本发明涉及荧光传感材料技术领域，具体涉及一种亚甲基紫衍生物荧光探针及其合成方法和应用。
背景技术：
硫离子存在于某些工业废水和生活污水中，质子化会产生剧毒的硫化氢，是一种公认的环境污染物；生物体内硫离子质子化形成硫化氢气体。随着对s2-研究的深入，发现低浓度质子化的硫离子是第三种重要内发挥生理作用的內源性气体信号分子，和很多疾病密切相关，该气体分子在心血管和神经系统担负着着重要的生理病理调节作用。研究表明，硫化氢的水平与多种疾病相关，包括阿尔茨海默症，唐氏综合症，糖尿病和肝硬化等。硫离子浓度一旦不能维持正常的生理浓度水平，也会影响硫化氢在生理上的水平。因此发展高选择性，高灵敏度的环境和生物体内硫离子的快速检测方法是有极其重要的意义。荧光探针作为检测与示踪待测物的重要工具，由于其荧光性质会随着所处环境的改变而灵敏改变，因此容易获得高灵敏度结果，且反应时间短、操作简单，因此已经被广泛应用于环境监测、有毒有害物质分析、生物化学检测、光电装置、示踪基因治疗、药物输送、肿瘤成像与细胞成像等领域。荧光探针可以通过荧光强度的变化直观体现离子的存在。但是目前有关识别硫离子的荧光探针的水溶性比较差，给检测废水与生物体中硫离子带来难度。
光动力疗法(photodynamictherapy,pdt)，是通过光动力学反应选择性破坏病变组织的非侵入式的全新技术，在近几十年的研究中引起了很多关注。pdt治疗的主要机理是利用可以转换三重氧的高效光敏剂(3o2)在特定光照条件下，转化生成单线态氧(1o2)或者活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ros)，继而杀死肿瘤细胞。从1991年，随着第一个光敏剂porfimersodium被加拿大政府批准用于光动力疗法的临床治疗以来，经过国内外科研工作者和临床医生的不断探索与努力，光动力治疗的研究、开发、应用迅速活跃起来。但是治疗效果相当局部且需要非常高的选择性，在没有定位基团的状况下，不能直接作用靶组织，对周围组织有危害作用。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种亚甲基紫衍生物荧光探针及其合成方法和应用。该荧光探针水溶性好，可用于硫离子检测，检测灵敏度高，检出限低，此外还可以作为肿瘤的光动力治疗探针，快速释放单线态氧，进行肿瘤的光动力治疗；合成简单，条件温和，成本低。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
提供一种亚甲基紫衍生物荧光探针，其分子结构通式如(1)所示：
其中：
r1＝r3r4或r4；
r2＝-nh2或-n(ch2ch3)2；
r3＝-nhcoch2-,-hn(ch2-o)n1-,-hn(ch2-nh)n2-,-hn(ch2)n3-或
按上述方案，r3中，n1取1-12的自然数，n2取1-12的自然数，n3取1-12的自然数。
提供上述亚甲基紫衍生物的荧光探针的制备方法，包括以下三个路线：
路线一：当r1＝-r3r4,r2＝-n(ch2ch3)2,r3＝-hncoch2-,-hn(ch2-o)n1-,-hn(ch2-nh)n2-或-hn(ch2)n3-时，包括以下步骤：
碱性条件下，亚甲基紫3rax与x-r5-x反应，得产物a，然后与哌嗪反应得产物b，继续与4-氯-7-硝基苯并呋咱(nbd-cl)反应，在哌嗪基团上引入nbd基团，即得亚甲基紫衍生物的荧光探针；其中x-r5-x中，x为cl或br，r5＝-coch2-、-(ch2-o)n1-或-(ch2-nh)n2-或-(ch2)n3-,反应式为：
路线二：当r1＝-r3r4,r2＝-n(ch2ch3)2,
将1-苯基哌嗪加入到亚甲基紫3rax的浓盐酸溶液中，反应得产物c，然后与nbd-cl反应，在哌嗪基团上引入nbd基团，即得亚甲基紫衍生物的荧光探针；反应式为：
路线三：当r1＝r4,r2＝-nh2时，包括以下步骤：
