本发明属于分析化学领域，涉及一种新型荧光探针及其制备方法再检测蜂蜜中磺胺二甲嘧啶的应用。
背景技术：
磺胺二甲嘧啶(smz)是一种广泛应用于临床兽医领域的治疗细菌和原虫感染的化疗药物。然而，一些监测项目显示，动物食品中残留微量的smz，这意味着此类动物食品对人类健康构成威胁。因此，欧盟(eu)制定了动物源性食品中smz的最大残留量(mrl)为100μg/kg；食品法典委员会(cac)宣布牛奶中smz的最大残留量(mrl)不超过25μg/kg，在其他可实用组织中不超过100μg/kg。近年来，随着畜牧养殖业生产的发展，磺胺类药物在生产中被大量使用。养殖者为了追求利益，放低了道德底线，这导致兽药的不合理应用、滥用、乱用、非法添加等现象比比皆是。因此，开发一种准确、灵敏地测定食品和环境样品中磺胺类化合物的方法是一项重要的研究课题。
目前，磺胺类化合物的定量分析方法有很多，包括生物传感器法，高效液相色谱法(hplc)与荧光光谱检测技术联用法，紫外分光光度法，串联质谱法，电化学分析法。针对磺胺二甲嘧啶(smz)残留的分析方法有微生物分析法和抗体免疫分析法，包括酶联免疫印迹分析法(elisa)，免疫层析分析法，胶体金免疫试纸条法和传感器法等。其中，大多数方法操作复杂，仪器设备昂贵，重现性差，灵敏度低，选择性差等。所以急需建立一种选择性好，灵敏度高，成本低，方便快捷的检测方法用于食品中磺胺二甲嘧啶的检测。
技术实现要素：
本发明的目的之一是设计合成一种可用于有效检测蜂蜜中磺胺二甲嘧啶的新型荧光探针euiii-dtpa-bis(adenine)。
本发明的目的之二是提供一种操作简单，成本低，敏感快速，且选择性好的检测磺胺二甲嘧啶的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种新型荧光探针，所述的荧光探针是稀土氨基多羧酸配合物荧光探针euш-dtpa-bis(adenine)。
上述的新型荧光探针的制备方法，方法如下：
1)将二乙三胺五乙酸、乙酸酐和吡啶混合均匀，在65℃下搅拌回流24h，冷却至室温，减压抽滤，依次用乙酸酐和无水乙醚洗涤，在50℃真空干燥，得二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)；
2)将二乙三胺五乙酸二酐、腺嘌呤和三乙胺加入到dmf中，混合均匀，在100℃下搅拌回流24h，冷却至室温，依次用丙酮和无水乙醚洗涤，减压抽滤，于50℃真空干燥，得到配体(dtpa-bis(adenine))；
3)将dtpa-bis(adenine)和eu(no3)3·6h2o分别加去离子水溶解，混合，于60℃搅拌加热2h，冷却，得到euш-dtpa-bis(adenine)。
优选地，上述的新型荧光探针的制备方法，步骤1)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸(dtpa)：乙酸酐：吡啶＝1:2-6:4-10。
优选地，上述的新型荧光探针的制备方法，步骤1)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸(dtpa)：乙酸酐：吡啶＝1:4:6。
优选地，上述的新型荧光探针的制备方法，步骤2)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)：三乙胺：腺嘌呤＝1:2-6:1-5。
优选地，上述的新型荧光探针的制备方法，步骤2)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)：三乙胺：腺嘌呤＝1:3:2。
优选地，上述的新型荧光探针的制备方法，步骤3)中，按摩尔比，dtpa-bis(adenine)：eu(no3)3·6h2o＝1:1-5。
上述的新型荧光探针的制备方法，步骤3)中，按摩尔比，dtpa-bis(adenine)：eu(no3)3·6h2o＝1:1。
上述的新型荧光探针在检测蜂蜜中磺胺二甲嘧啶的应用。
优选地，上述的应用，方法如下：取蜂蜜，加入上述的新型荧光探针，混合均匀，以euш-dtpa-bis(adenine)溶液为实验参比，于280nm下进行荧光检测。
本发明的有益效果是：
1.本发明探针对被检测物磺胺二甲嘧啶的结构特点，对dtpa进行修饰，设计合成了一种新型的荧光探针。
2.通过本发明的方法，该探针可以对磺胺二甲嘧啶进行灵敏地特异性检测。与其它检测磺胺二甲嘧啶的方法相比，具有简单，快速，成本低，选择性好，灵敏度高等优点。
