(一)技术领域
本发明涉及一种含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物及其制备与在抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成中的应用，属于精细有机化学及生物医药技术领域。
(二)
背景技术：
微生物危害、感染和耐药是人类健康发展面临的重大难题之一，解决细菌感染及其耐药性问题已成为目前研究的热点和难点。传统抗生素的抗菌方法为杀菌或抑菌，巨大的生存压力在一定程度上催生了细菌的耐药性(eur.j.med.chem，2019，161，154-178.)。近年来的研究表明，细菌生物被膜(bacteriabiofilm,bbf)是细菌耐药性形成的重要机制之一，也是引起大量医源性感染的主要原因。
铜绿假单胞菌的生物被膜是细菌耐药性形成的重要机制之一，它由其自身分泌的胞外聚合物(extracellularpolymericsubstances,eps)组成。以生物被膜包裹形式存在的细菌比浮游形式存在细菌耐药性强100～1000倍(curropinpharmacol,2013,13(5)：699-706.)。生物被膜的存在增强了细菌在各类复杂环境下的适应性，提高了细胞耐受力，使细菌具有较强的致病性，造成细菌感染现象。再者，生物被膜菌对抗生素抵抗力较强，生物被膜形成后，使得抗生素的抑菌作用显著降低，药物的抑菌浓度显著提高，在一定程度上促进了细菌耐药性的形成，为解决细菌耐药性问题带来极大的挑战。因此，抑制生物被膜形成是解决细菌耐药性问题和防治细菌感染的潜在策略之一。研发以抑制生物被膜形成为目的先导化合物，对于解决细菌感染和耐药性等问题具有重要的研究意义。
(三)
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物及其制备方法与在抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成中的应用，在与抗生素联合用药方面具有一定的应用前景。
本发明采用的技术方案：
第一方面，本发明提供一种式(i)所示含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物，结构式如下：
式(i)中，r为一个或多个(优选一个)，所述r为氢、卤素、硝基、c1～c4的烷基或c1～c4烷氧基。
进一步，优选所述r为4-甲氧基、2-氯基、3-氯基、4-氯基、4-溴基、2-氟基、3-氟基、4-氟基、2，4-二氟基、2，6-二氟基、2-硝基、3-硝基或4-硝基。
进一步，优选式(i)所示化合物为下列之一：
第二方面，本发明提供一种式(i)所示化合物的制备方法，所述方法的反应式如下：
式(ii)和式(iii)中r同式(i)；
具体制备方法为：
(1)在氮气保护下，式(ii)所示化合物与氯化亚砜(socl2)和二氯甲烷，在40-45℃进行回流反应，反应完全冷却至室温后，用旋转蒸发仪减压浓缩除去反应溶剂，获得式(iii)所示化合物，无需纯化可直接用于下一步反应；
(2)在稀释剂二氯甲烷作用下，式(iii)所示化合物与吲哚啉、碱，在25-30℃下进行反应，反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，加水淬灭反应，水相用乙酸乙酯萃取(10ml×3)，合并乙酸乙酯相并用无水硫酸钠干燥，浓缩至无液体蒸出，最后用石油醚/乙酸乙酯(体积比为3：1)为洗脱剂进行硅胶柱层析，收集rf值为0.2～0.3的组分，得到式(i)所示含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物；所述的碱选自于三乙胺、吡啶、n-甲基吗啉的一种，最优选三乙胺。
其中，步骤(1)式(ii)所示化合物与socl2的物质的量之比为1:10～15，更优选为1:13。所述二氯甲烷体积加入量以式(ii)所示化合物物质的量计为5-20ml/mmol。
其中，步骤(2)式(ii)所示化合物与吲哚啉的物质的量之为1:1～1.5，更优选为1:1。所述式(ii)所示化合物与碱物质的量之比为1:0.1-1.0，优选1:0.5；所述二氯甲烷体积加入量以式(ii)所示化合物物质的量计为1-10ml/mmol，优选5ml/mmol。
进一步，步骤(1)具体方法为：在氮气保护下，将式(ii)所示化合物用二氯甲烷a溶解，室温(25℃)磁力搅拌15min后，加入氯化亚砜，在40-50℃下回流反应1.5-4.0小时(优选50℃反应3h)；反应结束后，冷却至室温，反应液减压浓缩以去除溶剂(优先选用旋转蒸发仪除去二氯甲烷以及多余的氯化亚砜)，再次加入二氯甲烷b溶解，并减压浓缩除去溶剂和多余的二氯亚砜，重复加入二氯甲烷b和减压浓缩步骤2-3次，得到式(iii)所示化合物，呈褐色的油状或固体物；所述二氯甲烷a和二氯甲烷b均为二氯甲烷，字母本身没有含义，二氯甲烷a与二氯甲烷b体积比为2:1，所述二氯甲烷a用量以式(ii)所示化合物物质的量计为10ml/mmol，所述二氯甲烷b用量以式(ii)所示化合物物质的量计为5ml/mmol。
