111.7,110.3,70.8,70.74,70.71,70.7,70.65,70.62,70.1,69.6,50.8,48.9,42.5,31.5,22.9.
实施例3化合物4n(n＝2)的合成
具体操作及配比参考化合物4n(n＝4)的制备。
42，黄色油状物，收率40％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.06(brs,1h),7.49(t,j＝7.8hz,1h),7.09(dd,j＝7.2,2.0hz,1h),6.93(d,j＝8.4hz,1h),6.50(t,j＝5.6hz,1h),4.96–4.92(m,1h),3.74(t,j＝5.2hz,2h),3.70–3.67(m,6h),3.48(q,j＝5.6hz,2h),3.38(t,j＝4.4hz,2h),2.80–2.73(m,3h),2.13–2.10(m,1h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ171.7,169.4,168.8,167.7,146.9,136.1,132.6,116.9,111.6,110.3,70.75,70.72,70.1,69.6,50.7,48.9,42.4,31.5,22.8.
实施例4化合物4n(n＝3)的合成
具体操作及配比参考化合物4n(n＝4)的制备。
43，黄色油状物，收率40％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.85(brs,1h),7.43(dd,j＝8.4,7.2hz,1h),7.04(d,j＝7.2hz,1h),6.88(d,j＝8.4hz,1h),6.44(t,j＝5.6hz,1h),4.92–4.87(m,1h),3.68(t,j＝5.4hz,2h),3.64–3.61(m,10h),3.43(q,j＝5.6hz,2h),3.33(t,j＝5.0hz,2h),2.83–2.68(m,3h),2.08–2.05(m,1h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ171.7,169.4,168.8,167.7,146.9,136.1,132.5,116.9,111.6,110.3,70.7,70.0,69.5,50.7,48.9,42.4,31.5,22.8.
实施例5化合物4n(n＝5)的合成
具体操作及配比参考化合物4n(n＝4)的制备。
45，黄色油状物，收率42％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.82(brs,1h),7.48(dd,j＝8.0,7.2hz,1h),7.09(d,j＝7.2hz,1h),6.92(d,j＝8.8hz,1h),6.49(t,j＝5.6hz,1h),4.95–4.90(m,1h),3.72(t,j＝5.2hz,2h),3.68–3.66(m,18h),3.49(q,j＝5.6hz,2h),3.38(t,j＝5.0hz,2h),2.88–2.72(m,3h),2.13–2.09(m,1h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ171.6,169.4,168.7,167.8,146.9,136.1,132.6,116.9,111.7,110.3,70.8,70.72,70.71,70.6,70.5,70.1,69.6,50.8,48.9,42.5,31.5,22.9.
实施例6终化合物spn(n＝4)的合成
17.4mg化合物2用2ml四氢呋喃:水(v/v＝1:1)混合溶液溶解，搅拌下依次加入23.3mg化合物44，9.0mg硫酸铜和23.8mg抗坏血酸钠，室温下反应直到反应完全，加入30ml水和30ml乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩后得到粗品，经硅胶柱色谱纯化，二氯甲烷：甲醇(v/v＝40:1)洗脱，得黄色固体9mg，收率22％。
sp4，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.10(s,1h),8.99(s,1h),8.22(s,1h),7.63–7.51(m,3h),7.37(t,j＝7.8hz,1h),7.29(dd,j＝7.7,1.6hz,1h),7.12(d,j＝8.6hz,1h),7.02(d,j＝7.1hz,1h),6.59(t,j＝5.8hz,1h),5.69(s,1h),5.07–5.02(m,1h),4.58(t,j＝5.2hz,2h),3.82(t,j＝5.2hz,2h),3.59(t,j＝5.3hz,2h),3.54–3.42(m,18h),2.97–2.76(m,2h),2.67–2.51(m,3h),2.34(d,j＝9.5hz,2h),1.94(d,j＝33.1hz,4h),1.54(s,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ171.65,169.93,168.49,167.32,153.73,150.12,146.97,138.89,136.25,133.83,132.68,132.56,130.98,130.32,128.03,125.53,123.58,123.32,119.28,116.35,111.83,110.45,77.43,70.89,70.79,70.71,70.59,69.64,69.59,60.58,52.53,50.36,49.06,42.54,40.95,37.10,36.08,31.62,24.60,22.97,21.24,14.37.hrms(esi ):m/zcalculatedforc42h51cl2n11o8[m h] ,908.3372；found,908.3246.