以4-氟硝基苯为原料，与哌嗪反应生成产物d，产物d中硝基还原得产物e，然后与苯胺反应得产物f，产物f与nbd-cl反应，在产物f的哌嗪基团上引入nbd基团,即得亚甲基紫衍生物的荧光探针，反应式为：
按上述方案，所述路线一中，具体步骤如下：
1)亚甲基紫3rax、x-r5-x和三乙胺溶于一定量的二氯甲烷中，室温搅拌5-8h，减压蒸干，柱层析分离，得到固体a，其中亚甲基紫3rax与x-r5-x的化合物的摩尔比为1：(1-1.2)；
2)固体a、哌嗪和碳酸钾溶于一定量的乙腈中，室温搅拌2-3h，减压蒸干，柱层析分离，得到固体b，其中固体a与哌嗪的摩尔比为1：(1-1.5)；
3)将固体b、nbd-cl和三乙胺溶于定量的二氯甲烷中，室温搅拌10-15h，减压蒸干，柱层析分离，得到亚甲基紫衍生物的荧光探针，其中固体b与nbd-cl的摩尔比为1：(1-1.5)。
按上述方案，所述路线二中，具体步骤如下：
1)室温下将一定量的亚甲基紫3rax加入到浓盐酸中搅拌3-4h后，将1-苯基哌嗪加入到亚甲基紫的浓盐酸溶液中，继续搅拌3-4h后，抽滤，得到蓝色固体c，其中亚甲基紫3rax和1-苯基哌嗪摩尔比为1：(1-1.5)；
2)将固体c、nbd-cl和三乙胺溶于定量的二氯甲烷中，室温搅拌10-15h，减压蒸干，柱层析分离，得到目标探针，其中固体c与nbd-cl的摩尔比为1：(1-1.5)。
按上述方案，所述路线三中，具体步骤如下：
1)将4-氟硝基苯、碳酸钾和哌嗪溶于dmso中，70℃-100℃下搅拌5-8h后，将反应液倒入适量冰水中，大量的黄色固体析出，抽滤，得到黄色固体d，其中4-氟硝基苯：哌嗪：碳酸钾＝1：(1.1-1.5)：(2-3)；
2)将步骤1)所得化合物d、铁粉和氯化铵加入适量的乙醇中回流，tlc监测直至原料点消失；待反应液冷却后，加入饱和碳酸氢钠溶液，充分搅拌后过滤，用乙酸乙酯萃取，减压蒸干，柱层析分离得褐色油状液体e，其中化合物d、铁粉和氯化铵摩尔比为1：(2-2.5)：(3-3.5)；
3)将步骤2)所得化合物e和苯胺分别加入乙酸/乙酸钠缓冲溶液中，再加入一定量的重铬酸钾到混合溶液中，在105℃-130℃下搅拌3-5h后，在避光条件下，冷却至室温后，过滤，得到红色固体f，其中化合物e、苯胺和重铬酸钾的摩尔比为1：(2-2.5)：(4-5)；
4)将固体f、nbd-cl和三乙胺溶于定量的二氯甲烷中，室温搅拌10-15h，减压蒸干，柱层析分离，得到目标探针，其中固体f与nbd-cl的摩尔比为1：(1-1.5)。
提供一种上述亚甲基紫衍生物荧光探针在硫离子检测方面的应用。
提供一种上述亚甲基紫衍生物荧光探针在制备光动力治疗探针方面的应用。
本发明的荧光分子探针与硫离子作用原理如下式：
该类探针为反应型探针，都是以r6(亚甲基紫3rax衍生物)作为荧光基团，nbd作为识别基团，与硫离子作用后，形成nbd-sh。
其中该类探针分子中nbd上的硝基具有强拉电子作用，使整个分子处于“推-拉”模式，在这个“推-拉”模式下，分子的荧光强很弱，当与硫离子作用后，“推-拉”作用消失，荧光强度会增强，所以可以通过荧光强度的变化实现对硫离子的检测。nbd基团是一个脂溶性很好的刚性分子，水溶性很差，本发明通过引入水溶性良好的亚甲基紫3rax的阳离子主体结构，可显著改善探针的水溶性，从而增加其在水中与硫离子之间的结合能力，提高了硫离子检测灵敏度，降低探针检测限。
吩嗪类化合物在生物细胞中能充当电子介质，在肿瘤细胞里发生一系列氧化还原反应时，这类化合物能特异性的将电子转移到靶肿瘤细胞，通过使肿瘤细胞中的超氧化合物的氧自由基增加来杀死肿瘤细胞，从而达到抗肿瘤作用。同时这类化合物还能通过遏制拓扑异构酶的合成，而这种酶能够介入dna的转录，这就中断了肿瘤细胞的细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡。本发明提供的荧光探针为亚甲基紫衍生物，亚甲基紫(3rax)是一类典型的吩嗪类衍生物，具有刚性平面的吩嗪结构，该探针同样可产生单线态氧，且基于结构特征单线态氧产生速度很快，同时因具有nbd可识别硫离子(肿瘤细胞中硫离子的浓度与正常细胞具有差异性)从而对肿瘤细胞具有靶向性治疗作用。
