本发明属于真菌提取化合物技术领域。更具体地，涉及一种含吡啶的新骨架杂萜类化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
阿尔茨海默病(alzheimerdisease，ad)是一类以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性疾病，主要发生于老年人，俗称老年痴呆症。随着社会老龄化的加速，ad已经成为人类健康的重要威胁，属于临床医学难题和重大疾病范畴。研究发现，乙酰胆碱酯酶抑制剂(achei)是抗ad的主要治疗药物，主要是通过抑制过量的乙酰胆碱酯酶(ache)活性直接作用于胆碱能系统，来达到治疗ad等神经退行性病变的目的。
目前市面上约有五种治疗阿兹海默症的药物获得了美国食品药物管制局(fda)的认可，其中的他克林(tacrine)、多奈哌齐(donepezil)均为胆碱酯酶抑制剂，通过阻断胆碱酯酶的作用抑制乙酰胆碱分解，从而达到增加脑中乙酰胆碱含量的效果，可以延缓记忆的丧失，并且有助于患者执行日常起居所需的动作。但这些药物均会对患者造成如恶心、头痛、腹泻、失眠、疼痛、幻觉或晕眩等的副作用，并且存在耐药性、治疗效果不理想等问题。中国专利申请cn111097010a公开了一种用于抑制乙酰胆碱酯酶的提取物，该提取物由细本葡萄茎部用乙醇提取得到，经过动物实验证明该提取物可以改善莨菪碱诱导的阿兹海默氏小鼠模型的学习和记忆行为，但植物提取物的药物稳定性及质量均一性较难保证，在实际应用中还存在很大的限制。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有治疗乙酰胆碱酯酶介导的疾病如阿兹海默症可供选择的药物种类较少的缺陷和不足，提供一种含吡啶的新骨架杂萜类化合物在制备预防和/或治疗由乙酰胆碱酯酶介导的疾病的药物中的应用。发明人研究发现，海鞘来源真菌发酵得到的含吡啶的新骨架杂萜类化合物具有显著的抑制乙酰胆碱酯酶活性，可以用于乙酰胆碱酯酶介导的疾病治疗中。
因此，本发明的目的是提供一种含吡啶的新骨架杂萜类化合物。
本发明另一目的是提供所述含吡啶的新骨架杂萜类化合物的制备方法。
本发明另一目的是提供所述含吡啶的新骨架杂萜类化合物在制备预防和/或治疗由乙酰胆碱酯酶介导的疾病的药物中的应用。
本发明另一目的是提供所述含吡啶的新骨架杂萜类化合物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
发明人经过大量的探索研究发现，海洋微生物由于其特殊的环境，常常能产生结构新颖、生物活性多样的天然产物。本发明研究证明，海鞘来源真菌猫棒束孢白僵菌(beauveriafelina)真菌菌株sysu-ms7908可以代谢合成含吡啶的新骨架杂萜类化合物amphichoterpenoid，并且经过实验验证，含吡啶的新骨架杂萜类化合物amphichoterpenoid具有显著的抗乙酰胆碱酯酶活性，在制备预防和/或治疗由乙酰胆碱酯酶介导的疾病的药物中具有较好的开发前景，如由乙酰胆碱酯酶介导的神经退化性疾病阿尔茨海默病等。另一方面，微生物还可以利用现代微生物发酵工程技术进行再生产、无原材料后顾之忧，同时有不会破坏生态平衡、易实现产业化等优势，是具开发前景的可再生性药物资源，为研究与开发海洋微生物制品和海洋微生物药物提供了丰富的原料。
因此，本发明要求保护一种含吡啶的新骨架杂萜类化合物，具有以下结构式：
另外的，本发明还提供了所述含吡啶的新骨架杂萜类化合物的制备方法，所述含吡啶的新骨架杂萜类化合物由海鞘来源真菌发酵分离得到。
进一步地，所述海鞘来源真菌为猫棒束孢白僵菌(beauveriafelina)真菌菌株sysu-ms7908，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏日：2020年07月24日，保藏号：gdmccno：61059。
更进一步地，所述制备方法包括以下步骤：
s1、将海鞘来源真菌扩大培养，所得发酵菌体用甲醇浸泡，浓缩浸泡液得浸膏；
s2、将步骤s1所得浸膏用硅胶层析柱进行分离，分别用乙酸乙酯体积分数为10％、20％、30％、45％、60％、100％的乙酸乙酯-石油醚混合溶液进行洗脱，相应得到fr.a、fr.b、fr.c、fr.d、fr.e、fr.f6个组分；
s3、将步骤s2所得fr.b组分利用葡聚糖凝胶柱层析，结合体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液洗脱，依据分子量大小分离得到fr.b.1、fr.b.2、fr.b.3、fr.b.4、fr.b.5、fr.b.6、fr.b.7、fr.b.8的8个馏分；