附图说明
图1是荧光探针euш-dtpa-bis(adenine)的合成路线图。
图2a是dtpa的傅里叶变换红外光谱(ft-ir)图。
图2b是腺嘌呤(adenine)的傅里叶变换红外光谱(ft-ir)图。
图2c是dtpa-bis(adenine)的傅里叶变换红外光谱(ft-ir)图。
图3是dtpa-bis(adenine)，euш-dtpa-bis(adenine)和euш-dtpa-bis(adenine)-smz的紫外吸收光谱图。
图4a是荧光探针对磺胺二甲嘧啶(smz)检测的荧光光谱图。
图4b是荧光探针对磺胺二甲嘧啶(smz)检测的荧光光谱对比柱状图。
图5a是荧光探针对磺胺二甲嘧啶(smz)及共存物检测的干扰荧光光谱柱状图。
图5b是荧光探针对磺胺二甲嘧啶(smz)及共存物检测的干扰荧光光谱对比柱状图。
图6a是荧光探针对不同浓度磺胺二甲嘧啶(smz)检测的荧光光谱图。
图6b是磺胺二甲嘧啶(smz)浓度与荧光强度的线性关系图。
图7是荧光探针对豆腐皮中磺胺二甲嘧啶(smz)检测的荧光光谱柱状图。
具体实施方式
实施例1新型荧光探针euш-dtpa-bis(adenine)
(一)制备方法
1、二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)的合成
称取7.8670g(0.02mol)二乙三胺五乙酸(dtpa)，乙酸酐16.0ml(0.08mol)，吡啶10.0ml(0.12mol)置于三颈圆底烧瓶中，在65℃下缓慢搅拌加热，冷凝回流24h。停止加热和搅拌，冷却至室温后将产物减压抽滤，依次用乙酸酐和无水乙醚分别洗涤三次(3×10ml)，并减压抽滤，将产物于干燥箱中60℃干燥，即得二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)。
2、dtpa-bis(adenine)的合成
取二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)1.9635g(5.5mmol)，2.334ml的三乙胺(16.5mmol)，无水dmf(30ml)，腺嘌呤1.4864g(11mmol)，于三颈圆底烧瓶中。恒温100℃条件下，快速搅拌，冷凝回流24h。反应完全后静置，冷却到室温后，旋转蒸发除去溶剂，得乳白色固体物质，减压抽滤，依次用丙酮和无水乙醚分别洗涤三次。于50℃条件下真空干燥，即得dtpa-bis(adenine)。
3、荧光探针euш-dtpa-bis(adenine)的合成
将0.1568gdtpa-bis(adenine)(0.25mmol)和0.1115geu(no3)3·6h2o(0.25mmol)分别加入到圆底烧瓶中，加入100ml的tris-hcl([tris-hcl]＝0.05mol/l，ph＝7.40)缓冲溶液，于100℃搅拌加热回流1.0h，溶液冷却至室温，转移至500ml容量瓶中，用去离子水洗涤圆底烧瓶三次，将上述洗涤液全部转移至容量瓶中，用tris-hcl([tris-hcl]＝0.05mol/l，ph＝7.40)缓冲溶液定容，得到浓度为5.00×10-4mol/l的euш-dtpa-bis(adenine)溶液。合成过程如图1所示。
(二)检测
(1).dtpa、腺嘌呤、dtpa-bis(adenine)的ft-ir图，如图2a，2b，2c所示，与dtpa和腺嘌呤相比，配体dtpa-bis(adenine)的特征吸收峰都发生了明显的变化，其中配体dtpa-bis(adenine)的伸缩振动v(n-h)出现在2923cm-1和3392cm-1，配体中酰胺的vs(c＝o)特征峰出现在1631cm-1处，这些特征峰的变化都说明了配体dtpa-bis(adenine)由dtpa和adenine通过酰胺化反应成功地合成。
(2).dtpa-bis(adenine)，euш-dtpa-bis(adenine)和euш-dtpa-bis(adenine)-磺胺二甲嘧啶(euш-dtpa-bis(adenine)-smz)的紫外吸收光谱图如图3所示。从图3可以看出，配体dtpa-bis(adenine)和配合物euш-dtpa-bis(adenine)没有明显的吸收峰。然而，当磺胺二甲嘧啶(smz)加入到配合物euш-dtpa-bis(adenine)溶液中时，检测体系euш-dtpa-bis(adenine)-smz在262nm处的紫外吸收峰明显增强，可以预测当smz加入到配合物euш-dtpa-bis(adenine)溶液中后，荧光强度会明显减弱，这也为荧光方法检测smz做了铺垫。