本发明的有益效果为：
1.本发明提供一种亚甲基紫衍生物的荧光探针，为含有nbd基团的亚甲基紫衍生物，水溶性好，nbd基团可作为硫离子识别基团，与硫离子作用形成nbd-sh用于硫离子检测，对硫离子响应速度快，灵敏性好，检出限低于1μm。
2.本发明提供的探针具有产生单线态氧的能力，且产生单线态氧的速度较快，具有较好的抗肿瘤能力，可用于制备光动力治疗探针，同时因具有nbd可识别硫离子(肿瘤细胞中硫离子的浓度与正常细胞具有差异性)从而对肿瘤细胞具有靶向性治疗作用。
3.本发明提供的探针合成方法简单，条件温和，成本低，所得探针不仅可识别硫离子且具有产生单线态氧的能力，在生物化学，环境科学等领域具有实际应用的价值。
附图说明
图1是实施例1制备的3rax-n-nbd-1对na2s水溶液随时间变化的吸收光谱响应。
图2是实施例1制备的3rax-n-nbd-1对不同浓度的na2s水溶液的荧光光谱响应。
图3是实施例1制备的3rax-n-nbd-1与不同浓度硫离子作用后的线性关系，横坐标为硫离子浓度，纵坐标为荧光强度。
图4是实施例1制备的3rax-n-nbd-1与dpbf作用后在418nm处的照射时间与紫外吸收比值(a/ao)的关系。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行进一步的说明。
实施例1
提供一种亚甲基紫衍生物荧光探针的制备方法，反应式如下：
包括以下步骤：
(1)将4-氟硝基苯(4g，28mmol)、碳酸钾(7.84g，54mmol)和哌嗪3.6g，42mmol)全部溶于dmso(30ml)，70℃下搅拌5h后，加入适量的冰水，有大量的黄色固体析出，抽滤，得到黄色固体d。
(2)将上述化合物d(5g，16mmol)、铁粉(1.8g，32mmol)和氯化铵(2.6g，48mmol)溶于乙醇(100ml)中，90℃回流，tlc监测直至原料点消失，待溶液冷却后，加入饱和碳酸氢钠溶液，充分搅拌后过滤。用乙酸乙酯萃取，减压蒸干，柱层析分离得褐色油状液体e。
(3)将上述化合物e(1g，3.6mmol)和苯胺(0.7g，7.2mmol)分别加入乙酸/乙酸钠缓冲溶液(200ml)中，再将重铬酸钾(4g，14.4mmol)混合溶液中，在105℃下搅拌5h后，在避光条件下，冷却至室温后，过滤，得到红色固体f。
(4)将上述化合物f(1g，2.5mmol)、4-氯-7-硝基苯并呋咱(nbd-cl)(0.77g，3.75mmol)和三乙胺(提供碱性条件)全部溶于二氯甲烷(20ml)中，40℃搅拌15h后，减压蒸干，柱层析分离，得到红色固体，即为亚甲基紫衍生物荧光探针，记为3rax-n-nbd-1探针。
测试本实施例中制备得到的3rax-n-nbd-1荧光探针对na2s水溶液的紫外吸收、荧光光谱响应以及荧光强度与不同浓度的na2s的线性关系，测试结果如图1～3所示。
配制浓度为10μm的3rax-n-nbd-1溶液(二甲亚砜/pbs缓冲溶液，体积比1:4,ph＝7.4)，与10个当量的na2s作用后，测试紫外吸收随时间的变化，结果如图1所示，图中曲线按右边箭头方向时间逐渐增加。图中显示：在680nm有紫外最大吸收，与na2s作后，随时间的变化在680nm处紫外最大吸收减弱，在510nm处紫外吸收增强，说明该探针对na2s具有检测作用且检测速度较快。
配制浓度为10μm的3rax-n-nbd-1溶液(二甲亚砜/pbs缓冲溶液，体积比1:4,ph＝7.4)加入不同摩尔当量的na2s(0μm、10μm、15μm、20μm、30μm、40μm、60μm、80μm、100μm)进行荧光分光光度法测试,并绘制3rax-n-nbd-3对不同浓度的na2s水溶液响应的荧光光谱以及荧光强度与不同na2s的线性关系，结果如图2和图3所示，图中显示该探针与不同浓度的na2s作用后荧光性质发生变化，在580nm处观察到荧光明显的增强。不同浓度的na2s与探针作用后得到的线性曲线(r＝0.9903),通过3σ/k的方法计算该荧光探针的检出限为0.36μm，说明该荧光探针对硫离子表现出高灵敏度。说明该荧光探针对硫离子表现出高灵敏度，该探针在生理体系环境中对硫离子具有识别作用，对于实现细胞内的荧光分析具有一定的实用价值。