s4、将步骤s3所得馏分fr.b.2用反相hplc和体积比为75:25的甲醇-水为流动相进行分离纯化，得到消旋体化合物1；将步骤s3所得馏分fr.b.3用反相hplc和体积比为70:30的甲醇-水为流动相进行分离纯化，得到化合物2和3。
进一步地，步骤s4中，所述消旋体化合物1用正相手性柱和体积比为95:5的正己烷-异丙醇为流动相洗脱，得到映异构体拆分后的化合物( )-1和化合物(-)-1。
另外的，本发明还提供了所述含吡啶的新骨架杂萜类化合物在制备预防和/或治疗由乙酰胆碱酯酶介导的疾病的药物中的应用。
进一步地，所述由乙酰胆碱酯酶介导的疾病为神经退化性疾病。
更进一步地，所述神经退化性疾病包括路易体痴呆症、血管性痴呆、睡眠呼吸中止症、轻度认知障碍、精神分裂症、cadasil综合征、注意力欠缺症、后冠状动脉旁路认知障碍、与多发性硬化相关的认知障碍、唐氏综合症、阿尔茨海默病。
优选地，所述由乙酰胆碱酯酶介导的疾病为阿尔茨海默病。
另外的，本发明还提供了所述含吡啶的新骨架杂萜类化合物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明一种含吡啶的新骨架杂萜类化合物amphichoterpenoid由海鞘来源真菌发酵制备得到，经过实验验证具有显著的抗乙酰胆碱酯酶活性，在制备预防和/或治疗由乙酰胆碱酯酶介导的疾病的药物中具有较好的开发前景；并且利用现代微生物发酵工程技术进行再生产、无原材料后顾之忧，同时有不会破坏生态平衡、易实现产业化等优势，是具开发前景的可再生性药物资源，为研究与开发海洋微生物制品和海洋微生物药物提供了丰富的原料。
附图说明
图1为海鞘来源真菌菌株beauveriafelinasysu-ms7908的菌株形态图和sem图。
图2为化合物1和化合物2的x-ray单晶衍射图。
图3为化合物(±)-1的手性拆分液相图。
图4为光学纯化合物( )-1和(-)-1的实验计算ecd谱图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1海鞘来源真菌菌株beauveriafelinasysu-ms7908的分离和鉴定
1、菌株分离
样品：中国南海西沙群岛北礁海域的皱瘤海鞘(styelaplicata)。
分离方法：对新鲜的海鞘表面进行消毒，稍晾干后研磨，无菌条件下接种到pda培养基中，28℃以下培养5～7d，得到单菌株sysu-ms7908；将得到的菌株sysu-ms7908采用普通ypd培养基斜面4℃保藏。
2、形态和生理生化鉴定
将所得单菌株sysu-ms7908接种在ypd培养基上，26℃恒温培养，菌株生物学特性表现为：初期菌落表面有白色菌丝体，生长一定时间后有白色细长的分生孢子梗形成的直立束丝体(synnemata)，在sem下可观察到在束丝体顶端产生瓶状的分生孢子细胞，孢子的直径约为3.2～3.5×2.2～2.5μm，详见图1。
3、分子生物学鉴定
采用ctab法提取所得海鞘来源真菌菌株sysu-ms7908的纯培养的dna，采用its间隔区的一对引物its1f和its2通过pcr扩增仪扩增its1-5.8srrna-its2基因片段，反应体系为50ul，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性40s，52℃退火40s，72℃延伸1min，重复变性、退火和延伸三个步骤30个循环，最后72℃延伸补齐10min。
通过葡聚糖凝胶电泳检测确定目标片段在600bp左右，通过测序得出该菌株的its-rrna基因片段序列：acctgatccgaggtcaaccttgagaaagtagggggttttacggcgtggccgctccgctatccggctgcgaggtatcactactacgcaggggaggtcgcgaagagaccgccactgtatttcagggccggcagccgccaggggcagccgatccccaacaccaggtcccgcggacgggccctgagggttgaaatgacgctcggacaggcatgcccgccagagtactggcgggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgctgaaagttttaatttattttgtatgagactcagaagatcctctataaaaaaaacagggtttggggtcctcggcgggcgtctggctccggggcgcgcagcggactgcgttccccgggacggacccgccgaagcaacgataggtatgttcacaaaggtatggagttggaaactcggtaatgatccct；其序列保存在genbank中，保存号：mt786206。
在genbank上通过blast在线比对搜索引擎对序列进行相似性分析，得到最大相似度为99.6％的菌株，并结合上述形态学鉴定，确定该菌株为猫棒束孢白僵菌beauveriafelina的真菌。