实施例7终化合物spn(n＝2)的合成
具体操作及配比参考化合物spn(n＝4)的制备。
sp2，黄色固体，收率24％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.08(s,1h),9.01(s,1h),8.21(s,1h),7.61(dd,j＝8.0,1.7hz,1h),7.58–7.48(m,2h),7.38(t,j＝7.9hz,1h),7.29(dd,j＝7.7,1.6hz,1h),7.10(d,j＝8.5hz,1h),7.01(d,j＝7.1hz,1h),6.59(s,1h),5.69(s,1h),5.04(dd,j＝12.8,5.3hz,1h),4.59(d,j＝5.4hz,2h),3.84(t,j＝4.9hz,2h),3.81–3.39(m,17h),2.31(s,2h),1.95(d,j＝44.1hz,4h),1.53(s,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ171.88,169.75,169.37,167.82,153.36,150.24,146.86,139.25,136.30,133.84,132.74,132.58,130.41,130.33,128.02,125.54,119.32,116.90,111.91,110.51,70.57,70.44,69.79,69.18,60.58,49.21,42.43,40.99,36.24,31.76,29.23,23.20,22.83,22.80,21.24,18.94,14.30,11.61.hrms(esi ):m/zcalculatedforc38h43cl2n11o6[m h] ,820.2848；found,820.2807.
实施例8终化合物spn(n＝3)的合成
具体操作及配比参考化合物spn(n＝4)的制备。
sp3，黄色固体，收率20％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.10(s,1h),7.95(s,1h),7.75–7.45(m,3h),7.45–7.19(m,2h),7.07(dd,j＝37.1,7.8hz,2h),6.59(d,j＝6.1hz,1h),5.61(s,1h),5.04(dd,j＝12.8,5.4hz,1h),4.47(t,j＝5.2hz,2h),4.10–3.37(m,19h),3.01–2.52(m,4h),2.14–1.86(m,2h),1.59(d,j＝47.7hz,5h),1.29–1.12(m,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ172.11,169.80,169.29,168.10,154.04,150.92,147.21,139.18,136.52,134.10,132.97,132.85,130.69,130.61,128.71,125.75,123.64,119.53,117.69,112.53,110.74,71.20,71.08,70.99,70.97,69.94,69.88,60.86,52.17,50.63,49.38,42.83,41.25,37.37,36.48,31.93,25.14,23.21,21.51,14.65.hrms(esi ):m/zcalculatedforc40h47cl2n11o7[m h] ,864.3110；found,864.3053.
实施例9终化合物spn(n＝5)的合成
具体操作及配比参考化合物spn(n＝4)的制备。
sp5，黄色固体，收率24％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.10(s,1h),7.951hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.11(s,1h),8.96(s,1h),7.86–7.51(m,2h),7.46(ddd,j＝8.3,5.1,3.0hz,2h),7.30(td,j＝7.2,1.9hz,1h),7.07(d,j＝7.0hz,1h),6.88(d,j＝8.5hz,1h),6.48(s,1h),5.32(t,j＝4.9hz,1h),4.89(dd,j＝11.6,5.5hz,1h),4.63–4.17(m,4h),4.09(q,j＝7.2hz,3h),3.93(s,1h),3.84(t,j＝5.2hz,1h),3.76–3.40(m,20h),2.87–2.68(m,3h),2.19(t,j＝7.6hz,4h),1.68(d,j＝49.8hz,4h),1.23(s,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)δ171.68,169.43,168.95,167.80,153.72,150.10,146.95,138.88,136.20,133.79,132.66,132.54,130.38,130.30,127.99,125.45,123.47,119.23,116.95,111.77,110.43,77.43,70.88,70.77,70.69,70.66,70.62,70.58,70.55,69.56,50.35,49.05,42.50,40.94,37.10,36.10,31.60,29.84,29.46,27.35,24.27,22.95,22.83,14.27.hrms(esi ):m/zcalculatedforc44h55cl2n11o9[m h] ,952.3634；found,952.3704.