dpbf是一种捕获单线态氧的化合物，在捕获单线态氧同时使它的自生光化学活性降低，其紫外吸收值也会降低，可间接地测定了3rax-n-nbd-1产生单线态氧产生的能力大小。
配制浓度为50μm的1,3二苯基异苯并呋喃(dpbf)溶液作为空白对照，配置浓度为50μm和1μm的3rax-n-nbd-3的混合溶液，用氙灯照射，测量混合后及空白dpbf分别在光照0、10、20、30、40、50s后，在418nm处的紫外吸光度值，结果如图4所示，图中横坐标为照射时间，纵坐标为紫外吸收比值，结果显示随时间变化紫外吸收比值在不断降低。说明在3rax-n-nbd-1存在下，单线态氧的产生十分迅速，随着照射时间的不断延长，dbpf在418nm处的紫外吸收值逐渐降低。从而实现光动力治疗，在生物医药方面具有一定的应用价值。
实施例2
提供一种亚甲基紫衍生物荧光探针的制备方法，反应式如下：
包括以下步骤：
(1)亚甲基紫3rax(1g，2.6mmol)、氯乙酰氯(0.33，2.9mmol)和三乙胺(提供碱性条件)全部溶解到二氯甲烷(25ml)中，室温搅拌搅拌8h，减压蒸干，柱层析分离，得到紫红色固体a1。
(2)将上述化合物a1(1g，2mmol)、哌嗪(0.38g，4mmol)和碳酸钾(提供弱碱条件)(1.2g，9mmol)全部溶于乙腈(30ml)中，室温搅拌2h后，减压蒸干，乙酸乙酯萃取，柱层析分离，得到红色固体b1。
(3)将上述化合物b1(1g，2mmol)、nbd-cl(0.6g，3mmol)和三乙胺(提供碱性条件)全部溶于二氯甲烷(20ml)中，40℃搅拌15h后，减压蒸干，柱层析分离，得到紫红色固体，即为亚甲基紫衍生物的荧光探针，记为3rax-n-nbd-2探针。
不同浓度的na2s与探针作用后得到的线性曲线(r＝0.9899),通过3σ/k的方法计算该荧光探针的检出限为0.87μm且可以产生单线态氧。
实施例3
提供一种亚甲基紫衍生物荧光探针的制备方法，反应式如下：
(1)室温下将亚甲基紫3rax(1g，2.6mmol)加入到浓盐酸中搅拌3h后，将1-苯基哌嗪(0.64g，4mmol)加入到亚甲基紫的浓盐酸溶液中，继续搅拌4h后，抽滤，得到蓝色固体c。
(2)将上述化合物c(1g，2mmol)、nbd-cl(0.54g，3mmol)和三乙胺(提供碱性条件)全部溶于二氯甲烷(20ml)，40℃下搅拌15h后，减压蒸干，柱层析分离，得到蓝绿色固体，即为亚甲基紫衍生物荧光探针，记为3rax-n-nbd-3探针。
不同浓度的na2s与该探针作用后得到的线性曲线(r＝0.9908),通过3σ/k方法计算该荧光探针的检出限为0.74μm且可以产生单线态氧。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种亚甲基紫衍生物荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的分子结构通式如(1)所示：
其中：
r1＝r3r4或r4；
r2＝-nh2或-n(ch2ch3)2；
r3＝-nhcoch2-,-hn(ch2-o)n1-,-hn(ch2-nh)n2-,-hn(ch2)n3-或
2.根据权利要求1所述的亚甲基紫衍生物荧光探针，其特征在于，所述r3中，n1取1-12的自然数，n2取1-12的自然数，n3取1-12的自然数。
3.一种权利要求1-2任一项所述的亚甲基紫衍生物荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下三个路线：