将所得海鞘来源真菌菌株beauveriafelinasysu-ms7908保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日：2020年07月24日，保藏号：gdmccno：61059。
实施例2海鞘来源真菌菌株beauveriafelinasysu-ms7908的发酵及含吡啶的新骨架杂萜类化合物的提取、分离和纯化
1、含吡啶的新骨架杂萜类(amphichoterpenoid)化合物1～3的制备与分离
1.1以海鞘来源真菌菌株beauveriafelinasysu-ms7908进行发酵，将发酵产物进行提取、分离、纯化，得到化合物1-3。
(1)种子培养：
种子培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，自来水1l，平均分装于5个500ml锥形瓶，115℃灭30分钟。
种子的培养：将海鞘来源真菌菌株beauveriafelinasysu-ms7908接入种子培养基，在28℃的温度下，置摇床上以150rpm的转速，培养96小时得种子培养液。
(2)发酵培养：
配制发酵培养基：每650ml大口组织培养瓶中加入大米50ml，海盐1.5g，水50ml；共120瓶。
发酵培养：无菌操作将步骤(1)所得种子液5ml接入装有发酵培养基的培养瓶中，于25℃静置培养25天。
(3)提取分离：
取步骤(2)所得发酵菌体用甲醇浸泡，浸泡液在低于50℃下减压浓缩得浸膏95g，该浸膏经硅胶柱层析进行分离，分别用乙酸乙酯体积为10％、20％、30％、45％、60％、100％的乙酸乙酯-石油醚梯度淋洗，分为6组(fr.a～fr.f)；
fr.b组分(乙酸乙酯的体积为20％)，采用葡聚糖凝胶sephadexlh-20层析(二氯甲烷/甲醇1:1为洗脱液)，依据物质的分子量大小进行分离，得到8个馏份fr.b.1～fr.b.8；
fr.b.2经反相hplc(流动相为75:25甲醇/水)分离纯化后，即可得到消旋体化合物1；
fr.b.3经反相hplc(流动相为70:30甲醇/水)和正相手性柱(流动相为97:3正己烷/异丙醇)分离纯化得到化合物2和3。
上述过程，分离得到3个化合物，即化合物1至化合物3，其结构如下所示：
(4)结构分析
对步骤(3)所得化合物1～3进行结构分析，得到的理化性质数据如下：
化合物1(amphichoterpenoida)：白色粉末；uv(meoh)λmax(logε)250(2.25)；289(3.72)；349(2.79)nm；ir(neat)vmax2958,2925,2848,1658,1604,1581,1460,1361,1267,1196,1155,1061cm-1；1hnmr(cdcl3,400mhz)和13cnmr(cdcl3,100mhz)数据见表1；hr-esimsm/z272.1283[m h] (calcdforc16h17no3,272.1287)；{( )-1,
化合物2(amphichoterpenoidb)：白色粉末；
化合物3(amphichoterpenoidc)：白色粉末；
表1化合物1～3的nmr数据(100mhz/400mhz，cdcl3，tms，ppm)
表2化合物1～2的单晶数据
化合物1～2的单晶衍射结构参见图2；可见，化合物1(±)-amphichoterpenoida独特地以吡啶甲酸为非杂萜部分和2个异戊烯基单元后修饰环化而成，构成新颖的杂萜骨架；由其p21/c空间群可以看出，化合物1(±)-amphichoterpenoida的晶体中由对映体构成的。
2、化合物1(±)-amphichoterpenoida对映异构体的拆分
采用高效液相色谱分离技术，选择正相手性柱(ultimatecellu-dcolumn4.6×250mm,5μm)，用95％的正己烷/异丙醇为流动相，流速2.5ml/min，进行等度洗脱，得图3；
由图3可见，保留时间4.73min和5.76min处出现一对等面积的对称峰，测定浓缩后的两组光学纯物质的旋光和ecd后，用量子化学方法计算理论ecd，结果如图4所示，可以确定4.73min和5.76min处分别获得光学纯的化合物( )-1和化合物(-)-1，其结构如下所示：
实施例3化合物抗乙酰胆碱酯酶活性测定
1、实验材料：
实验对象：实施例2制备得到的5个化合物；
实验材料：底物为碘化乙酰硫代胆碱(上海阿拉丁)；显色剂为dtnb，5,5,-二硫双(2-硝基苯甲酸)(上海阿拉丁)；乙酰胆碱酯酶(来源于电鳗，500u购自sigma)，rivastigmine(上海笛柏)；
ph7.6的0.1m磷酸盐缓冲溶液pbs：分别配制0.1m的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾溶液，然后烧杯装一定量的磷酸氢二钾溶液往其中加磷酸二氢钾溶液，不断搅拌，调节ph至7.6；