实施例10shp2蛋白的克隆、表达和纯化
将人类shp2(ncbirefseqnp_002825.3)克隆到pet30a中，在大肠杆菌bl21star(de3)中表达。转染了重组质粒的bl21菌株在37℃培养3-4h,后加1mmiptg，在18℃时促进蛋白表达。18℃过夜生长后，3000g离心10min收集细菌。细菌在裂解缓冲液(50mmtris-hcl,ph8.5,25mm咪唑,500mmnacl,2.5mmmgcl2,1mmtcep,1mmpmsf)中超声破碎，40000g离心1h，收集上清为蛋白粗品。蛋白粗品中加入4m咪唑溶液至终浓度为0.10m，使用的aktapure蛋白纯化系统纯化目的蛋白。样品上样前先用bindingbuffer平衡ni-nta亲和层析柱。然后将上清液以相同的流速通过亲和色谱柱，使含有6-histag的目的蛋白充分结合在ni-ntaagarose亲和色谱柱上。上样结束后，用bindingbuffer冲柱。再用elutionbuffer进行洗脱。
bindingbuffer配方：50mmtris-hcl,500mmnacl,25mm咪唑
elutionbuffer配方：50mmtris-hcl,500mmnacl,200mm咪唑将目的蛋白溶液转移至30kda的蛋白浓缩管中，4℃，3000rpm浓缩至5ml后，用分子排阻色谱洗脱体系(200mmnacl，20mmtris-hclph＝8.80)置换蛋白溶液中的咪唑。使用aktapure蛋白纯化系统，选用分子排阻层析柱进一步纯化目的蛋白。
实施例11体外酶抑制实验
在50微升缓冲液(60mmhepes,ph7.2,75mmkcl,75mmnacl,5mmdtt,0.05％triton-x100,1mmedta)中，加入2.5nm的shp2蛋白和0.5m二磷酸化的irs1多肽以及不同浓度的化合物(sp2-sp5以及shp099)，在25℃下孵育60min后，加入2.5mmdifmup，用酶标仪(spectramaxm5eplateread)检测荧光信号，ex/em＝340/450nm，每分钟检测一次，共检测30次。用graphpadprism计算sp2、sp3、sp4、sp5的ic50值分别为0.306μm、0.945μm、0.714μm、1.084μm。结果表明，sp2-sp5具有中等强度的shp2蛋白抑制活性，提示其作用机制可能发生改变，如由占位抑制变为靶向降解。
实施例12cck8法检测细胞存活率
取对数期生长的hela细胞，用胰酶消化，铺96孔板，密度5000个/孔，24h后，用不同浓度梯度(0-200μm)的sp2-sp5以及shp099、pomalidomide处理。在给药24h后用cck-8在450nm波长下，检测活细胞数目。结果显示，sp3和sp4对hela细胞生长具有强烈的抑制作用，sp2、sp3、sp4、sp5对hela细胞均有不同程度的生长抑制作用，尤其是sp3和sp4，其ic50值分别为5.77nm、4.30nm，活性提高100倍左右。
实施例13不同浓度的sp4对hela细胞中parp,bcl-xl,caspase-9,caspase-3,jnk,erk和p38蛋白水平的影响
1.给药不同浓度sp4的hela细胞总蛋白质样品的提取
(1)用细胞刮收集六孔板中的hela细胞，低速离心，得到细胞沉淀。
(2)取pmsf加至适量ripa裂解液(中)，混匀，终浓度为1mm。
(3)细胞沉淀中加入40μl裂解液，用枪头吹打均匀，置于冰上裂解，每隔10min涡旋一次，共裂解30min。裂解完毕后，于4℃,14000rpm，离心10min，弃沉淀，收集上清液。
2.bca法测定总蛋白浓度
(1)蛋白标准品的准备：完全溶解蛋白标准品(5mg/ml)，取10μl稀释至100μl，使其终浓度为0.50mg/ml。
(2)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl分别加至96孔板的标准品孔内，加标准品稀释液补足到20μl，即标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/ml。