进一步，步骤(2)具体方法为：将二氯甲烷、碱和吲哚啉混合溶解后，缓慢滴加至式(iii)所示化合物中，在室温(25℃)下搅拌反应完全后(用tlc监测反应进程，展开剂：石油醚/乙酸乙酯体积比为3：1)，减压浓缩除去溶剂，加体积浓度50％乙酸乙酯水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取水相(优选萃取3次)至水相中无产物，合并乙酸乙酯相，加入无水硫酸钠或无水硫酸镁干燥，浓缩至无液体蒸出，最后进行硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯(体积比为3：1)为洗脱剂，收集rf值为0.2～0.3的组分，获得式(i)所示含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物；所述吲哚啉与式(ii)所示化合物物质的量之比为1:1。
第三方面，本发明还提供一种式(i)所示含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物在制备铜绿假单胞菌生物被膜形成抑制剂中的应用，所述铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明合成了一类结构创新的含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物，此类化合物在不影响铜绿假单胞菌正常生长的前提下可有效抑制细菌生物被膜的形成，以减少耐药性的产生。其中铜绿假单胞菌生物被膜抑制最高是对位溴原子取代化合物(i-10)，其在200μm浓度下的抑制率高达50.92％。并且此类化合物在与抗生素联用解决耐药性问题上具有巨大的应用潜力。
(四)附图说明
图1为化合物i-7的核磁共振氢谱图。
图2为化合物i-8的核磁共振氢谱图。
图3为化合物i-9的核磁共振氢谱图。
图4为化合物i-10的核磁共振氢谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
实施例1：吲哚啉-1-基(5-(4-甲氧基苯基))呋喃-2-基)甲酮(i-1)的制备
1)在氮气保护下，向100ml的两口烧瓶中加入218mg(1mmol)的5-(4-甲氧基苯基)呋喃-2-羧酸(ii-1)和10ml(0.156mol)的二氯甲烷。室温(25℃)磁力搅拌15min后，加入2ml(26mmol)的氯化亚砜，在50℃下回流反应3小时。反应结束后，冷却至室温，用旋转蒸发仪除去反应溶剂和多余的二氯甲烷。再加入5ml(78mmol)二氯甲烷，再次减压除去。此步骤重复2至3次后，得到褐色油状物iii-1。因化合物iii-1对水敏感，无需进一步分离纯化处理可直接用于下一步反应；
2)室温下(25℃)，称取119.2mg(1mmol)的吲哚啉，先加入5ml(78mmol)的二氯甲烷和0.5ml的三乙胺溶解，再将混合溶液缓缓滴加至步骤1)获得的化合物(iii-1)中，并搅拌。用tlc点板监测反应进程(展开剂：石油醚/乙酸乙酯体积比为3：1)。当反应完毕后，用旋转蒸发仪除去反应溶剂，加入10ml水和10ml乙酸乙酯进行萃取，再用乙酸乙酯(10ml)萃取水相3次。当tlc点板检测水相无产物，弃水相，用饱和食盐水洗涤乙酸乙酯相，再用无水硫酸钠或无水硫酸镁干燥，浓缩至无液体蒸出。最后进行硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯体积比为3：1)，收集rf值为0.2的组分。最终得到黄色固体化合物i-1，产率53.3％。
相同条件下，分别将步骤(1)中ii-1替换为ii-1～ii-10分别制备得到产物i-1～i-10，详情见表1，其中ii-1～ii-10对应的r基团分别为4-ome、3-f、4-f、3-cl、2-no2、3-no2、4-no2、2,4-di-f、2,6-di-f、4-br。
化合物i-7到化合物i-10的核磁共振氢谱图见图1-4所示，化合物i-1到化合物i-6经核磁共振氢谱图鉴定，结果如表1。
表1式i所示化合物的理化常数及核磁共振氢谱数据
实施例2：式(i)所示化合物对铜绿假单胞菌生长的影响
1、实验菌株：铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1