底物(碘代硫代乙酰胆碱，atoh)浓度：1.3mg/ml，显色剂dtnp：1.8mg/ml；酶浓度：0.9u/ml。
2、实验方法：
乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定(改良的ellman方法)：取不同浓度的样品10μl，酶溶液10μl，160μlpbs缓冲溶液加入到96孔板中，于37℃预孵化3min；然后加入10μl底物atoh和10μl显色剂dntb，于37℃孵化反应12min；测定其在410nm的吸光度，为a1；其中以不加样品(用pbs代替)为空白对照，吸光度为a0，以rivastigmine为阳性对照；每次试验做三次平行。用以下公式计算其抑制率，用graphpadprism7.0软件计算其ic50值；
抑制率％＝[1-样品组od值/空白组od值]×100％。
原理为底物在乙酰胆碱酯酶催化下水解为胆碱，胆碱与显色剂反应生成黄色的5-硫代-2-硝基苯甲酸盐，在410nm有最大吸收。
3、实验结果：参见表3。
表3化合物1～3的乙酰胆碱酯酶抑制活性
由表3可见，化合物1～3均具有较好的抑制乙酰胆碱酯酶的效果；尤其是( )-1，其ic50低于20μm，具有强的抗乙酰胆碱酯酶活性。因此化合物1～3都具有良好的作为抗ad药物潜力，尤其是化合物( )-1。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1.一种含吡啶的新骨架杂萜类化合物，其特征在于，具有以下结构式：
2.权利要求1所述含吡啶的新骨架杂萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述含吡啶的新骨架杂萜类化合物由海鞘来源真菌发酵分离得到。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述海鞘来源真菌为猫棒束孢白僵菌(beauveriafelina)真菌菌株sysu-ms7908，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏日：2020年07月24日，保藏号：gdmccno：61059。
4.根据权利要求2或3所述制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
s1、将海鞘来源真菌扩大培养，所得发酵菌体用甲醇浸泡，浓缩浸泡液得浸膏；
s2、将步骤s1所得浸膏用硅胶层析柱进行分离，分别用乙酸乙酯体积分数为10％、20％、30％、45％、60％、100％的乙酸乙酯-石油醚混合溶液进行洗脱，相应得到fr.a、fr.b、fr.c、fr.d、fr.e、fr.f6个组分；
s3、将步骤s2所得fr.b组分利用葡聚糖凝胶柱层析，结合体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液洗脱，依据分子量大小分离得到fr.b.1、fr.b.2、fr.b.3、fr.b.4、fr.b.5、fr.b.6、fr.b.7、fr.b.8的8个馏分；
s4、将步骤s3所得馏分fr.b.2用反相hplc和体积比为75:25的甲醇-水为流动相进行分离纯化，得到消旋体化合物1；将步骤s3所得馏分fr.b.3用反相hplc和体积比为70:30的甲醇-水为流动相进行分离纯化，得到化合物2和3。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤s4中，所述消旋体化合物1用正相手性柱和体积比为95:5的正己烷-异丙醇为流动相洗脱，得到映异构体拆分后的化合物( )-1和化合物(-)-1。
6.权利要求1所述含吡啶的新骨架杂萜类化合物在制备预防和/或治疗由乙酰胆碱酯酶介导的疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述由乙酰胆碱酯酶介导的疾病为神经退化性疾病。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述神经退化性疾病包括路易体痴呆症、血管性痴呆、睡眠呼吸中止症、轻度认知障碍、精神分裂症、cadasil综合征、注意力欠缺症、后冠状动脉旁路认知障碍、与多发性硬化相关的认知障碍、唐氏综合症、阿尔茨海默病。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述由乙酰胆碱酯酶介导的疾病为阿尔茨海默病。
10.权利要求1所述含吡啶的新骨架杂萜类化合物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。
技术总结