实施例2荧光探针euш-dtpa-bis(adenine)在检测磺胺二甲嘧啶中的应用
(一)荧光探针对磺胺二甲嘧啶检测的荧光光谱
实验条件：取一定量的磺胺二甲嘧啶用tris-hcl([tris-hcl]＝0.05mol/l，ph＝7.40)缓冲溶液配置成浓度为5.0×10-4mol/l的溶液，作为磺胺二甲嘧啶储备液。
取2支样品管，将1ml浓度为5.0×10-4mol/l的磺胺二甲嘧啶和1ml浓度为5.0×10-4mol/l的探针euш-dtpa-bis(adenine)溶液加入到第一支样品管中，再取1ml浓度为5.0×10-4mol/l的磺胺二甲嘧啶溶液加入另一支样品管中，用tris-hcl缓冲溶液定容至5ml。最终检测浓度为1.0×10-4mol/l，以euш-dtpa-bis(adenine)溶液为参比，在280nm波长光的激发下，观察探针euш-dtpa-bis(adenine)的荧光光谱的变化。
结果如图4a，4b所示。在280nm波长光的激发下，荧光探针euш-dtpa-bis(adenine)在319nm处发射出强荧光，而磺胺二甲嘧啶在319nm处几乎不发出荧光。当把磺胺二甲嘧啶加入到探针溶液中后，探针的荧光被明显猝灭。
(二)共存物质存在对荧光探针euш-dtpa-bis(adenine)检测磺胺二甲嘧啶的影响
实验条件：取5支样品管，分别加入1ml浓度为5.0×10-4mol/l的葡萄糖(g)、l-苯丙氨酸(pha)、组氨酸(his)、抗坏血酸(aa)和甘氨酸(gly)溶液，再分别加1ml浓度为5.0×10-4mol/l的荧光探针euш-dtpa-bis(adenine)和磺胺二甲嘧啶溶液，定容至5ml。最终检测浓度为1.0×10-4mol/l，以euш-dtpa-bis(adenine)溶液为参比，在280nm波长光的激发下，观察探针euш-dtpa-bis(adenine)检测磺胺二甲嘧啶的荧光光谱变化。
结果如图5a、图5b所示。从图5a中可以看出，探针溶液在319nm处发出强荧光，当磺胺二甲嘧啶加入到探针溶液中后，探针的荧光被猝灭。当葡萄糖(g)、l-苯丙氨酸(pha)、组氨酸(his)、抗坏血酸(aa)和甘氨酸(gly)等共存物质分别加入到探针和磺胺二甲嘧啶的混合溶液中后，混合溶液的荧光几乎没有影响。这说明，蜂蜜中其他与磺胺二甲嘧啶共存的物质不会干扰探针对磺胺二甲嘧啶的检测。图5b为共存物对euш-dtpa-bis(adenine)-smz溶液荧光强度影响的柱状图。
(三)不同浓度磺胺二甲嘧啶对euш-dtpa-bis(adenine)荧光强度的影响
实验条件：取10支样品管，分别加入1ml浓度为5.0×10-4mol/l的荧光探针euш-dtpa-bis(adenine)，再加入不同量的磺胺二甲嘧啶溶液，定容至5ml。以euш-dtpa-bis(adenine)溶液为参比，在280nm波长光的激发下，测得探针euш-dtpa-bis(adenine)检测不同浓度磺胺二甲嘧啶的荧光光谱变化。
结果如图6a所示，在280nm波长光的激发下，荧光探针euш-dtpa-bis(adenine)在319nm处发射出强荧光，当有磺胺二甲嘧啶加入时，随着磺胺二甲嘧啶浓度不断增加，探针的荧光强度逐渐减弱。如图6b所示，在浓度范围5-100μmol/l，配合物euш-dtpa-bis(adenine)荧光强度与磺胺二甲嘧啶(smz)的浓度呈现良好的线性关系，线性方程为y＝0.2938x 0.8562(r2＝0.9923)，y代表在319nm处配合物euш-dtpa-bis(adenine)的荧光强度，x代表磺胺二甲嘧啶(smz)的浓度，可以用来测定磺胺二甲嘧啶的浓度。
(四)荧光探针euш-dtpa-bis(adenine)检测蜂蜜中的磺胺二甲嘧啶
本实验采用标准加入法制备含有磺胺二甲嘧啶的实际样品。
实验条件：取一定量的蜂蜜，加入一定量浓度为(0.5、2.5、5.0)×10-4mol/l的磺胺二甲嘧啶溶液，滴入少量浓盐酸，取一定量上清液加入离心管中，离心5min(4000rpm)，取1ml的上清液，再分别加入1ml浓度为5.00×10-4mol/l的euш-dtpa-bis(adenine)，用tris-hcl([tris-hcl]＝50mmol/l，ph＝7.40)缓冲溶液定容于5ml容量管中，得到加标不同量磺胺二甲嘧啶的3个实际样品待测样。再取等量蜂蜜，用同样的方法制得不含磺胺二甲嘧啶的样品作为参比，在280nm波长光的激发下，观察荧光光谱的变化。