路线一：当r1＝-r3r4,r2＝-n(ch2ch3)2,r3＝-hncoch2-,-hn(ch2-o)n1-,-hn(ch2-nh)n2-或-hn(ch2)n3-时，包括以下步骤：
碱性条件下，亚甲基紫3rax与x-r5-x反应，得产物a，然后与哌嗪反应得产物b，继续与nbd-cl反应，在哌嗪基团上引入nbd基团，即得亚甲基紫衍生物荧光探针；其中x-r5-x中，x为cl或br，r5＝-coch2-、-(ch2-o)n1-、-(ch2-nh)n2-或-(ch2)n3-、,反应式为：
路线二：当r1＝-r3r4,r2＝-n(ch2ch3)2,
将1-苯基哌嗪加入到亚甲基紫3rax的浓盐酸溶液中，反应得产物c，然后与nbd-cl反应，在哌嗪基团上引入nbd基团，即得亚甲基紫衍生物荧光探针；反应式为：
路线三：当r1＝r4,r2＝-nh2时，包括以下步骤：
以4-氟硝基苯为原料，与哌嗪反应生成产物d，产物d中硝基还原得产物e，然后与苯胺反应得产物f，产物f与nbd-cl反应，在产物f的哌嗪基团上引入nbd基团，即得亚甲基紫衍生物的荧光探针，反应式为：
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述路线一中，具体步骤如下：
1)亚甲基紫3rax、x-r5-x和三乙胺溶于一定量的二氯甲烷中，室温搅拌5-8h，减压蒸干，柱层析分离，得到固体a，其中亚甲基紫3rax与x-r5-x的化合物的摩尔比为1：(1-1.2)；
2)固体a、哌嗪和碳酸钾溶于定量的乙腈中，室温搅拌2-3h，减压蒸干，柱层析分离，得到固体b，其中固体a与哌嗪的摩尔比为1：(1-1.5)；
3)将固体b、nbd-cl和三乙胺溶于一定量的二氯甲烷中，室温搅拌10-15h，减压蒸干，柱层析分离，得到亚甲基紫衍生物荧光探针，其中固体b与nbd-cl的摩尔比为1：(1-1.5)。
5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述路线二中，具体步骤如下：
1)室温下将一定量的亚甲基紫3rax加入到浓盐酸中搅拌3-4h后，将1-苯基哌嗪加入到亚甲基紫的浓盐酸溶液中，继续搅拌3-4h后，抽滤，得到蓝色固体c，其中亚甲基紫3rax和1-苯基哌嗪摩尔比为1：(1-1.5)；
2)将固体c、nbd-cl和三乙胺溶于定量的二氯甲烷中，室温搅拌10-15h，减压蒸干，柱层析分离，得到目标探针，其中固体c与nbd-cl的摩尔比为1：(1-1.5)。
6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述路线三中，具体步骤如下：
1)将4-氟硝基苯、碳酸钾和哌嗪溶于dmso中，70-100℃下搅拌5-8h后，将反应液倒入适量冰水中，大量的黄色固体析出，抽滤，得到黄色固体d，其中4-氟硝基苯：哌嗪：碳酸钾＝1：(1.1-1.5)：(2-3)；
2)将步骤1)所得化合物d、铁粉和氯化铵加入适量的乙醇中回流，tlc监测直至原料点消失；待反应液冷却后，加入饱和碳酸氢钠溶液，充分搅拌后过滤，用乙酸乙酯萃取，减压蒸干，柱层析分离得褐色油状液体e，其中化合物d、铁粉和氯化铵摩尔比为1：(2-2.5)：(3-3.5)；
3)将步骤2)所得化合物e和苯胺分别加入乙酸/乙酸钠缓冲溶液中，再加入一定量的重铬酸钾到混合溶液中，在105-130℃下搅拌3-5h后，在避光条件下，冷却至室温后，过滤，得到红色固体f，其中化合物e、苯胺和重铬酸钾的摩尔比为1：(2-2.5)：(4-5)；
4)将固体f、nbd-cl和三乙胺溶于定量的二氯甲烷中，室温搅拌10-15h，减压蒸干，柱层析分离，得到目标探针，其中固体f与nbd-cl的摩尔比为1：(1-1.5)。
7.一种权利要求1或2任一项所述的亚甲基紫衍生物的荧光探针在硫离子检测方面的应用。
8.一种权利要求1或2任一项所述的亚甲基紫衍生物的荧光探针在制备光动力治疗探针方面的应用。
技术总结