2、实验方法：在无菌环境下，用无菌接种环往新鲜lb固体培养基平板内接种少量铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1菌体，在生化培养箱内37℃培养24小时。从lb平板上挑取活化后的单个菌落接种至100ml新鲜lb液体培养基内，以37℃，200rpm振荡培养至对数生长期。随后，将菌液用新鲜lb液体培养基稀释100倍备用。以不含菌液的lb液体培养基为对照，为确保式(i)化合物的终浓度为200μm，往96孔板内加入浓度为20mm的式(i)化合物的甲醇溶液2μl，并待甲醇全部挥发完毕后，加入200μl稀释后的菌液，再将孔板放置于生化培养箱内37℃培养24小时。最后在600nm下测量吸光度(angew.chem.int.ed.2012,51,5226-5229)。生长抑制率的计算公式如下：
表2式i所示化合物对铜绿假单胞菌pao1生长的影响
从表2可以看出在200μm浓度下，该含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物对铜绿假单胞菌的生长抑制率几乎都低于20％，均处于正常的影响范围之内(±20％)。因此，可认为该类化合物对铜绿假单胞菌的生长不会产生过多的影响。
实施例3：式(i)所示含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物对铜绿假单胞菌生物被膜生长的活性测试
1、实验菌株：铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1
2、实验方法：在无菌环境下，用无菌接种环往新鲜lb固体培养基平板内接种少量铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1菌体，在生化培养箱内37℃培养24小时。从lb平板上挑取活化后的单个菌落接种至100ml新鲜lb液体培养基内，以37℃，200rpm振荡培养至对数生长期。随后，将菌液用新鲜lb液体培养基稀释100倍，作为稀释菌液，备用。
设置实验组、对照组和空白组，每个组均设置3个平行，实验组为化合物(i-1)～(i-10)，对照组为白藜芦醇(resveratrol)，空白组为稀释菌液(即无处理的铜绿假单胞菌)。采用溶剂蒸发的方法，将化合物(i-1)～(i-10)分别溶于甲醇中制备成母液，加到96孔板中，孔板置于超净工作台内。待甲醇完全挥发，添加稀释后的菌液，并确保每孔化合物(i-1)～(i-10)、白藜芦醇的终浓度均为200μm。在紫外杀菌照射下灭菌30min后，孔板移至生化培养箱内，37℃静置培养24小时。
培养完毕后，用移液枪吸取出细菌悬浮菌液(注意不要触碰到孔壁和孔底)。为除去孔内非生物被膜相关的生物组织，每孔加入225μl的pbs缓冲液洗涤，随后吸取出pbs缓冲液，重复2～3次。为将生物被膜固定于孔板内，把孔板置于烘箱内以37℃烘干脱水。每孔用200μl的0.1％结晶紫染色液对烘干的生物被膜进行染色，约15min染色结束后倾倒除去结晶紫溶液。先用200μl的pbs缓冲液洗涤孔板，再用纯水冲，直至洗涤出的液体中无紫色。随后，为再次将生物膜固定于孔板内，把孔板置于烘箱内于37℃下烘干脱水。烘干的结晶紫染色的生物被膜每孔用200μl的30％的冰醋酸溶液重新溶解。溶解15min后，测量其在590nm下吸光度，吸光值直接反应了生物被膜的数量(chembiolo,2005,12(7):789-796)。生物被膜抑制率的计算公式如下：
表3式i所示化合物对铜绿假单胞菌pao1生物被膜形成的抑制率
从表3可以看出，在200μm浓度下，该类吲哚啉类化合物中除了对位氟基取代化合物(i-3)对铜绿假单孢菌生物被膜的形成有一定促进作用以外，其他化合物对铜绿假单胞菌生物被膜形成都具有一定的抑制作用，且具有良好的抑制活性。在卤素原子取代化合物中，溴原子取代化合物优于氯原子取代优于氟原子取代，体现除了取代基的不同对于抑制作用的影响，可发现含双氟原子、溴原子、硝基的化合物显示出更强的抑制活性。其中，对生物被膜形成的抑制活性最佳的含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物是对位溴原子取代化合物(i-10)，其在200μm浓度下的抑制率高达50.92％。
本发明公开一种含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物，其结构创新，制备方法简便，且具有较好的生物活性，可以有效抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成，在解决细菌感染及其耐药性问题方面具有一定的应用前景。