(3)取20μl待测蛋白样品加至96孔板样品孔内。
(4)各孔均加入200μlbca工作液，37℃放置20min。若蛋白浓度较低，可适当延长孵育时间或者提高孵育温度。
(5)用酶标仪测定各孔在562nm处的吸光度值。
(6)绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
3.电泳
电泳电流设置为200ma，电泳时间120min。上样时需要根据bca法计算蛋白浓度，确保样品孔中的上样量一致，每孔上样量为40μg。
4.westernblot转膜
电泳结束后，从正极到负极依次将多孔垫片、滤纸、pvdf膜(预先用甲醇活化)、凝胶、滤纸、多孔垫片，放入转膜仪中，恒电流120ma转膜。各夹层之间不能有明显空气泡。
5.免疫检测
(1)封闭：确认转膜成功后，取出pvdf膜，用tbst洗涤后加入5％脱脂奶粉，室温轻摇30min，封闭非特异性蛋白。
(2)抗原-抗体特异性反应：分别加入parp,bcl-xl,caspase-9,caspase-3,jnk,erk,p38和内参抗体β-actin，4℃孵育过夜。随后用pbst轻摇洗膜3次，每次15min。加入hrp酶标记的igg二抗(1:1500)，室温轻摇2h，pbst洗涤3次，每次15min。(3)ecl显影：将pvdf膜置于ecl化学发光试剂中反应1-2min。常规方法显影、定影。
(4)定量分析：凝胶成像系统扫描分析条带光密度值(od值)。计算每个蛋白条带od值与内参照β-actin条带的od值的比值，并以对照组为1进行校对后表示。
结果表明，sp4以剂量依赖性的方式引起parp,bcl-xl,caspase-9,caspase-3的蛋白水平降低，提示其激活caspases引起细胞凋亡。与此同时，sp4可以抑制jnk,erk,p38活性形式，表明sp4通过抑制shp2的催化活性，进而抑制ras/mapk信号转导和细胞应答。
实施例14在hela细胞中，sp4介导的shp2蛋白的降解
(1)将处于对数期的hela细胞用新鲜培养基制成浓度为2×105/ml的细胞悬液,混匀后加入6孔板中；
(2)①待细胞贴壁后加入不同浓度(100000,3333.3,1111.1,370.4,123.5,41.2,13.7,4.6,1.5,0.5,0nm)的sp4，各处理24,48,96小时后，离心收集细胞；
或②待细胞贴壁后加入100nm的sp4，各处理0,12,24,48,72,96小时后，离心收集细胞；
③待细胞贴壁后，加入0.0μm或者2.5μm的mg132预处理细胞12小时，再加入不同浓度(13.7,4.6,0nm)的sp4，处理48小时后，离心收集细胞；
(4)将(2)中收集的细胞按实施例13中的方法跑western，并用shp2抗体检测shp2蛋白的降解情况。
结果表明，sp4以时间依赖性的方式显著降低hela细胞内shp2蛋白水平，此外蛋白酶体抑制剂mg-132可以完全阻断这一过程，说明sp4具有通过蛋白酶体途径特异性地诱导shp2蛋白降解的作用。
实施例15sp4促进hela细胞的凋亡
(1)将处于对数期的hela细胞用新鲜培养基制成浓度为2×105/ml的细胞悬液,混匀后加入6孔板中，待细胞贴壁后加入不同浓度的药物(sp4以及shp099)处理。
(2)在孵箱中培养24小时后，离心收集细胞；
(3)吸除上清，再加入预冷的pbs轻轻混匀，转移至流式管中离心，去除pbs，然后将细胞适当分散，避免细胞成团；
(4)向每管中加入500μlbindingbuffer重悬细胞，充分混匀后加入5μlannexinv-fitc溶液，5μlpi溶液，轻轻混匀后在常温下避光反应10分钟使两种荧光染料充分染色；
(5)用流式细胞仪进行检测，激发光波长为488nm，用波长为515nm的通道滤光器检测fitc荧光，另一大于560nm波长的通道滤光器检测pi荧光，并用相关软件来分析数据。