结果如图7所示。在280nm波长光的激发下，以euш-dtpa-bis(adenine)溶液做参比，加入含有磺胺二甲嘧啶的样品后，荧光强度明显降低。磺胺二甲嘧啶本身没有荧光，加入磺胺二甲嘧啶的蜂蜜样品上清液在319nm处也没有明显的荧光。然而，当探针溶液被添加到样品上清液中时，在319nm附近发出明显荧光。继续向溶液中加入磺胺二甲嘧啶，探针的荧光强度明显被猝灭。此外，随着磺胺二甲嘧啶浓度的增加，探针在319nm处的荧光强度逐渐降低。因此，可以推测，此荧光探针可以检测蜂蜜中的磺胺二甲嘧啶。通过标准加入法，制备含有不同量磺胺二甲嘧啶的蜂蜜，利用配合物euш-dtpa-bis(adenine)作为荧光探针，检测其中的磺胺二甲嘧啶，实际样品中磺胺二甲嘧啶的检测结果见表1，回收率在87.20％到92.50％之间，相对标准偏差在0.81％-1.21％之间，检测结果令人满意。
表1蜂蜜中磺胺二甲嘧啶的检测(n＝3)
aaverageofthreedeterminations(mean±sd；n＝3).
bn.d:notdetected.
1.一种新型荧光探针，其特征在于，所述的新型荧光探针是稀土氨基多羧酸配合物荧光探针euш-dtpa-bis(adenine)。
2.权利要求1所述的新型荧光探针的制备方法，其特征在于，方法如下：
1)将二乙三胺五乙酸、乙酸酐和吡啶混合均匀，在65℃下搅拌回流24-30h，冷却至室温，减压抽滤，依次用乙酸酐和无水乙醚洗涤，于50℃真空干燥，得二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)；
2)将二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)、腺嘌呤(adenine)和三乙胺加入dmf中，混合均匀，在100℃下搅拌回流24h，冷却至室温，依次用丙酮和无水乙醚洗涤，减压抽滤，于50℃真空干燥，得到配体(dtpa-bis(adenine))；
3)将dtpa-bis(adenine)和eu(no3)3·6h2o分别加去离子水溶解，混合，于60℃搅拌加热2h，冷却，得到euш-dtpa-bis(adenine)。
3.如权利要求2所述的新型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸(dtpa)：乙酸酐：吡啶＝1:2-6:4-10。
4.如权利要求3所述的新型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸(dtpa)：乙酸酐：吡啶＝1:4:6。
5.如权利要求2所述的新型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤2)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)：三乙胺：腺嘌呤＝1:2-6:1-5。
6.如权利要求5所述的新型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤2)中，按摩尔比，二乙三胺五乙酸二酐(dtpaa)：三乙胺：腺嘌呤＝1:3:2。
7.如权利要求2所述的新型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤3)中，按摩尔比，dtpa-bis(adenine)：eu(no3)3·6h2o＝1:1-5。
8.如权利要求7所述的新型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤3)中，按摩尔比，dtpa-bis(adenine)：eu(no3)3·6h2o＝1:1。
9.权利要求1所述的新型荧光探针在检测蜂蜜中磺胺二甲嘧啶的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，方法如下：取蜂蜜，加入权利要求1所述的新型荧光探针，混合均匀，以euш-dtpa-bis(adenine)溶液为实验参比，于280nm下进行荧光检测。
技术总结