1.一种式(i)所示含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物：
式(i)中，r为一个或多个，所述r为氢、卤素、硝基、c1～c4的烷基或c1～c4烷氧基。
2.如权利要求1所述含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物，其特征在于所述r为4-甲氧基、2-氯基、3-氯基、4-氯基、4-溴基、2-氟基、3-氟基、4-氟基、2，4-二氟基、2，6-二氟基、2-硝基、3-硝基或4-硝基。
3.如权利要求1所述含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物，其特征在于所述化合物为下列之一：
4.一种权利要求1所述式(i)所示含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物的制备方法，其特征在于所述方法为：
(1)在氮气保护下，式(ii)所示化合物与氯化亚砜和二氯甲烷，在40-50℃回流反应，待反应完全冷却至室温后，减压浓缩除去反应溶剂，获得式(iii)所示化合物，无需纯化可直接用于下一步反应；
(2)在稀释剂二氯甲烷作用下，式(iii)所示化合物与吲哚啉、碱，在25-30℃下进行反应，反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，加体积浓度50％乙酸乙酯水溶液淬灭，水相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥，浓缩至无液体蒸出，最后用体积比为3：1的石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂进行硅胶柱层析，收集rf值为0.2～0.3的组分，得到式(i)所示含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物；所述的碱选自于三乙胺、吡啶、n-甲基吗啉的一种；
式(i)中，r为一个或多个，所述r为氢、卤素、硝基、c1～c4的烷基或c1～c4烷氧基；式(ii)和式(iii)中r同式(i)。
5.如权利要求4所述含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物的制备方法，其特征在于步骤(1)式(ii)所示化合物与氯化亚砜的物质的量之比为1:10～15；所述二氯甲烷体积加入量以式(ii)所示化合物物质的量计为5-20ml/mmol。
6.如权利要求4所述含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物的制备方法，其特征在于步骤(2)式(ii)所示化合物与吲哚啉的物质的量之为1:1～1.5；所述式(ii)所示化合物与碱物质的量之比为1:0.1-1.0；所述二氯甲烷体积加入量以式(ii)所示化合物物质的量计为1-10ml/mmol。
7.如权利要求4所述含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物的制备方法，其特征在于步骤(1)方法为：在氮气保护下，将式(ii)所示化合物用二氯甲烷a溶解，室温磁力搅拌15min后，加入氯化亚砜，在40-50℃下回流反应1.5-4.0小时；反应结束后，冷却至室温，反应液减压浓缩以去除溶剂，再次加入二氯甲烷b溶解，并减压浓缩除去溶剂和多余的二氯亚砜，重复加入二氯甲烷b和减压浓缩步骤2-3次，得到式(iii)所示化合物。
8.如权利要求4所述含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物的制备方法，其特征在于步骤(2)方法为：将二氯甲烷、碱和吲哚啉混合溶解后，缓慢滴加至式(iii)所示化合物中，在室温下搅拌反应完全后，减压浓缩除去溶剂，加体积浓度50％乙酸乙酯水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取水相至水相中无产物，合并乙酸乙酯相，加入无水硫酸钠或无水硫酸镁干燥，浓缩至无液体蒸出，最后进行硅胶柱层析，以体积比为3：1的石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，收集rf值为0.2～0.3的组分，获得式(i)所示含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物。
9.一种权利要求1所述式(i)所示含有吲哚啉和5-芳基呋喃骨架的化合物在制备铜绿假单胞菌生物被膜形成抑制剂中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1。
技术总结