结果表明，相比于shp099，sp4具有更好的促hela细胞凋亡活性。与对照组相比(0.13％)，100nm的sp4可以引起54.01％的细胞发生凋亡，而1000nm的shp099仅引起33.74％的细胞发生凋亡。
实施例16sp4导致hela细胞细胞周期的s期阻滞
(1)将处于对数期的hela细胞用新鲜培养基制成浓度为2×105/ml的细胞悬液,混匀后加入6孔板中，待细胞贴壁后加入不同浓度的药物(sp4以及shp099)处理。
(2)在孵箱中培养24小时后，离心收集细胞，pbs洗3遍；
(3)加入1ml预冷的70％的乙醇，轻轻吹打混匀，4℃固定2小时。
(4)染色：每管细胞样品中加入0.5ml碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光，温浴30分钟，完成流式检测。用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞dna含量分析和光散射分析。
结果表明，sp4可以引起hela细胞在s期发生细胞周期阻滞。
1.如式i所示的基于cereblon配体诱导shp2蛋白降解的双功能分子化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或前药：
其中：
所述的b是e3泛素连接酶复合体中cereblon蛋白的小分子配体，其选自沙利度胺及其衍生物、来那度胺及其衍生物、泊马度胺及其衍生物；
所述的l是连接臂，通过共价键与nh和b相连，共同构成双功能分子化合物。
2.根据权利要求1所述的双功能分子化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或前药：其中，所述的l为如下结构中的一种：
n选自1-10之间的整数。
3.根据权利要求1或2所述的双功能分子化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或前药：
其中，
所述的b为如下结构中的一种：
w选自ch2、c＝o、so2、nh、n-c1-c4烷基；
x选自o、s；
z选自氢、c1-c4烷基、c3-c6环烷基、卤素；
g、g′选自h、c1-c4烷基、-oh、c1-c4烷基取代的5-10元杂环基，所述杂环基含有1-3个n、o或s的杂原子；
r1选自h、d、卤素、硝基、氨基、氰基、羟基、c1-c4烷基、卤代c1-c4烷基、氘代c1-c4烷基。
4.根据权利要求1-3任何一项所述的双功能分子化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或前药：
其中：
r1选自选自h、d、卤素、硝基、氨基、氰基、羟基、c1-c4烷基、卤代c1-c4烷基、氘代c1-c4烷基；
l为如下结构中的一种：
n选自1-10之间的整数。
5.根据权利要求4所述的双功能分子化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或前药：
其中：
l为
n选自1-10之间的整数。
6.如下化合物或其药学上可接受的盐：
7.根据权利要求1所述的双功能分子化合物的制备方法，其特征在于，
其中，n为1-10之间的整数。
8.一种药物组合物，其特征在于，其中含有治疗有效量的权利要求1-6中任何一项所述的化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或前药以及药学上可接受的载体、稀释剂、辅剂、媒介物或它们的组合。
9.权利要求1-6中任何一项所述的化合物及其药学上可接受的盐、水合物或前药或权利要求8所述的组合物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为多发性骨髓瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌、髓母细胞瘤、急性髓细胞性白血病、慢性白血病、黑色素瘤、前列腺癌、肝细胞瘤、肾细胞瘤、宫颈癌、皮肤癌、卵巢癌、结肠癌、神经胶质瘤、甲状腺癌或胰腺癌。
技术总结